石榴果實發(fā)育期有機酸組分及含量變化

楊雪梅，尹燕雷，馮立娟，武 沖

(山東省果樹研究所，山東 泰安 271000)

石榴(Punica granatum L.)為石榴科石榴屬果樹，石榴果實營養(yǎng)豐富，其籽粒中果汁含量占70%以上，果汁中含有豐富的糖、有機酸及人體必需微量元素等營養(yǎng)成分，保健功能強。有機酸作為植物初生代謝的產(chǎn)物及代謝中間產(chǎn)物，對植物機體發(fā)育過程具調(diào)控作用。有機酸可作為新陳代謝活躍的溶質(zhì)在細胞滲透調(diào)節(jié)和平衡細胞內(nèi)過量陽離子;同時有機酸還是植物應(yīng)對營養(yǎng)虧缺、對抗重金屬、植物與微生物在根與土壤交界面發(fā)生相互作用機制中的關(guān)鍵成分［1］。有機酸還可提高果實的抗病性［2］，有機酸可通過降低鮮切水果和蔬菜的pH值來抑制低溫貯藏期間氧化及微生物的生長，研究表明適當(dāng)濃度檸檬酸處理可保持蘋果切塊的感官品質(zhì)，延緩營養(yǎng)物質(zhì)的下降，抑制微生物的繁殖，對鮮切蘋果有較好的護色效果［3］。通常有機酸在果實生長過程中積累，在成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環(huán)等呼吸基質(zhì)以及糖原異生作用基質(zhì)而被消耗［4］。迄今已通過高效液相色譜(HPLC)技術(shù)對包括杏［5］、桃［6-7］、草莓［8-9］、梨［10］、柑橘［11］等多種果樹果實中有機酸種類與含量進行測定，但對石榴果實發(fā)育過程中有機酸組分動態(tài)變化的研究尚未見相關(guān)報道。因此，本研究以山東主栽優(yōu)良品種“泰山三白甜”和“泰山紅”為試材，其中，前者籽粒白色口感甜而不酸無澀味，后者籽粒深紅似瑪瑙，口感酸甜略澀，2個品種在形態(tài)及品質(zhì)上均具有較大差異。通過比較二者果實發(fā)育過程中有機酸組分及含量的差異以明確二者品質(zhì)差異形成的原因，為石榴栽培與生產(chǎn)提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年7—10月進行采樣，7月10日開始，每10 d取樣1次，直到果實完全成熟。每次采5個果實。供試“泰山紅”和“泰山三白甜”石榴果實均采自山東省果樹所試驗苗圃，樹體生長、立地條件和栽培管理水平基本一致，果實隨機取自樹勢基本一致的樹冠外圍中上部結(jié)果枝，取樣時間均為10:00左右。釆樣后迅速置于放有冰袋的保溫盒中，送回實驗室置于冰箱中4℃存放，四分法取樣，將所釆5個果實分別沿中軸十字形縱切每果實取1/4的籽?；靹?，用4層紗布擠汁迅速置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器

實驗室超純水制造系統(tǒng):LCT理化分析型超純水機(立純水處理);XUB5超聲脫氣系統(tǒng)裝置:德國Eppendorf 5415R冷凍高速離心機:Agilent HPLC(美國安捷倫，附紫外檢測器);色譜柱:安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品草酸、酒石酸、抗壞血酸(Vc)和乙酸各10 mg;蘋果酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸20 mg用5 mL流動相(含0.2%偏磷酸)溶解定容到10 mL容量瓶中，分別配制成1 mg/mL和2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于 －20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，制作?biāo)準(zhǔn)曲線時，分別將配好的標(biāo)樣稀釋成6種不同濃度，單獨進樣記錄色譜保留時間(RT值)及不同濃度的峰面積。以進樣量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(mAU·min)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，建立回歸方程。

將8種有機酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以一定比例混合，過濾后上機，記錄混合有機酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖，獲得色譜保留時間(RT值)及各組分分離情況。

1.3.2 有機酸的提取與測定 準(zhǔn)確量取石榴果汁1 mL，加入0.2%的偏磷酸溶液3 mL，漩渦震蕩混勻后于7 500 r/min，4℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上清到容量瓶中，沉淀后再分別加入0.2%的偏磷酸溶液3 mL和2.5 mL重復(fù)提取收集2次，最后將收集的上清定容至10 mL，過0.45 μm的微孔水系濾膜待測。安捷倫色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18柱4.6 mm×150 mm(5 μm)，測定使用Agilent 1200 LC型高效液相色譜儀(美國安捷倫)，RID 10-A示差折光檢測器，流動相:0.2%偏磷酸∶甲醇=95∶5，檢測波長分別為210 nm，243 nm［12］，流速 0.6 mL/min，進樣量 10 μL。

1.3.3 總可滴定酸含量測定 石榴果實可滴定酸含量(titratable acidity，TA)采用酸堿滴定法測定［13］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2003分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，相關(guān)性分析采用SPSS Statistics19進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測波長的確定

草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸和Vc，分別單獨進樣，獲得各自色譜保留時間即RT值(表1)。以進樣量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(mAU·min)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，建立回歸方程，信噪比S/N=3時標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為方法檢測限。從表1可看出，相關(guān)系數(shù)R值與精密度RSD值符合實驗預(yù)期要求，表明該色譜工作條件測定有機酸性能穩(wěn)定、重現(xiàn)性高。

表1 不同有機酸標(biāo)樣回歸方程及檢出限Tab.1 Regression equations and detection limit of different organic acid sample

圖1所示，8種酸按一定比例混合后過濾上機，進樣6次，記錄混合有機酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖。8種酸的混合標(biāo)樣除Vc外均在210 nm處有最大吸收峰(圖1a)，而Vc在243 nm下有最大吸收峰(圖1b)，根據(jù)其吸收峰的波長不同可分別測定出7種有機酸和Vc含量。

圖1 不同波長下7種有機酸和Vc混和標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜(a:檢測波長210 nm;b:檢測波長243 nm)Fig.1 Mixed standard sample of 7 kinds organic acid and Vc by HPLC under different wavelength(a:detection wavelength of 210 nm;b:detection wavelength of 243 nm)

2.2 “泰山三白甜”和“泰山紅”石榴果實發(fā)育過程中總可滴定酸(TA)含量

圖2所示，2個石榴品種果實發(fā)育過程中TA含量均呈發(fā)育前期高，后期降低的趨勢，整個發(fā)育期內(nèi)出現(xiàn)2～3次高峰，且前期峰值均高于后期峰值?；ê?0～50 d2個石榴品種TA含量均呈升高趨勢，至第50天TA含量均升至發(fā)育期內(nèi)第1次峰值;50～60 d二者有機酸含量均迅速降低;60～90 d期間“泰山紅”石榴TA含量呈緩慢降低趨勢;“泰山三白甜”石榴在70～90 d期間TA含量逐漸升高，至第90天達第2次峰值，之后TA含量迅速降低;而“泰山紅”石榴至第100天TA含量達第2次峰值，之后TA含量先降低后略有升高。在整個果實發(fā)育過程中“泰山紅”石榴果汁中的總可滴定酸均高于各個時期的“泰山三白甜”石榴。

圖2 “泰山三白甜”和“泰山紅”石榴果實發(fā)育過程中總可滴定酸含量變化Fig.2 Changes of total titriable acid of‘Taishansanbaitian’and‘Taishanhong’pomegranate during the fruit developing

圖3 “泰山三白甜”和“泰山紅”石榴果實發(fā)育過程中各有機酸含量變化Fig.3 Changes of each organic acid content of‘Taishansanbaitian’and‘Taishanhong’pomegranate during the fruit developing

2.3 “泰山三白甜”和“泰山紅”石榴果實發(fā)育過程中各有機酸組分含量變化

圖3a，b，c所示，2個石榴品種果實發(fā)育過程中草酸、檸檬酸和琥珀酸3種有機酸含量變化趨勢均呈相類似的雙峰曲線，其中以草酸含量變化曲線與TA含量變化趨勢最一致。2個品種草酸含量均在花后第50天達最高分別為40.70 mg/mL和18.08 mg/mL，整個發(fā)育期內(nèi)“泰山紅”石榴草酸含量均較“泰山三白甜”石榴高，前者含量約為后者的2.1～3.5倍(圖3a);2個石榴品種的檸檬酸含量均在11 mg/mL以上，且整個發(fā)育期內(nèi)“泰山三白甜”石榴檸檬酸含量均高于“泰山紅”石榴，其檸檬酸含量在各個時期均在21 mg/mL以上(圖3b);整個發(fā)育期內(nèi)“泰山三白甜”石榴琥珀酸含量(1.78～3.24 mg/mL)均高于“泰山紅”石榴(0.45～0.89 mg/mL)，“泰山三白甜”石榴是“泰山紅”石榴琥珀酸含量的3.0～7.1倍(圖3c)。由此可知，草酸為和檸檬酸分別為“泰山紅”和“泰山三白甜”石榴的主導(dǎo)有機酸，而草酸的含量是總可滴定酸含量影響最大。

圖3d所示，2個石榴品種果實發(fā)育過程中蘋果酸含量變化趨勢較一致，均呈下降趨勢，果實發(fā)育過程中“泰山三白甜”中蘋果酸含量均高于“泰山紅”石榴。花后30～40 d二者蘋果酸含量均呈上升趨勢，到花后第40天二者蘋果酸含量均達最高，分別為“泰山三白甜”14.892 1 mg/mL和“泰山紅”8.012 1 mg/mL。花后40～50 d含量均迅速降低，花后60 d至采收前二者蘋果酸含量變化均較平穩(wěn)。

圖3e示，石榴發(fā)育過程中2個石榴果實中Vc含量均不足0.1 mg/mL，Vc含量在整個發(fā)育過程中2個石榴品種均出現(xiàn)2個高峰，“泰山三白甜”石榴于花后第70天含量達最高每100 g鮮質(zhì)量約7.4 mg;“泰山紅”石榴于花后第40天含量達最高含量每100 g鮮質(zhì)量約7.0 mg，且其60～120 d“泰山三白甜”果實中Vc含量均高于“泰山紅”。表明這2個石榴品種果實中Vc含量中等，石榴的較強的抗氧化性能可能來源于其酚類物質(zhì)。

圖3f所示，果實發(fā)育過程中“泰山三白甜”石榴在盛花后30～50 d酒石酸含量迅速升高，至50 d時達最高約1.37 mg/mL，50～60 d含量迅速降低，70～120 d酒石酸含量變化趨勢較為平緩在0.57～0.64 mg/mL;而“泰山紅”石榴果實中酒石酸含量在整個發(fā)育過程中變化趨勢始終較為緩慢在0.46 ～0.68 mg/mL。

乙酸和乳酸在2個石榴品種果實中含量均較低，不足0.1 mg/mL。乙酸含量在2個石榴品種果實發(fā)育過程中均維持在一定水平，表明乙酰CoA脫乙?；傻囊宜嵩谑翊x過程中處于穩(wěn)態(tài)(圖3g);2個石榴品種果汁中均檢出少量的乳酸，2個石榴品種發(fā)育過程中乳酸含量變化趨勢基本一致(圖3h)，表明石榴代謝發(fā)育過程中存在乳酸參與的代謝途徑。

2.4 “泰山三白甜”和“泰山紅”石榴果實發(fā)育期內(nèi)各有機酸組分的含量

圖4所示，試驗中7種有機酸在石榴不同發(fā)育時期均有檢出，其中“泰山紅”石榴中以草酸含量最高，其次分別為檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸和乳酸。而“泰山三白甜”石榴果實中以檸檬酸含量最高，其次分別為草酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、抗壞血酸、乙酸和乳酸。表明2個石榴品種的有機酸含量及組成比例不同，這可能是影響2個石榴品種口感，造成“泰山紅”比“泰山三白甜”口感偏酸的主要原因之一。

圖4 “泰山紅”和“泰山三白甜”石榴果實發(fā)育期內(nèi)各有機酸組分的平均含量Fig.4 Average contents of each organic acids composition in‘Taishansanbaitian’and‘Taishanhong’pomegranate fruit during the developing period

2.5 “泰山三白甜”和“泰山紅”石榴果實發(fā)育期內(nèi)各有機酸組分含量相關(guān)性分析

有表2可知，2個石榴品種各有機酸組分相關(guān)性不同。“泰山三白甜”石榴果實發(fā)育過程中酒石酸和草酸含量及檸檬酸和乙酸含量均在0.01水平上兩兩呈顯著正相關(guān);琥珀酸、酒石酸和蘋果酸及蘋果酸和Vc含量均在0.05水平兩兩上呈顯著負相關(guān)。而“泰山紅”石榴果實發(fā)育過程中酒石酸和乳酸、乙酸含量均在0.01水平上兩兩呈顯著正相關(guān);草酸和乳酸含量在0.05水平上呈顯著正相關(guān)。表明2個石榴品種果實發(fā)育過程中各有機酸的代謝相關(guān)性不同，其原因尚不明確，有待于深入研究。

表2“泰山三白甜”和“泰山紅”石榴果實發(fā)育期內(nèi)各有機酸組分含量相關(guān)性分析Tab.2 The correlation analysis of organic components in‘Taishansanbaitian’and‘Taishanhong’pomegranate fruit during the developing period

3 結(jié)論與討論

果實中有機酸、糖及一些揮發(fā)性成分共同形成果實的特有風(fēng)味。不同果實及同一果實的不同部位有機酸含量不同。同一樹種不同品種果實各有機酸組分變化也不同，通常隨著果實的發(fā)育成熟果實中有機酸含量降低［14］。有機酸含量在果實發(fā)育過程中呈動態(tài)變化，本研究中，2個石榴品種果實發(fā)育期均以檸檬酸、草酸、蘋果酸和琥珀酸為主要有機酸成分，不同之處在于各有機酸所占比例不同。“泰山紅”石榴果實發(fā)育過程中始終以草酸含量最高，“泰山三白甜”始終以檸檬酸含量最高?！疤┥饺滋稹惫麑嵵刑O果酸和琥珀酸含量在整個發(fā)育期內(nèi)均高于“泰山紅”，但其TA始終低于“泰山紅”，“泰山三白甜”整個發(fā)育期口感偏甜，無明顯酸味，其原因可能與草酸含量直接相關(guān)。比較3種主要有機酸的離解常數(shù) PKa1值:草酸(1.22)＜檸檬酸(3.15)＜蘋果酸(3.46)，可知草酸酸性最強［15］，因此，草酸含量的差異一定程度上決定了2個石榴品種的風(fēng)味及口感的差異。

檸檬酸是石榴中含量最高的有機酸之一，檸檬酸在機體內(nèi)起著重要作用。有研究表明檸檬酸可影響草酸鈣結(jié)石的形成，可同時抑制草酸鈣的成核、生長和聚集［16］，這可以解釋石榴中高含量的草酸食用后并未對人體造成傷害，可能與石榴中較高含量的檸檬酸有關(guān)。

通過對石榴發(fā)育過程中有機酸含量的分析發(fā)現(xiàn):石榴中有機酸含量豐富，尤其以檸檬酸和草酸最多，不同品種石榴的有機酸組分含量差異較大。通過對有機酸組分及含量的測定為進一步研究石榴中各有機酸的代謝途徑提供基礎(chǔ)。因此，石榴有機酸合成及代謝的相關(guān)限制性酶及部分有機酸在石榴機體內(nèi)的功能將是下一步研究的重點。

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