黑逍遙散對阿爾茨海默病模型大鼠行為學(xué)及血清腫瘤壞死因子α及白細(xì)胞介素-6和-1β的影響*

楊長生，吳紅彥，李海龍，容倩倩

甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000

黑逍遙散對阿爾茨海默病模型大鼠行為學(xué)及血清腫瘤壞死因子α及白細(xì)胞介素-6和-1β的影響*

楊長生，吳紅彥△，李海龍，容倩倩

甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000

目的：觀察黑逍遙散對β-淀粉樣蛋白（Aβ25-35）所致阿爾茨海默病（Alzheimer disease,AD）模型大鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL-6、IL-1β）表達(dá)的影響，探討黑逍遙散防治AD的作用機(jī)制。方法：海馬區(qū)注射Aβ25-35建立AD大鼠模型，用黑逍遙散、石杉堿甲進(jìn)行對抗治療，第28天取血清，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定AD大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量。結(jié)果：模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著升高，各治療組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均有所降低，黑逍遙散高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著降低。結(jié)論：有效控制AD患者體內(nèi)炎性因子表達(dá)是黑逍遙散的重要作用機(jī)制。

阿爾茨海默病；黑逍遙散；炎性因子

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)又稱老年性癡呆，是一種以認(rèn)知功能下降為特征的漸進(jìn)性腦退化綜合征，是老年期癡呆的主要類型。目前AD的病因尚不明確，近年來有證據(jù)顯示炎性細(xì)胞因子(CK)參與AD的神經(jīng)病理損傷，血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-6、IL-1β)水平升高在AD發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦與肝腎密切相關(guān)，本課題組提出運(yùn)用黑逍遙散治療AD。前期研究證明黑逍遙散能明顯改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[2]，本實(shí)驗(yàn)觀察黑逍遙散對AD模型大鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影響，探討其對AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠100只，體質(zhì)量(200±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號：SYXK(甘)2013-0001058。

1.2 藥物與試劑 黑逍遙散(熟地黃、柴胡、當(dāng)歸等)各組成生藥由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房提供。制成濃度為2.0、1.0、0.5 g/mL的水煎液。放置于無菌容器中，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；石杉堿甲片購自河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號：130402，配制成濃度為0.001 8mg/mL水溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；Aβ25-35購自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，批號：20130309。將Aβ25-35 10μg溶于生理鹽水1μL，使用前37℃孵育1周，使其呈凝聚態(tài)備用；IL-1、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號：20130609。

1.3 儀器 WT-200型大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司提供)、酶標(biāo)儀(美國伯樂公司提供)、微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠提供)。

1.4 方法

1.4.1 模型復(fù)制 模型大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)麻醉，固定于立體定位儀上，確定海馬區(qū)注射點(diǎn)。用牙科鉆在顱骨上鉆孔(直徑1mm)，用微量進(jìn)樣器在兩側(cè)各緩慢注射Aβ25-35溶液1μL，5分鐘內(nèi)注射完，留針5分鐘，牙科泥封住顱骨孔，術(shù)區(qū)滴慶大霉素，縫合皮膚并消毒。假手術(shù)組注射等量生理鹽水，其余同模型組。

1.4.2 分組及給藥 100只大鼠經(jīng)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱重，按隨機(jī)數(shù)字表法選15只大鼠為假手術(shù)組，剩余大鼠造模7天后（除去死亡等不合格大鼠10只）稱重，再按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組、石杉堿甲組、黑逍遙散高、中、低劑量組，每組15只。治療組各組處方量均按照《中藥藥理研究方法學(xué)》人與實(shí)驗(yàn)動物體表面積折算等效劑量比換算，黑逍遙散各組大鼠分別按低劑量組4.25 g/(kg·d)、中劑量8.50 g/(kg·d)、高劑量17.0 g/(kg·d)灌胃給藥；石杉堿甲組每天灌胃石杉堿甲溶液0.018mg/kg；假手術(shù)組、模型組大鼠每天灌胃等容量生理鹽水，連續(xù)治療28天。

1.4.3 大鼠血清采集及測定IL-1β、IL-6及TNF-α治療28天后，將大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，股靜脈取血。靜置2小時(shí)后，4℃、3 000 r/min離心10分鐘，取血清置Eppendor f管中，4℃冰箱保存待測。血清IL-1、IL-6及TNF-α測定均采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)，按試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與石杉堿甲組比較，中低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 黑逍遙散對AD大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響 pg/mL

3 討論

AD臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙和精神異常，其病理特征為腦皮層及海馬區(qū)出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)聚集形成老年斑(seni le plaque，SP)，Tau蛋白異常聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，其中老年斑伴有神經(jīng)元突起損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。研究表明AD患者腦內(nèi)存在強(qiáng)烈的局灶性炎癥反應(yīng)，淀粉樣斑塊附近激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)IL-1β、IL-6及TNF-α等多種炎性因子［3］。小膠質(zhì)細(xì)胞屬于單核巨噬細(xì)胞，正常情況下處于靜息狀態(tài)，Aβ形成后可激活神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放大量炎性因子，誘發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)或者直接損傷神經(jīng)元［4］。同時(shí)炎性因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)又可以促進(jìn)Aβ的前體蛋白(APP)代謝為Aβ，從而加重炎性反應(yīng)，形成惡性循環(huán)［5］。TNF-α是由小膠質(zhì)細(xì)胞受Aβ刺激后產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，通過N-甲基-D-天門冬氨酸對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用［6］，此外TNF-α協(xié)同IL-1強(qiáng)烈誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)IL-6誘導(dǎo)急性期蛋白A-2巨球蛋白的表達(dá)，其中A-2巨球蛋白的多態(tài)性使β-APP的正常酶解受到抑制，導(dǎo)致Aβ生成［7］。IL-1β可以誘發(fā)炎性反應(yīng)，在細(xì)胞及體液免疫中起始動作用，IL-1β過度表達(dá)，可上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-6、TNF-α等炎性因子，誘導(dǎo)APP過度生成；IL-1β還可激活絲裂原活化蛋白激酶P38的信號傳導(dǎo)通路，使Tau蛋白過度磷酸化，促進(jìn)神經(jīng)纖維纏結(jié)［8］。

黑逍遙散出自《醫(yī)略六書·女科指要》，由逍遙散加地黃組成，具有疏肝解郁，滋陰養(yǎng)血，益精填髓的功效。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD病在腦，與肝藏密切相關(guān)，肝主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，又主藏血，調(diào)節(jié)血量，因此腦的供血賴于肝所藏之血及其疏泄功能。AD有記憶力減退，智力下降，情感失控等癥狀，與肝主情志思憶相關(guān)。老年人的病理基礎(chǔ)為腎精虧虛，不能生髓充腦，腦失滋養(yǎng)，漸成癡呆。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黑逍遙散各劑量組均能降低AD模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量，而黑逍遙散高劑量組較石杉堿甲組效果更明顯，說明高劑量黑逍遙散可能通過抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)來防治AD。

［1］楊若松，查芹.阿爾茨海默病血清IL-1、IL-6、TNF-α檢測及臨床意義［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2010，6(22):609-610.

［2］ 吳紅彥，王虎平，王彩霞.黑逍遙散對老年性癡呆的防治作用及其機(jī)制研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，4(22):912-913.

［3］Mrak RE，Gri f f in WS.Potential inf lammatory biomarkers in Alzheimer′s disease［J］.J Alzheimers Dis，2005，8(4):369-375.

［4］Vehamas A，Kawas C，Stewar t W，et al.Immune reactive cel ls in seni le plaques and cognitive in Alzheimers disease［J］.Neurobiol Aging，2003，24(2):321-331.

［5］洪亮，楊文明.Alzheimer病與前炎性因子［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2006，12(10):629-630.

［6］Suk K，Lee J，Hur J，et al.Activation induced cel l death of rat astrocytes［J］.Brain Res，2003，900(2): 342-347.

［7］Giovannini MG，Scal i C，Prosperi C，et al.Beta-amyloidinduced inf lammation and cholinergic hypofunction in the rat brain in vivo:involvement of the p38MAPK pathway［J］.Neurobiol Dis，2002，11(2):257-274.

［8］ 吳傳深，周東風(fēng)，管振全.血漿IL-6水平與阿爾茨海默?。跩］.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2003，10(2):87-89.

Effectsof HeiXiaoYao Pow der on the Behavior and the TNF-α,IL-6 and IL-1βContentsof Alzheim er D isease RatM odels

YANG Changsheng,WU Hongyan△,LIHailong,RONG Qianqian
Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China

Objective:To observe the effectof HeiXiaoYao powder on the ratsw ith A lzheimer disease(AD) induced by Aβ25-35 in the expression of tumornecrosis factor(TNF-α),interleukin-1β(IL-1β)and interleukin-6 (IL-6)in blood serum and to study the functionalmechanism of HeiXiaoYao powder in the prevention and treatment of AD.Methods:A fter the establishment of the AD ratmodels by injecting Aβ25-35 in the hippocampus,the models were treated by HeiXiaoYao powder and huperzine A.On the 28th day,the contents of TNF-α,IL-6 andIL-1βin the serum of themodelswere exam ined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results:The TNF-α,IL-6 and IL-1βcontents of the control group were increased hugely,while in the treatment group the contentsof TNF-α,IL-6 and IL-1βwere all decreased and the HeiXiaoYao powdergroup of high dosewere significantly decreased.Conclusion:The HeiXiaoYao powder can effectively control the expression of the inflammatory factor for AD patients,which isoneof importantmechanismsof HeiXiaoYao powder.

AD;HeiXiaoYao powder;inflammatory factor

R285.6

A

1004-6852(2015)02-0010-03

2014-07-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號81060284)。

楊長生（1983—）女，在讀碩士研究生。研究方向：方劑作用機(jī)理及藥效基礎(chǔ)物質(zhì)研究。

△通訊作者：吳紅彥（1963—）男，教授。研究方向：方劑藥理與新藥開發(fā)。