運用RP－HPLC同時測定火龍果中7種有機酸和Vc含量的方法研究

蔣儂輝，凡 超，劉 偉，向 旭

(廣東省農業(yè)科學院 果樹研究所/農業(yè)部南亞熱帶果樹生物技術與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640)

火龍果(Hylocereus undulatus)屬仙人掌科量天尺屬果樹，目前種植的主要有量天尺屬的白肉火龍果(H.undatus)、紅肉火龍果(H.polyrhizus)和紫紅肉火龍果(H.costaricensis)3個品種［1-2］，于20世紀90年代初引入我國臺灣省，之后開始在廣西、廣東、海南等省區(qū)種植，因其外形亮麗，果肉多汁味美，深受消費者的喜愛［3］。火龍果耐干旱，耐粗放管理，病蟲害少，可基本不施化學農藥和化肥，具有作為綠色食品開發(fā)的基礎條件，且發(fā)展前景廣闊［4］。

有機酸組分及其含量對果實內在品質有著重要的影響，是決定果實風味的重要指標［5-6］，其含量直接影響果品風味、口感及色澤，是果品成熟度、耐貯藏性以及加工性的重要指標，同時也是研究不同資源的有機酸組分積累特征及其代謝的重要依據(jù)［7-11］。由于引進時間短，對火龍果研究多側重于引種及品種比較、常規(guī)種植管理技術的研究［12-13］，但目前對廣州地區(qū)引種栽培的火龍果有機酸組分及糖組分代謝極少見詳細報道，因此對火龍果中的有機酸的測定方法研究是很有意義的。近年來，建立了一些用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離檢測有機酸的方法［15-19］，但同時測定火龍果中有機酸與Vc的方法還未見報道。Vc的常規(guī)檢測方法是采用2，6-二氯酚靛酚滴定法［20］，此法簡便快速，但也有其缺點，當遇到顏色較深的水果時因滴定終點(淡粉紅色)難以判定而無法獲得準確的結果，運用HPLC方法可以克服以上缺點并獲得準確結果。

本試驗以廣東珠海斗門產紫紅肉火龍果為試驗材料，對影響有機酸分離的主要因素進行了研究，最終確定了運用HPLC法一次進樣同時測定火龍果果實多種有機酸及Vc的方法。為今后果實特別是深色果肉果實的有機酸及Vc類物質的深入研究及其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試火龍果采自廣東省珠海斗門試驗基地，為紫紅肉火龍果(H.costaricensis)果肉。

草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、Vc標準、H3PO4、Na2HPO4均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100型高效液相色譜儀(配有VWD紫外檢測器)，美國Agilent公司;5702臺式冷凍離心機，美國Eppendorf公司;超純水儀，美國Millipore公司;KQ-300VDE超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司;S20K pH計，瑞士梅特勒-托利多公司;Kromasil C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，瑞典EKA Chemicals公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制 分別稱取草酸標準50 mg、酒石酸標準125 mg、蘋果酸標準125 mg、Vc標準125 mg、乳酸標準50 mg、醋酸標準100 mL、檸檬酸標準250 mg、琥珀酸標準125 mg于25 mL的容量瓶(精確至0.1 mg)，分別用流動相緩沖溶液溶解并定容于25 mL容量瓶中，作為有機酸的標準貯備液。使用時各取1.00 mL于10 mL容量瓶配制成有機酸的混合標準液，再將混合標準液在10 mL容量瓶中用流動相緩沖溶液稀釋成不同的濃度梯度(即稀釋1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍)。

1.3.2 樣品制備 取H3PO4－Na2HPO4配置0.05 mol/L，pH2.5的樣品緩沖液，取經組織搗碎后的果蔬樣品10 g，加H3PO4－Na2HPO4緩沖液定容于100 mL，于超聲清洗器上超聲混合提取10 min，置于高速冷凍離心機上離心10 min(10 000 r/min，4℃)，移取上清液，經0.45 μm濾膜過濾，漩渦混合器上混合1 min后加入樣品瓶備用。

1.3.3 色譜條件 參照 GB/T 5009.157—2003《食品中有機酸的測定》［21］、文獻［15-19］等的方法加以修改，采用的色譜條件為:Kromasil柱250 mm×4.6 mm，緩沖液:0.05 mol/L H3PO4-Na2HPO4緩沖液;進樣體積:20 μL;紫外檢測波長:215 nm，柱溫:30℃，流速:1 mL/min。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的確定 用二極管陣列檢測器采集有機酸在190～300 nm的紫外吸收光譜圖，對每種有機酸的吸光度進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)這7種有機酸與Vc在200～230 nm有最大吸收波長［22］，且215 nm處其他物質干擾少，確定為檢測波長。

2.1.2 流動相pH值的確定 水溶性有機酸的HPLC分析，通過添加H3PO4調節(jié)pH值來抑制有機酸的解離，降低離子化，用Na2HPO4水溶液的可獲得滿意的分離效果，流動相的pH值對有機酸的保留時間有很大的影響，因此，通過調節(jié)流動相的pH值對7種有機酸與Vc進行檢測;當pH值較小時草酸分離效果很好，但過小(pH≤2)，影響色譜柱的使用壽命，當pH值較大(pH＞3)，目標峰會嚴重重疊［23］，最終選擇分離效果較好的pH 2.5為緩沖液pH值。

2.1.3 流動相流速 分別考察了 0.2，0.6，0.8，1.0，1.2 mL/min 5 種流速，流速低易導致拖尾，當隨著流速的增大，分離度有所減小，但出峰時間更快，但流速增大也會增加系統(tǒng)的壓力，因1.0 mL/min的流速有較高的分離度，更短的分析時間，綜合各種因素，選擇1.0 mL/min為最佳流速。

2.1.4 柱溫的確定 隨著柱溫的升高，色譜峰的保留時間減小，色譜峰形越理想，但過高的柱溫會影響色譜柱的使用壽命。選擇柱溫30℃時，可以在10 min內完成1個樣品的測定，測定時間和峰形都較理想。因此選擇30℃為本試驗的柱溫。

2.2 標準曲線繪制與線性關系考察

將各有機酸與Vc標準試劑分別配成單一的標準溶液，在同一色譜條件下分別進樣，確定每種有機酸的保留時間，根據(jù)保留時間定性。待儀器穩(wěn)定后，取不同濃度梯度的7種有機酸與Vc的混合標準溶液分別進樣，每個濃度標樣至少進3次，外標法定量，以峰面積為橫坐標，質量濃度為縱坐標做標準曲線。在上述優(yōu)化所得色譜條件下標準品的色譜圖見圖1。

各有機酸的線性擬合方程、線性范圍及相關系數(shù)(R)如表 1 所示，R ＞0.999 0，說明有機酸及Vc的濃度對峰面積線性關系良好。

圖1 混合有機酸標準的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed organic acid standard

2.3 精密度考察

對某一濃度的有機酸混合標準溶液在1.3.3節(jié)色譜條件下進行HPLC分析，重復操作5次，根據(jù)峰面積計算精密度，結果各有機酸與Vc的相對標準偏差(RSD)分別為草酸1.39%、酒石酸1.08%、蘋果酸0.84%、Vc 0.50%、乳酸 0.58%、乙酸 0.99%、檸檬酸 1.86%、琥珀酸 1.75% ，其中 Vc 的 RSD 為最低(表1)。可見用本法同時測定果實中的有機酸與Vc具有較好的精密度，適用于定量分析。

2.4 重復性考察

精密稱取同一份均勻混合的火龍果樣品5份，按1.3.2節(jié)樣品前處理方法獲得供試溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件進樣，測得各有機酸的平均含量分別為草酸0.211 4 mg/g、酒石酸0.616 9 mg/g、蘋果酸3.861 1 mg/g、Vc 0.143 7 mg/g、乳酸 0.152 4 mg/g、乙酸 0.365 1 mg/g、檸檬酸 0.936 1 mg/g、琥珀酸0.245 3 mg/g，RSD 分別為 3.76%、2.56% 、0.78%、0.36%、2.24%、1.58%、1.50%、2.89%。表明本法重復性良好。

表1 標準溶液回歸分析和精密度分析Tab.1 Regression analysis and precision analysis of standard solution

表2 火龍果有機酸與Vc測定的回收率試驗Tab.2 Recovery rates of organic acid and Vc determination in dragon fruit

2.5 回收率考察

取同一火龍果樣品制備液2份，1份作為空白，另1份加入一定量的標準有機酸溶液，分別進行樣品處理和HPLC分析，測定回收率。重復測定6次，其平均回收率分別為:草酸102.80% 、酒石酸94.85%、蘋果酸97.78%、Vc 97.56%、乳酸 95.129% 、乙酸 96.09% 、檸檬酸 101.23%、琥珀酸 98.00%。表2顯示該處理樣品的方法具有較高的回收率。

2.6 火龍果樣品有機酸與Vc的測定

為驗證以上分析方法，取經黑色遮陽網覆蓋方式栽培的成熟火龍果與無覆蓋的對照按照1.3.2節(jié)方法處理樣品，進樣20 μL。有機酸色譜圖見圖2，各處理含量見表3。

圖2 火龍果樣品中有機酸與Vc的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of organic acids and Vc in dragon fruit sample

從表3可以看出:供試火龍果中有機酸以蘋果酸含量最高，為3.15 ～3.86 mg/g，占總酸的 60%～67%，其次是檸檬酸，為0.88 ～1.13 mg/g，占總酸的 16%～22%，草酸及乳酸含量較低;7種有機酸含量由高到低依次為:蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、草酸、乳酸，這與以往文獻［24］測定火龍果果肉中僅含有草酸、酒石酸、丙酮酸和富馬酸不同。同時檢測到 Vc含量有0.14 ～0.16 mg/g。表3數(shù)據(jù)表明黑色遮陽網降低了火龍果蘋果酸、草酸及總酸的含量，提高了Vc的含量。

表3 黑色遮陽網栽培對火龍果中有機酸及Vc的含量的影響Tab.3 The influence of content of black screen cultivation methods for dragon fruit in organic acid and Vc

3 討論與結論

測定結果發(fā)現(xiàn)，雜質對結果有較大的影響，由于草酸及酒石酸被洗脫的時間最短，其保留時間在2 min左右，測定樣品時很容易與最先被洗脫下來的雜質等混在一起被洗脫，可能是由于該色譜柱對這兩種酸較為敏感，因此方法改進還需從改進前處理方法，進一步清除雜質來優(yōu)化。

實踐證明流動相pH值對本方法有非常大的影響，細微的差別將導致保留時間及出峰次序的變化，因此必須對pH計進行嚴格的校正，才能確保方法的重復性和準確性。

草酸在腸道內會與鈣結合成難吸收的草酸鈣，干擾人體對鈣的吸收，草酸的高低與果實的口感與品質密切相關，隨著人們對健康的日益關注，低草酸含量的水果將更受大眾的歡迎［25］。蘋果酸與檸檬酸相比酸度大(酸味比檸檬酸強20%)，但味道柔和(具有較高的緩沖指數(shù))，具有特殊香味，被生物界和營養(yǎng)界譽為“最理想的食品酸味劑”［26］。結果表明，測定的紫紅肉火龍果是一種高蘋果酸，低草酸的水果，因此是一種復合現(xiàn)代人飲食健康和風味需求的水果。

綜合以上，本試驗獲得以下結論:

(1)建立了一種運用HPLC同時快速測定紫紅肉火龍果果實中7種有機酸(草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸)和Vc含量的方法。采用的色譜條件為:柱溫30℃，流速1 mL/min，色譜柱為 Kromasil柱(250 mm ×4.6 mm)，波長215 nm，緩沖液0.05 mol/L H3PO4-Na2HPO4，10 min 內可完成一次測定。

(2)供試的紫紅肉火龍果果肉中含有蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、草酸、乳酸，蘋果酸是其最主要的有機酸、其次是檸檬酸。

該方法具有分析速度快、靈敏度高、重復性好、效率高等優(yōu)點，對果實中有機酸及Vc的測定及相關代謝研究有較高的參考意義。

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