大鼠全基因組微衛(wèi)星分布特征研究

涂飛云，劉曉華，杜聯(lián)明，嚴(yán)超超，黃曉鳳*

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013;2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064)

微衛(wèi)星又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSRs)，是指1～6 bp的核苷酸為基本重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列，其長(zhǎng)度大多在100 bp以內(nèi)［1］，廣泛存在于真核生物和一些原核生物的基因組中［2］。微衛(wèi)星因突變速率快、多態(tài)性高等特性，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物個(gè)體識(shí)別［3-5］、群體遺傳研究［6-7］、基因定位［8］、系統(tǒng)發(fā)育［9］及遺傳疾病研究［10］。

隨著基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展，更多物種的全基因組被測(cè)定和公布，有關(guān)動(dòng)物基因組微衛(wèi)星報(bào)道也越來越多。到目前為止，有關(guān)哺乳動(dòng)物全基因的序列公布有43種(http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)，但哺乳動(dòng)物全基因微衛(wèi)星分布規(guī)律研究報(bào)道文獻(xiàn)僅見4篇［11-14］。大鼠是繼人類、小鼠之后第三個(gè)被測(cè)定全基因組的哺乳動(dòng)物，是極好的模式生物，作為實(shí)驗(yàn)材料廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)研究中。Tóth等［15］利用嚙齒類81個(gè)物種的基因序列(其中大鼠基因序列貢獻(xiàn)率是18.25%)進(jìn)行微衛(wèi)星序列分析。迄今為止，大鼠全基因組微衛(wèi)星分布狀況未見報(bào)道。本研究通過生物信息學(xué)方法搜索大鼠全基因組微衛(wèi)星，并對(duì)微衛(wèi)星數(shù)量、分布、頻率進(jìn)行分析，為進(jìn)一步開發(fā)大鼠微衛(wèi)星的標(biāo)記提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 大鼠基因組序列

大鼠全基因組序列是從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的版本名為Rnor_6.0(2014年8月發(fā)布)的基因組序列(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Rattus_norvegicus)。該基因組包括 20 個(gè)常染色體、2 個(gè)性染色體(X，Y)和未定位到染色體上的序列(其中已經(jīng)定位到染色體上的序列占全基因組的99%)，基因組總長(zhǎng)度約2.8 Gb，所有序列都以FASTA格式保存。

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 微衛(wèi)星序列統(tǒng)計(jì)術(shù)語(yǔ)的定義 微衛(wèi)星序列統(tǒng)計(jì)術(shù)語(yǔ)的定義參照戚文華等［12-13］的研究。

1.2.2 微衛(wèi)星搜索及統(tǒng)計(jì)分析 MSDB是用Perl語(yǔ)言編開發(fā)的界面友好的分析軟件，能快速識(shí)別和搜索全基因組微衛(wèi)星。與其他微衛(wèi)星搜索軟件如TRF、SSRTT、MSATCOMMANDER等軟件相比，MSDB具有運(yùn)算速度快，操作簡(jiǎn)便，易于分析等特點(diǎn)［16］。本研究利用微衛(wèi)星搜索軟件MSDBv2.4.3［16］對(duì)不同染色體基因序列進(jìn)行微衛(wèi)星搜索及統(tǒng)計(jì)。本研究的搜索標(biāo)準(zhǔn)采用軟件默認(rèn)設(shè)置，模式設(shè)置為Perfect Search，最小重復(fù)(Minimum repeats)設(shè)置為單堿基12次重復(fù)以上、二堿基7次重復(fù)以上、三堿基5次以上、四堿基、五堿基和六堿基4次以上［16］。利用SPSS軟件對(duì)大鼠染色體序列長(zhǎng)度與微衛(wèi)星數(shù)量分析。參照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則和統(tǒng)計(jì)拷貝數(shù)起始?jí)A基順序的排列差異，利用Perl語(yǔ)言腳本將同類重復(fù)兼并為一種重復(fù)拷貝類型代表，如三堿基AAC，可以與之兼并的有ACA、CAA、TTG、TGT和GTT。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠微衛(wèi)星在全基因組及染色體分布特征

大鼠基因組全長(zhǎng)2 860 318 831 bp，微衛(wèi)星總數(shù)1 483 525個(gè)，其總長(zhǎng)度是40 198 048 bp，占全基因組的1.41%(表1)。大鼠各染色體中，1號(hào)染色體的微衛(wèi)星數(shù)量最多，有144 384個(gè)，占微衛(wèi)星總數(shù)的9.7%，出現(xiàn)的頻率是511個(gè)/Mb，其長(zhǎng)度合計(jì)3 941 664 bp，其次是2號(hào)、4號(hào)、3號(hào)染色體，分別占微衛(wèi)星總數(shù)的8.5%、6.3%、6.2%(表1)，20號(hào)染色體分布的微衛(wèi)星數(shù)量最低，僅占總數(shù)的2.3%。從各染色體微衛(wèi)星分布頻率看，12號(hào)染色體最高，其次是10號(hào)，最低X性染色體。通過線性回歸分析表明，大鼠染色體DNA序列越長(zhǎng)，所含微衛(wèi)星數(shù)量越多(r=0.978，P＜0.000 1)。大鼠性染色體微衛(wèi)星數(shù)量存在顯著差異，X染色體微衛(wèi)星數(shù)量有62 578，占總數(shù)的4.2%，而Y染色體微衛(wèi)星數(shù)量?jī)H有35 067，僅占2.4%(表1)。

2.2 不同重復(fù)類型微衛(wèi)星分布特點(diǎn)

從表1看，整個(gè)大鼠全基因組中不同重復(fù)類型微衛(wèi)星占全基因組微衛(wèi)星比例表現(xiàn)為二堿基(46.9%)＞單堿基(22.6%)＞四堿基(17.4%)＞三堿基(8.4%)＞五堿基(2.4%)＞六堿基(2.0%)。

不同重復(fù)類型微衛(wèi)星在染色體分布數(shù)量上，6種重復(fù)類型(單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基)微衛(wèi)星總數(shù)在1號(hào)染色體分布最多，其次是2號(hào)染色體。不同重復(fù)類型微衛(wèi)星分布數(shù)量最少的染色體并不一致(表1)。

從不同重復(fù)類型微衛(wèi)星重復(fù)拷貝類別數(shù)量比例看，單堿基以A微衛(wèi)星數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，分別占單堿基微衛(wèi)星總數(shù)的46.6%。二堿基微衛(wèi)星類型搜索到4種，有AC、AG、AT、CG，整個(gè)大鼠全基因組序列以AC類型最多，占二堿基微衛(wèi)星總數(shù)的64.6%，其次是AG，占24.9%，CG最少，僅占0.6%。共兼并及統(tǒng)計(jì)三堿基微衛(wèi)星重復(fù)類型 10 種，包括 AAC、AAG、AAT、ACC、ACG、ACT、AGC、AGG、AGT、CCG，其中AGG類型數(shù)量最多，占三堿基微衛(wèi)星總數(shù)的 21.2%，依次是 AAC、AAT，占20.8%、13.5%;CCG 類型最少，其次是AGC，分別占0.9%和3.4%。四堿基微衛(wèi)星類型以AAAC類型最多，占四堿基微衛(wèi)星總數(shù)的14.9%，其次是AGAT和AAAG，占11.9%和11.1%。五堿基微衛(wèi)星以AAACA占優(yōu)勢(shì)，占39.8%。六堿基以ACAGAG占優(yōu)勢(shì)，占18.9%。

表1 大鼠不同染色體上不同類型微衛(wèi)星數(shù)量的分布情況Tab.1 Distribution of SSRs in each chromosome of rat

3 討論

本研究首次利用生物信息學(xué)方法搜索、統(tǒng)計(jì)、分析大鼠全基因組微衛(wèi)星數(shù)量、分布及頻率。大鼠全基因組共搜索到微衛(wèi)星總數(shù)1 483 525，其序列長(zhǎng)度占全基因組的1.41%。本研究表明微衛(wèi)星數(shù)量與其所在染色體DNA序列長(zhǎng)度具有相關(guān)性(r=0.978，P＜0.000 1)，反映了SSRs在染色體上的分布具有隨機(jī)性，與先前其他研究結(jié)果一致［13、17］，進(jìn)一步支持Hancock［18］提出的微衛(wèi)星數(shù)量與染色體大小相關(guān)的假說。

不同物種基因組優(yōu)勢(shì)類型微衛(wèi)星有所不同。秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans［18］、肩突硬蜱Ixodes scapularis［19］、紅原雞 Gallus gallus［17］、四川山鷓鴣 Arborophila rufipectus［20］、牛 Bos taurus［12］、綿羊Ovis aries［12］、豬 Sus scrofa［13］等全基因組均以單堿基占優(yōu)勢(shì);二斑葉螨 Tetranychus urticae［19］全基因組以三堿基占優(yōu)勢(shì);蚊子Anopheles gambiae［21］以六堿基占優(yōu)勢(shì)。本研究大鼠基因組微衛(wèi)星以二堿基微衛(wèi)星占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，與果蠅 Drosophila melanogaster［22］、家蠶 Bombyx mori［23］、蜜蜂 Apis mellifera［24］、河豚 Fugu rubripes［25］、全基因組及中國(guó)對(duì)蝦 Fenneropenaeus chinensis［26］、嚙齒類［19］部分基因組中二堿基微衛(wèi)星占主導(dǎo)結(jié)果一致。

本研究中大鼠全基因組單堿基微衛(wèi)星以A占優(yōu)勢(shì)，與人類、紅原雞、豬等物種研究結(jié)果一致［15］，其余不同重復(fù)類型微衛(wèi)星在不同類群中具有差異。大鼠二堿基微衛(wèi)星以AC最為豐富，與人類、果蠅、蚊子、豬、牛和綿羊的結(jié)果一致，不同于中國(guó)對(duì)蝦、蜜蜂、紅原雞二堿基以AT最豐富。三堿基、四堿基、五堿基、六堿基分別以 AGG、AAAC、AAACA、ACAGAG占優(yōu)勢(shì)，而其他物種如豬、牛、羊并非以此四種(AGG、AAAC、AAACA、ACAGAG)類型微衛(wèi)星占優(yōu)勢(shì)，可能是不同物種優(yōu)勢(shì)類型微衛(wèi)星有所不同。

致謝:特別感謝四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李午佼博士對(duì)研究的幫助。

［1］Li Y C，Korol A B，F(xiàn)ahima T，et al.Microsatellites:genomic distribution，putative functions and mutational mechanisms:a review［J］.Molecular Ecology，2002，11(12):2453-2465.

［2］Tautz D.Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers［J］.Nucleic Acids Research，1989，17(16):6463-6471.

［3］Amavet P，Rosso E，Markarian R，et al.Microsatellite DNA markers applied to detection of multiple paternity in Caiman latirostris in Santa Fe，Argentina［J］.Journal of Experimental Zoology，2008，309A:637-642.

［4］王靜，劉丑生，張利平，等.微衛(wèi)星在種公牛個(gè)體識(shí)別與親緣鑒定方面的應(yīng)用［J］.遺傳，2009，31(3):285-289.

［5］管昊，林清賢，周曉平，等.白鷺脫落羽毛的微衛(wèi)星個(gè)體識(shí)別研究［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，52(5):710-717.

［6］Hu Y B，Guo Y，Qi D W，et al.Genetic structuring and recent demographic history of red pandas(Ailurus fulgens)inferred from microsatellite and mitochondrial DNA［J］.Molecular Ecology，2011，20:2662-2675.

［7］Wu S J，Luo J，Li Q Q，et al.Ecological genetics of Chinese rhesus macaque in response to mountain building:all things are not equal［J］.Plos One，2013，8(2):55315.

［8］徐寧迎，Thomsen H，Reinsch N，等.利用微衛(wèi)星進(jìn)行奶牛數(shù)量形狀基因定位的研究［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2000，27(9):772-776.

［9］Estoup A，Lionel G.Microsatellite variation in honey bee(Apis mellifera L.)populations:hierarchical genetic structure and test of the infinite allege and stepwise mutation models［J］.Genetics，1995，140(2):679-695.

［10］陳翠敏，府偉靈，張曉莉.應(yīng)用微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)對(duì)X連鎖型視網(wǎng)膜色素變性疾病進(jìn)行遺傳連鎖分析的研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2006，35(6):501-502.

［11］童曉玲，代方銀，李斌，等.小鼠基因組中的微衛(wèi)星重復(fù)序列的數(shù)量、分布和密度［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，52(1):138-152.

［12］戚文華，蔣雪梅，肖國(guó)生，等.牛和綿羊全基因組微衛(wèi)星序列的搜索及其生物信息學(xué)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(11):1724-1733.

［13］戚文華，蔣雪梅，肖國(guó)生，等.豬全基因組中微衛(wèi)星分布規(guī)律［J］.畜牧與獸醫(yī)，2014，46(8):9-12.

［14］李午佼，李玉芝，杜聯(lián)明，等.大熊貓和北極熊基因組微衛(wèi)星分布特征比較分析［J］.四川動(dòng)物，2014，33(6):874-878.

［15］Tóth G，Gáspári Z，Jurka J.Microsatellites in different eukaryotic genomes:survey and analysis［J］.Genome Research，2000，10:967-981.

［16］Du L M，Li Y Z，Zhang X Y，et al.MSDB:a user-friendly program for reporting distribution and building databases of microsatellites from genome sequences［J］.Journal of Heredity，2013，104(1):154-157.

［17］黃杰，杜聯(lián)明，李玉芝，等.紅原雞全基因組中微衛(wèi)星分布規(guī)律研究［J］.四川動(dòng)物，2012，31(3):358-363.

［18］Hancock J M.Simple sequences and the expanding genome［J］.Bioessays，1996，18(5):421-425.

［19］汪自立，黃杰，杜聯(lián)明，等.二斑葉螨和肩突硬蜱基因組微衛(wèi)星分布規(guī)律研究［J］.四川動(dòng)物，2013，32(4):481-486.

［20］黃杰，周瑜，劉與之，等.基于454 GS FLX高通量測(cè)序的四川山鷓鴣基因組微衛(wèi)星特征分析［J］.四川動(dòng)物，2015，34(1):8-14.

［21］余泉友，李斌，李關(guān)榮，等.蚊子全基因組中微衛(wèi)星的豐度及其分布［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005，32(5):435-441.

［22］Schug M D，Wetterstrand K A，Gaudette M S，et al.The distribution and frequency of microsatellite loci in Drosophila melanogaster［J］.Molecular Ecology，1998，7(1):57-70.

［23］Li B，Xia Q Y，Lu C，et al.Analysis on frequency and density of microsatellites in coding sequences of several eukaryotic genomes［J］.Genomics，Proteomics and Bioinformatics，2004，2(1):24-31.

［24］魏朝明，孔光耀，廉振民，等.蜜蜂全基因組中微衛(wèi)星的豐度及其分布［J］.昆蟲知識(shí)，2007，44(4):501-504.

［25］崔建洲，申雪艷，楊官品，等.紅鰭東方鲀基因組微衛(wèi)星特征分析［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，36(2):249-254.

［26］高煥，劉萍，孟憲紅，等.中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)基因組微衛(wèi)星特征分析［J］.海洋與湖沼，2004，35(5):424-431.