兩種分子檢測技術(shù)快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的研究

梁瑞霞 谷蘊(yùn)婷 董偉杰 姜廣路 李云絮 馬異峰 尚媛媛 秦世炳 黃海榮 王桂榮

?

·論著·

兩種分子檢測技術(shù)快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的研究

梁瑞霞 谷蘊(yùn)婷 董偉杰 姜廣路 李云絮 馬異峰 尚媛媛 秦世炳 黃海榮 王桂榮

目的 評價(jià)兩種分子檢測技術(shù)——利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(Xpert Mtb/RIF，簡稱“Xpert”)和GenoType?MTBDRplus線性探針檢測技術(shù)(簡稱“MTBDR”)快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 2014年3—6月連續(xù)收集北京胸科醫(yī)院住院的60例疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的膿標(biāo)本，每份標(biāo)本行涂片抗酸桿菌檢查、MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)、Xpert和MTBDR檢測，培養(yǎng)陽性的結(jié)核分枝桿菌行絕對濃度法藥物敏感性試驗(yàn)(DST)檢測。以臨床診斷參考標(biāo)準(zhǔn)(CRS)為金標(biāo)準(zhǔn), 評價(jià)Xpert和MTBDR檢測膿標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度。以DST為金標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)Xpert和MTBDR檢測膿中結(jié)核分枝桿菌耐藥性的敏感度和特異度。結(jié)果 以CRS為金標(biāo)準(zhǔn)，涂片、培養(yǎng)、Xpert和MTBDR的敏感度分別為26.00% (13/50)、48.00% (24/50)、82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，10例非結(jié)核病患者膿標(biāo)本4種技術(shù)檢測結(jié)果均為陰性。以DST為金標(biāo)準(zhǔn)，6例 RFP耐藥樣本中，Xpert檢測RFP耐藥全部陽性，MTBDR檢測RFP耐藥5例陽性；18例RFP敏感樣本中2種技術(shù)檢測結(jié)果均為陰性。7例INH耐藥樣本中，MTBDR檢測INH耐藥6例陽性；17例INH敏感樣本中MTBDR技術(shù)檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)論 Xpert和MTBDR檢測膿標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度高，并且可同時(shí)檢測其耐藥性，可用于早期診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性。

結(jié)核, 骨關(guān)節(jié)/診斷； 抗藥性, 細(xì)菌； 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)； 核酸雜交

結(jié)核病嚴(yán)重危害人類健康，是伴隨人類歷史最長的疾病之一，也是全球由單一致病菌導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的疾病。我國是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病患者數(shù)僅次于印度居世界第二位[1]，我國也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病(multiple drug resistant tuberculosis, MDR-TB) 高負(fù)擔(dān)國家之一。骨關(guān)節(jié)結(jié)核在所有結(jié)核病中占3%～5%，在肺外結(jié)核中占15%[2]?；颊呷糸L期得不到有效治療，會大大增加后遺癥風(fēng)險(xiǎn)，如脊柱彎曲、棘突隆起、背部駝峰畸形、截癱等，這些后遺癥將給患者造成終生身體和精神痛苦。因此，在MDR-TB高負(fù)擔(dān)國家中，快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性，對骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的早期診斷和早期治療，以及對結(jié)核病疫情的控制均具有重要意義。

細(xì)菌學(xué)檢查為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而骨關(guān)節(jié)結(jié)核的標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)陽性率低、時(shí)間長，不能滿足臨床早期、快速診治的需要，所以迫切需要能夠快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和耐藥的新方法和新工具。

近年來涌現(xiàn)出了許多新型分子診斷技術(shù)，利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(Xpert Mtb/RIF，簡稱“Xpert”)和GenoType?MTBDRplus線性探針檢測技術(shù)(簡稱“MTBDR”)是其中使用比較廣泛的技術(shù)。Xpert以全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB基因?yàn)榘谢?，可? h內(nèi)同時(shí)檢測Mtb及其是否對RFP耐藥[3]。2010年WHO推薦Xpert用于肺結(jié)核的診斷[4]。2013年WHO又推薦Xpert用于肺外結(jié)核的診斷[5]。MTBDR運(yùn)用核酸線性探針雜交技術(shù)，檢測異煙肼與利福平耐藥的相關(guān)基因，可在24 h內(nèi)完成耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測[6]。2008年WHO推薦MTBDR應(yīng)用于涂陽肺結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌及其耐藥檢測[7]。

一些Meta分析顯示，分子診斷技術(shù)在肺外結(jié)核病的診斷中具有較高的敏感度和特異度[8-10]。目前，國內(nèi)外還沒有對Xpert和MTBDR在骨關(guān)節(jié)結(jié)核早期診斷中的價(jià)值進(jìn)行評價(jià)。筆者以臨床診斷參考標(biāo)準(zhǔn)(CRS)和絕對濃度法藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)為金標(biāo)準(zhǔn), 評價(jià)Xpert和MTBDR快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、 研究對象及其臨床一般情況介紹

選取2014年3—6月北京胸科醫(yī)院收治的疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者60例。根據(jù)CRS標(biāo)準(zhǔn)[11]，60例患者分為4組：確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性)24例；臨床診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性、活檢或手術(shù)標(biāo)本病理檢查顯示為干酪樣肉芽腫，并且對抗結(jié)核藥物治療反應(yīng)良好)22例；疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(沒有細(xì)菌學(xué)及病理學(xué)證據(jù)，但是對抗結(jié)核藥物治療反應(yīng)良好，影像學(xué)征象符合骨關(guān)節(jié)結(jié)核)4例；非結(jié)核病患者(沒有細(xì)菌學(xué)等其他結(jié)核檢測方面的證據(jù)，并且抗結(jié)核藥物治療無效)10例。60例患者的中位年齡為33歲(16～82歲)；男28例(占46.67%)，女32例(占53.33%)；脊柱病變累及1個(gè)椎體者4例(占6.67%)、累及2個(gè)椎體者27例(占45.00%)，累及3個(gè)椎體者2例(占3.33%)，累及4個(gè)椎體者3例(占5.00%)，患者詳細(xì)信息見表1。所有患者均接受病灶清除手術(shù)，術(shù)中所取病灶中的膿液標(biāo)本至少5 ml。

二、 涂片查抗酸桿菌

膿液涂片抗酸桿菌檢查按照文獻(xiàn)[12]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。

三、 分枝桿菌培養(yǎng)

取2 ml 膿標(biāo)本用于培養(yǎng)，嚴(yán)格按照Bactec MGIT960系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為42 d。儀器報(bào)告陽性后，取培養(yǎng)液進(jìn)行涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽性；若未見抗酸桿菌則為陰性。

四、 Xpert檢測

取1 ml 膿標(biāo)本置于有螺旋蓋的無菌管中，然后加入2 ml 標(biāo)本處理液，旋緊管蓋，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10 s，室溫靜置10 min，在渦旋振蕩器上再次渦旋振蕩10 s，室溫靜置5 min，使膿標(biāo)本充分液化。吸取2 ml 液化的膿標(biāo)本至Xpert反應(yīng)試劑盒，然后將反應(yīng)試劑盒放置到檢測模塊，儀器開始進(jìn)行自動(dòng)化檢測。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測系統(tǒng)窗口下可直接觀察測試結(jié)果。

表1 60列研究對象的一般情況

五、 MTBDR檢測

取1 ml 膿標(biāo)本提取DNA，PCR擴(kuò)增和雜交嚴(yán)格按照MTBDR試劑盒說明書進(jìn)行。

六、 絕對濃度法藥敏試驗(yàn)

按照中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會制定的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[13]相關(guān)要求進(jìn)行。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以CRS為金標(biāo)準(zhǔn), 計(jì)算Xpert和MTBDR檢測膿標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度。以DST為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Xpert和MTBDR檢測膿中結(jié)核分枝桿菌耐藥性的敏感度和特異度。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%。

結(jié) 果

一、 Xpert和MTBDR的敏感度和特異度

以CRS為金標(biāo)準(zhǔn)，涂片、培養(yǎng)、Xpert和MTBDR的敏感度分別為26.00% (13/50)、48.00% (24/50)、82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，特異度都是100.00% (10/10)(表2)。Xpert和MTBDR對確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者檢測的敏感度分別為100.00% (24/24)和87.50% (21/24)，對臨床診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者檢測的敏感度分別為72.73% (16/22)和63.64% (14/22)；對4例疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者Xpert和MTBDR均檢測出1例(表3)。

表2 以CRS為金標(biāo)準(zhǔn)，膿液標(biāo)本不同檢測方法診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度和特異度

注 表中括號內(nèi)數(shù)值分別為：敏感度分子為“真陽性例數(shù)”，分母為“真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)”；特異度分子為“真陰性例數(shù)”，分母為“真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)”

二、 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

絕對濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，6株結(jié)核分枝桿菌對RFP耐藥，7株結(jié)核分枝桿菌對INH耐藥；其中6株為耐多藥結(jié)核分枝桿菌，1株為INH單耐菌株。以DST為金標(biāo)準(zhǔn)，6例RFP耐藥樣本中，Xpert檢測全部陽性，MTBDR檢測5例陽性；18例RFP敏感樣本中2種技術(shù)檢測結(jié)果均為陰性。7例INH耐藥樣本中，MTBDR檢測6例陽性；17例INH敏感樣本中MTBDR檢測結(jié)果均為陰性。

表3 Xpert和MTBDR診斷不同CRS類型骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度

注 表中括號內(nèi)數(shù)值分子為“真陽性例數(shù)”，分母為“真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)”

討 論

本研究中以CRS為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert和MTBDR檢測膿標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的敏感度分別為82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，特異度均為100%。Vadwai等[14]的研究結(jié)果顯示，以CRS為金標(biāo)準(zhǔn)Xpert診斷肺外結(jié)核總的敏感度為80.57%(228/283)，特異度為99.60%，與本研究結(jié)果一致。

以CRS為金標(biāo)準(zhǔn)，在涂片陰性的標(biāo)本中Xpert和MTBDR的陽性率分別為75.68% (28/37)和62.16% (23/37)；在培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中Xpert和MTBDR的陽性率分別為65.38% (17/26)和57.69% (15/26)。與分子診斷技術(shù)相比較，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率(48.00%)較低，原因可能為：(1)本研究納入的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者在采樣前都開展了一段時(shí)間的抗結(jié)核藥物治療，而抗結(jié)核藥物治療會影響結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)陽性率，但對分子診斷技術(shù)影響較小。(2)膿標(biāo)本較黏稠，結(jié)核分枝桿菌分布不均勻，可導(dǎo)致取樣差異。 (3)培養(yǎng)過程中的標(biāo)本去污染步驟可能會損失一些活細(xì)菌。

分子診斷技術(shù)最顯著的特點(diǎn)是用時(shí)短，如Xpert可在2 h內(nèi)完成同時(shí)檢測Mtb和RFP耐藥，MTBDR可在24 h內(nèi)完成耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測，與傳統(tǒng)培養(yǎng)比較時(shí)間縮短了幾周。骨關(guān)節(jié)結(jié)核由于缺乏細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)，以往主要根據(jù)影像學(xué)、病理學(xué)和臨床癥狀進(jìn)行臨床診斷。骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷及其藥物敏感度的獲得可以指導(dǎo)臨床對患者進(jìn)行早期、合理的治療[2]。

本研究中Xpert較MTBDR的敏感度稍高，可能是由于Xpert的操作步驟絕大部分都是自動(dòng)化的，而MTBDR需要很多手動(dòng)操作步驟，如提取DNA和雜交等，可能會造成敏感度降低[15]。Xpert僅檢測RFP的耐藥情況，在RFP單耐藥高發(fā)的地區(qū)，如中國RFP單耐藥率高達(dá)12.83%[16]，可能會高估MDR-TB。在這種情況下MTBDR則比較有優(yōu)勢，因?yàn)镸TBDR同時(shí)檢測RFP和INH的耐藥情況。但MTBDR的缺點(diǎn)為需要大量的手工操作，結(jié)果的判讀對技術(shù)人員要求較高，而且需要生物安全級別較高的實(shí)驗(yàn)室[17]。

Xpert和MTBDR檢測膿標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度均較高，而且檢測時(shí)間短，可同時(shí)檢測結(jié)核分枝桿菌及其耐藥。但目前國家食品藥品監(jiān)督管理總局僅批準(zhǔn)這兩項(xiàng)技術(shù)用于涂陽標(biāo)本的檢測，由于骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中菌量較少，膿液抗酸染色涂片陽性率僅為10%～30%[18-19]，若Xpert和MTBDR僅用于涂陽標(biāo)本的檢測，則臨床意義并不顯著；若能應(yīng)用于臨床診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本的檢測，則能夠促進(jìn)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷和早期治療，不僅可控制病情進(jìn)展、縮短治療療程，還可以減輕患者經(jīng)濟(jì)壓力、減少或避免肢體功能障礙。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2014. Geneva： World Health Organization, 2014.

[2] Pigrau-Serrallach C, Rodriguez-Pardo D. Bone and joint tuberculosis. Eur Spine J, 2013，22 Suppl 4:556-566.

[3] Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med, 2010, 363(11):1005-1015.

[4] World Health Organization. WHO endorses new rapid tuberculosis test. Geneva：World Health Organization, 2010.

[5] World Health Organization. Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance: Xpert MTB/RIF system for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. Policy update. Geneva：World Health Organization, 2013.

[6] Barnard M, Albert H, Coetzee G, et al. Rapid molecular screening for multidrug-resistant tuberculosis in a highvolume public health laboratory in South Africa. Am J Respir Crit Care Med, 2008, 177(7):787-792.

[7] World Health Organization. Molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB). Geneva：World Health Organization, 2008.

[8] Daley P,Thomas S,Pai M. Nucleic acid amplification tests for the diagnosis of tuberculous lymphadenitis: a systematic review. Int J Tuberc Lung Dis, 2007, 11(11):1166-1176.

[9] Maynard-Smith L, Larke N, Peters J, et al. Diagnostic accuracy of the Xpert MTB/RIF assay for extrapulmonary and pulmonary tuberculosis when testing non-respiratory samples: a systematic review. BMC Infect Dis, 2014, 14:709.

[10] Denkinger CM, Schumacher SG, Boehme CC, et al. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Eur Respir J, 2014, 44(2):435-446.

[11] Jia H, Pan L, Qin S, et al. Evaluation of interferon-gamma release assay in the diagnosis of osteoarticular tuberculosis. Diagn Microbiol Infect Dis, 2013, 76(3):309-313.

[12] 趙雁林，姜廣路．痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊．北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社, 2009．

[13] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會．結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程．北京：中國教育文化出版社，2006．

[14] Vadwai V,Boehme C,Nabeta P,et al. Xpert MTB/RIF: a new pillar in diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol, 2011, 49(7):2540-2545.

[15] Steingart KR, Schiller I, Horne DJ, et al. Xpert?MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults. Cochrane Database Syst Rev，2014，1:CD009593.

[16] Zhao Y, Xu S, Wang L, et al. National survey of drug-resistant tuberculosis in China. N Engl J Med, 2012, 366(23):2161-2170.

[17] Nahid P, Kim PS, Evans CA, et al. Clinical research and development of tuberculosis diagnostics: moving from silos to synergy. J Infect Dis, 2012, 205 Suppl 2:S159-168.

[18] 葛建忠，王自立，秦世炳，等. 脊柱結(jié)核膿液中結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)及菌種鑒定.寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 26(4):251-261.

[19] 莊偉，石仕元，莊汝杰. 骨與關(guān)節(jié)結(jié)核患者病灶感染病原菌檢測結(jié)果分析. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2015, 25(2):401-403.

(本文編輯：范永德)

Study on two molecular techniques for rapid diagnosis of bone and joint tuberculous and detection of rifampin and/or isoniazid resistance

LIANG Rui-xia*, GU Yun-ting, DONG Wei-jie, LI Yun-xu, MA Yi-feng, SHANG Yuan-yuan, QIN Shi-bing, HUANG Hai-rong, WANG Gui-rong.

*Department of Tuberculosis, Henan Provincial Chest Hospital, Zhengzhou 450008, China

WANG Gui-rong, Email:276761010@qq.com

Objective To determine the performance of a real-time polymerase-chain reaction (PCR) assay Xpert Mtb/RIF (Xpert) and a molecular line probe assay GenoType?MTBDRplus (MTBDR) for rapid diagnosis of bone and joint tuberculosis (BJTB) and detection of rifampin (RIF) and/or isoniazid (INH) resistance. Methods Sixty pus specimens were obtained from suspected BJTB between March and June 2014 from the Beijing Chest Hospital. Smear, culture, Xpert and MTBDR were performed for each specimen, and MGIT960 based drug susceptibility testing (DST) was conducted for all the recovered isolates. The sensitivity and specificity of Xpert and MTBDR in detectingMycobacteriumtuberculosiswere assessed in comparison to composite reference standard (CRS). The sensitivity and specificity of these two techniques for detection of RFP and/or INH resistance were assessed in comparison to DST. Results By CRS as a gold standard，the sensitivities of smear, culture, Xpert, and MTBDR were 26.00% (13/50), 48.00% (24/50), 82.00% (41/50), and 72.00% (36/50) respectively. All of the results were negative of these 4 techniques in 10 non-tuberculosis patients. By DST as a gold standard， 6 RFP-resistant isolates and 7 INH-resistant isolates were identified. Xpert was 100% concordant with MGIT DST with regard to the detection of RFP resistance. While MTBDR detected 5 RFP-resistant isolates and 6 INH-resistant isolates, and gave negative results for all the RFP-susceptible and INH- susceptible isolates. Conclusion With high sensitivity and specificity, and the ability to detect drug resistance simultaneously, both Xpert and MTBDR are feasible as diagnostic tools for BJTB in clinical practice.

Tuberculosis, osteoarticular/diagnosis； Drug resistance, bacterial； Real-time polymerase chain reaction； Nucleic acid hybridization

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.11.009

北京市自然科學(xué)基金(7132049)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2014-3-084)；重大傳染病防治協(xié)同創(chuàng)新中心(PXM2015-014226-000058)

450008 鄭州，河南省胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科(梁瑞霞)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 國家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室 北京市耐藥結(jié)核病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(谷蘊(yùn)婷、姜廣路、李云絮、馬異峰、尚媛媛、黃海榮、王桂榮)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院骨科 北京骨關(guān)節(jié)結(jié)核診療中心(董偉杰、秦世炳)

王桂榮，Email:276761010@qq.com

2015-06-24)