茼蒿粗提物對西瓜枯萎病菌的抑菌活性

劉 瓊，張新龍，黃 琦，萬春鵬，范淑英

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

西瓜枯萎病(Watermelon Fusarium wilt)又名蔓割病、萎凋病、萎蔫病等，是一種土傳和種傳真菌性病害，它是由尖孢鐮刀菌西瓜?；鸵?，該病害在世界各地均有發(fā)生，嚴(yán)重影響了西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)［1-3］。近年來對西瓜枯萎病的防治，主要以農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)藥劑防治為主。對種子進(jìn)行滅菌處理、選用抗病品種，通過嫁接［4］、輪作倒茬等方法來降低西瓜枯萎病的發(fā)病率［5］。雖然起到一定的防治效果，但是消耗了大量的勞動力和財(cái)力，并且農(nóng)藥長期大量使用，容易使病原菌對其產(chǎn)生抗藥性，降低防治效果，同時(shí)也對環(huán)境造成污染。因此，如何科學(xué)有效地防治西瓜枯萎病的發(fā)生，減輕其危害，越來越受到廣大西瓜生產(chǎn)者及科研工作者的重視，同時(shí)它是確保瓜農(nóng)增產(chǎn)增收的關(guān)鍵。為此，尋找廣譜、高效、低毒、安全的殺菌劑，特別是從天然植物中研究和篩選具有抑菌效果，對人體健康和生態(tài)環(huán)境無害的天然植物源殺菌劑具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

茼蒿(Chrysanthemun Coronarium L.)屬菊科兩年生草本植物，其莖、葉可以食用，而且含有的生物堿可以降血壓、抗腫瘤、強(qiáng)心等作用，具有很好的藥用價(jià)值［6］。2000年，在茼蒿花序的精油抗菌活性物質(zhì)抑制植物病原菌實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)茼蒿中的活性物質(zhì)可以抑制12種植物病原菌，抗菌譜廣［7］。與茼蒿同科植物萬壽菊中，也發(fā)現(xiàn)其莖葉中有抑制西瓜枯萎病生長的作用。2003年，陳紅兵等［8-9］發(fā)現(xiàn)萬壽菊根提取物能夠抑制西瓜枯萎病菌絲生長，同時(shí)它可以使西瓜中的SOD酶與POD酶活性增強(qiáng)，從而減輕病菌毒素對西瓜的侵害。2011年，范淑英等［10］發(fā)現(xiàn)在種植過茼蒿的土壤上種植西瓜，其西瓜枯萎病死亡率只有3.3%，而在未種植過茼蒿的土壤上種植西瓜，則西瓜枯萎病的死亡率高達(dá)80%。由此可見，茼蒿中可能含有一種或者幾種活性物質(zhì)，能夠有效的抑制西瓜枯萎病的發(fā)生。本研究是以西瓜枯萎病即尖孢鐮刀菌西瓜?；蜑橹甘揪?，對茼蒿粗提物的抑菌活性進(jìn)行研究，并對其粗提物的最佳萃取劑進(jìn)行篩選，以其為生產(chǎn)上有效、安全、環(huán)保防止西瓜枯萎病提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茼蒿采用江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜基地種植，經(jīng)風(fēng)干后的茼蒿干品;化學(xué)試劑:95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿，均為分析純;PDA培養(yǎng)基;尖孢鐮刀菌西瓜?；图次鞴峡菸【?Fusarium oxysporum f.sp.niveum)由浙江大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:瑞士BUCHI公司;LX-300冷卻水循環(huán)機(jī):北京長流科學(xué)儀器公司;KQ-500B超聲波清洗機(jī):昆山超聲儀器有限公司;HS-1300U超凈工作臺:蘇靜集團(tuán)蘇州安泰公司;MIR-254恒溫培養(yǎng)箱:日本三洋公司;YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;5804R冷凍離心機(jī):德國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化和菌懸液的配制 在無菌條件下，將西瓜枯萎病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，于28℃的培養(yǎng)箱活化，3 d后，用無菌水將菌洗到瓶中，并過濾，制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板制成濃度為106～108cfu/mL。剩余活化菌種的平板備用。

1.2.2 粗提物中活性物質(zhì)最佳萃取劑 分別稱取20 g烘干的茼蒿4份，用200 mL的95%乙醇超聲提取2 h，用濾紙過濾后，再用100 mL乙醇超聲波提取1 h，蒸發(fā)濃縮，將其中3份加水稀釋至30 mL，并用相同體積的的乙酸乙酯、正丁醇和氯仿分別萃取，有機(jī)樣分別蒸發(fā)濃縮到膏狀，用乙酸乙酯溶解至4 mL，濃度為5 g/mL，放入冰箱備用。同上方法，以多菌靈作為對照，測定其抑菌率。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC) 將干茼蒿粉碎過40目篩，稱取100 g用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇超聲提取兩次，每次2 h，粗提液減壓濃縮至膏后稱量，用乙酸乙酯配制成1 g/mL的溶液。用二倍稀釋法將粗提液稀釋1 000 mg/mL至1.95 mg/mL的梯度溶液，以1∶9的比例與培養(yǎng)基混合成含藥平板，多點(diǎn)涂布，每次加入2 μL的菌液，以不含菌液為空白對照和菌液對照，每個(gè)處理重復(fù)3次將其放入28℃培養(yǎng)箱中2 d，觀察結(jié)果以無菌生長的培養(yǎng)皿的含藥濃度為最小抑菌濃度(MIC)，將無菌生長的平皿繼續(xù)培養(yǎng)7 d后觀察，以無菌生長的含藥濃度為最小殺菌濃度(MFC)［11］。

1.2.4 茼蒿提取物對西瓜枯萎病抑菌活性的室內(nèi)毒力測定 利用生長速率法測定毒力方程，將1 g/mL的粗提液稀釋成250，50，10，2，0.4 mg/mL的不同濃度溶液，在無菌條件下，與培養(yǎng)基混合制成含藥培養(yǎng)基，用5 mm的打孔器取活化好的菌種邊緣菌塊，接種至含藥培養(yǎng)基中間，以不含藥培養(yǎng)基和溶劑培養(yǎng)基為對照［12］，每個(gè)處理重復(fù)3次放入28℃培養(yǎng)箱中7 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.5 茼蒿粗提物對西瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的測定 將茼蒿粗提物制成濃度分別為MIC、EC50和MFC，通過血球計(jì)數(shù)板使菌液濃度為106～108cfu/mL，在每個(gè)凹玻片上加入72 μL的菌液，分別加入0、MIC、EC50和MFC的粗提物濃度8 μL，每個(gè)處理重復(fù)3次，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h，通過顯微鏡觀察100～200個(gè)孢子萌發(fā)的結(jié)果。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用DPS7.05軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出毒力方程、相關(guān)系數(shù)、EC50和置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 茼蒿粗提物中活性物質(zhì)的最佳萃取劑的篩選

通過乙酸乙酯、正丁醇、和氯仿分別萃取后，見圖1與2，與粗提液相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正丁醇萃取后的溶液抑菌效果最好，與農(nóng)藥多菌靈達(dá)到同樣的效果，抑菌率都達(dá)到90%以上，乙酸乙酯的抑菌率是77.9%，效果次之，氯仿的效果不明顯，只有68.2%，因此，正丁醇萃取后的茼蒿溶液可以進(jìn)行下一步茼蒿活性成分分離純化。

2.2 茼蒿粗提物最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC)的確定

本實(shí)驗(yàn)通過二倍稀釋法測定粗提物抑制西瓜枯萎病的MIC和MFC，結(jié)果顯示MIC 為125 mg/mL，MFC 為500 mg/mL，可為田間試驗(yàn)粗提物對西瓜發(fā)苗期、生長期和坐果期的抑菌研究，以及在電導(dǎo)率、糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供一定的理論依據(jù)。

圖2 不同溶劑萃取粗提物后的抑菌效果Fig.2 Different crude extracts from solvent extraction after bacteriostatic effect

圖3 不同濃度粗提物對西瓜枯萎病菌絲生長的情況Fig.3 Different concentration of crude extract of watermelon fusarium filament growth

2.3 茼蒿粗提物對西瓜枯萎病菌的室內(nèi)毒力測定

不同濃度的粗提物對西瓜枯萎病菌的影響效果(圖3)。隨著粗提物濃度的增大，抑菌效果逐漸明顯，當(dāng)濃度達(dá)到50 mg/mL后，隨著粗提物濃度的增大，抑菌效果更為顯著，說明茼蒿中抑菌活性物質(zhì)隨濃度的增加，其含量也在增加，只有當(dāng)抑菌活性物質(zhì)含量達(dá)到一定濃度時(shí)，對西瓜枯萎病菌才有較好的抑制作用。

利用DPS軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以茼蒿粗提物的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，求得毒力回歸方程，見圖1，相關(guān)系數(shù)(r)，EC50及置信區(qū)間如表1。EC50大小可以反映出粗提物對西瓜枯萎病菌抑制活性的大小，從表中可知，EC50為206.405 8 mg/mL，能更準(zhǔn)確的反映出殺菌濃度及可以抑制西瓜枯萎病菌的粗提物濃度在置信區(qū)間內(nèi)。

表1 茼蒿粗提物對西瓜枯萎病的抑菌效果Tab.1 Crude extracts from garden chrysanthemum bacteriostatic effect of watermelon fusarium wilt

2.4 茼蒿粗提物對西瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的測定

通過MIC、EC50和MFC的測定結(jié)果，在孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中利用這3組臨界值作為處理組，以無茼蒿粗提物的菌液為對照，測定結(jié)果如下圖4。隨著濃度的升高，孢子萌發(fā)率越來越小，空白對照組孢子萌發(fā)達(dá)到92.9%，MFC時(shí)的孢子萌發(fā)率為17.4%，EC50的孢子萌發(fā)率為28.4%，而MIC時(shí)的孢子萌發(fā)率最大，萌發(fā)率為84.8%，從圖中可以看出，MFC對孢子萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)，而MIC對孢子萌發(fā)的抑制作用較弱。

圖4 不同濃度粗提物對枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響Tab.4 Different concentrations of crude extracts on spore germination of Fusarium oxysporum

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)證明，茼蒿粗提物對西瓜枯萎病菌有一定的抑制作用，同時(shí)正丁醇萃取的茼蒿粗提物抑菌效果較好，其抑菌效果達(dá)97.5%，并且在西瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)中，茼蒿粗取物能夠較強(qiáng)的抑制孢子的萌發(fā)，在最小殺菌濃度(MFC)下的萌發(fā)率為17.4%。這說明茼蒿中含有某些活性物質(zhì)，對植物病原菌有較好的抑制作用。

綜上所述，茼蒿能夠促進(jìn)西瓜幼苗生長和抑制西瓜枯萎病菌，但其作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。為此，開展對茼蒿中活性成分的分離、純化與結(jié)構(gòu)鑒定等工作非常重要，它將為今后研制具有抑菌效果，而又對人類自身健康和生態(tài)環(huán)境無害的天然植物源殺菌劑，提供重要的理論指導(dǎo)，且具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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