基于藥用輔料的拉曼光譜鑒別絡活喜仿冒藥研究

錢小峰，柳 艷，陳 輝，陸 峰（第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室，上海 200433）

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基于藥用輔料的拉曼光譜鑒別絡活喜仿冒藥研究

錢小峰，柳 艷，陳 輝，陸 峰（第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室，上海 200433）

目的針對藥物活性成分與原研藥質(zhì)量相同的一類仿冒藥，以苯磺酸氨氯地平片原研藥及仿冒藥為工具藥，建立基于兩者所用藥用輔料的差異，用于鑒別絡活喜仿冒藥的方法。方法收集絡活喜片劑常用輔料的拉曼光譜，采用相似度算法及特征峰查找待檢樣品中輔料，若待檢樣品的輔料與原研藥輔料不同則判為仿冒藥；若待檢品輔料與原研藥輔料相同，則采用主成分分析法區(qū)分仿冒藥與原研藥。結果與結論該方法可快速、準確地鑒別絡活喜仿冒藥。

藥用輔料；拉曼光譜；仿冒藥；相似度法；特征峰；主成分分析

藥品仿冒是一種性質(zhì)嚴重的犯罪活動，其不僅侵犯知識產(chǎn)權，并且已經(jīng)成為有組織的犯罪新分支，為恐怖分子活動提供資金［1］。世界衛(wèi)生組織（WHO）表示，全球范圍內(nèi)10%的藥品為仿冒藥［2］。因此，研究建立快速、準確的藥品鑒別方法迫在眉睫。WHO已將仿冒藥定義為“假造、貼錯標簽、偽造、仿冒藥品（SFFC）”［3］。

通常，對仿冒藥的篩查從樣品表觀開始，包括藥品本身，如：重量、形狀、顏色、外觀等，以及包裝如：箱、盒、泡形罩、玻璃小瓶、說明書、批號日期、印刷質(zhì)量、商標標示等。此外，理化測試包括比色法［4］、溶解度［5］、密度、黏度檢測［6］等，速度快且費用低。但是，這些檢測并不能提供樣品內(nèi)容物信息。

拉曼光譜在仿冒藥的鑒別領域有廣泛應用。本研究主要針對藥物活性成分（API）與原研藥相同的一類仿冒藥，選擇WHO列出的必需藥品之一苯磺酸氨氯地平片為工具藥。僅根據(jù)《中華人民共和國藥典》所示方法尚不能鑒別仿冒藥。本研究收集20種常用片劑輔料的拉曼光譜，構成片劑輔料拉曼光譜庫（簡稱：輔料庫），計算待檢樣品輔料與原研藥輔料的相似度，并結合特征峰的峰位及強度，如果待檢藥品輔料與原研藥絡活喜輔料不同，判為仿冒藥；反之，則采用主成分分析的方法，以實現(xiàn)對此類仿冒藥的準確鑒別。

1 材料與儀器

1.1 材料 常用片劑輔料（上海信誼藥廠）；原研藥絡活喜（A.輝瑞公司生產(chǎn)），本研究所涉及處方均由廠家提供，共收集6個廠家的苯磺酸氨氯地平片，API規(guī)格均為5 mg。絡活喜A處方：微晶纖維素、磷酸氫鈣、羧甲淀粉鈉、硬脂酸鎂；廠家B處方：微晶纖維素、磷酸氫鈣（較多）、羧甲淀粉鈉（少量）、硬脂酸鎂（少量）、羥丙甲纖維素（少量）；廠家C處方：乳糖（僅告知部分處方）；廠家D處方：淀粉、甘露醇、硬脂酸鎂、羥丙纖維素、預膠化淀粉、羥丙甲纖維素；廠家E處方：微晶纖維素、磷酸氫鈣、淀粉、羧甲淀粉鈉、硬脂酸鎂；廠家F處方：羧甲淀粉鈉、微晶纖維素、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、淀粉。

1.2 儀器 采用B＆W Tek便攜式拉曼光譜儀（i-Raman）進行樣品光譜采集。拉曼光譜儀采用半導體致冷型CCD檢測器，激光源波長：785 nm，激光器功率：100 mW，光束直徑：2 mm，光譜分辨率：3.5 cm－1，波數(shù)范圍：65～2 700 cm－1。

2 方法

2.1 采樣方法 將輔料、原研藥、仿冒藥分別置于載玻片上，手動調(diào)整焦距，采樣積分時間：5×3 s，每個樣品進行多個位置采樣，以多張拉曼光譜的平均值作為該樣品的拉曼光譜。

2.2 光譜預處理方法 輔料及樣品所采集的拉曼光譜均采取同樣的預處理方法，截波范圍100～1 800 cm－1，平滑去除由于物理因素產(chǎn)生的噪音，基線校正采用Rubberband correction算法，標準化采用min-max normalization。

2.3 方法學驗證

2.3.1 穩(wěn)定性實驗 采樣時間間隔24 h，連續(xù)5 d對同一供試品按照“2.1”及“2.2”項下方法進行檢測，計算得出5次采樣光譜的相似度均＞0.95，峰位偏差不足1個波數(shù)。實驗結果表明，供試品在拉曼光譜檢測過程中具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.2 精密度實驗 將同一供試品平均分為5份，在相同的測量環(huán)境下，按照“2.1”及“2.2”項下方法對5份供試品進行拉曼光譜采集。計算得出5份供試品拉曼光譜的相似度均＞0.95，峰位偏差不足1個波數(shù)，結果表明，用拉曼光譜儀檢測供試品具有較好的精密度。

2.3.3 重復性實驗 取同一批號同種供試品5份，在相同的測量環(huán)境下，按照“2.1”及“2.2”項下方法對5份供試品進行拉曼光譜采集。計算得出5份供試品拉曼光譜的相似度均＞0.95，峰位偏差不足1個波數(shù)，結果表明，拉曼光譜技術具有較好的重復性。

2.4 分析策略 本研究嘗試建立原研藥與仿冒藥的兩步鑒別法。①采集待檢樣品及原研藥的拉曼光譜圖，經(jīng)過光譜預處理后，將待檢樣品及原研藥光譜與輔料庫中光譜分別計算相似度。②若與某種藥用輔料相似度值達0.9以上，則判斷待檢樣品中含有該藥用輔料，并用特征峰對該藥用輔料進行驗證。若與輔料庫內(nèi)藥用輔料相似度值達不到閾值0.9，則提示樣品中可能含有某種輔料，標出樣品中輔料的特征峰位置及強度，用這些特征峰對比輔料庫中輔料的特征峰位置及強度。如果樣品輔料與原研藥輔料不同，則可明確判定為仿冒藥；如果查找得出樣品輔料與原研藥輔料相同，則需要收集不同批次的原研藥及仿冒藥，使用主成分分析法進行鑒別。

3 結果分析與討論

3.1 常用片劑輔料的拉曼光譜 圖1為20種輔料的拉曼光譜圖。

3.2 輔料不同的原研藥與仿冒藥鑒別 仿冒藥生產(chǎn)者首先會對原研藥進行大量資料調(diào)研，而絡活喜處方中所使用的輔料易于獲取，不法分子通過化工廠購買原料藥，再仿冒、甚至高價回收原研藥的外包裝盒，蒙騙消費者，給患者帶來傷害。

從圖2可見，B、C、D廠家的拉曼圖譜與原研藥A絡活喜有較大區(qū)別，而E、F廠家與原研藥較為相似。計算各廠家與輔料庫光譜的相似度值，并在扣除片劑中API的特征峰后，根據(jù)特征峰查找各廠家藥片中可能含有的輔料，按“2.4”項下方法進行分析。

如圖2A所示，B廠家光譜與輔料庫中磷酸氫鈣的相似度為0.835 37（小于閾值0.9），采用特征峰查找為主要鑒別方法，B廠家藥片主要特征峰為：1 381cm－1（w），1 124 cm－1（w），1 094 cm－1（w），1 059 cm－1（w），987 cm－1（vs），880 cm－1（w），523 cm－1（m），409 cm－1（m），381 cm－1（s）和208 cm－1（w），而磷酸氫鈣主要特征峰為：1 058 cm－1（w），987 cm－1（vs），879 cm－1（w），587 cm－1（w），523 cm－1（m），411 cm－1（m），380 cm－1（s）和207 cm－1（w），兩者主要特征峰強度及位置相一致的個數(shù)有7個，由此可判斷B廠家樣品含有磷酸氫鈣。原研藥絡活喜中雖然含有磷酸氫鈣，但是由于仿冒藥廠家中含有大量磷酸氫鈣，其拉曼光譜峰主要體現(xiàn)了磷酸氫鈣的拉曼峰，由此能夠鑒別B廠生產(chǎn)的是仿冒藥。

由圖2B可見，C廠家光譜與輔料庫中乳糖的相似度為0.990 82，以相似度為主要鑒別方法，判斷其中含有乳糖。同時，查找特征峰作為驗證，C廠家的主要輔料特征峰為：259 cm－1（w），358 cm－1（vs），378 cm－1（s），398 cm－1（w），478 cm－1（m），554 cm－1（w），852 cm－1（m），877 cm－1（m），916 cm－1（w），954 cm－1（w），1 020 cm－1（w），1 053 cm－1（w），1 087 cm－1（s），1 121 cm－1（m）和1 263 cm－1（w）。C廠家與藥用輔料乳糖的特征峰強度及位置相一致的有10個，可判斷其中含有乳糖，而原研藥中不含乳糖，因此，判定C廠家生產(chǎn)的是仿冒藥。

D廠家與輔料庫中甘露醇的相似度值為0.854 2（小于閾值0.9），以特征峰查找為主要鑒別方法。如圖2C所示，D廠家主要輔料特征峰為369 cm－1（w），478 cm－1（m），518 cm－1（m），788 cm－1（w），850 cm－1（m），875 cm－1（vs），1 037 cm－1（m），1 131 cm－1（w），1 354 cm－1（w）和1 460 cm－1（w），查找特征峰發(fā)現(xiàn)主要輔料為甘露醇，輔料庫中甘露醇的特征峰為244 cm－1（w），288 cm－1（w），369 cm－1（w），477 cm－1（s），494 cm－1（w），789 cm－1（w），876 cm－1（vs），1 038 cm－1（s）和1 135 cm－1（w），D廠產(chǎn)品與甘露醇的特征峰強度及位置相一致的個數(shù)為6，可判斷其中含有甘露醇。而原研藥輔料中不含甘露醇，因此判定D廠家生產(chǎn)的是仿冒藥。此方法的優(yōu)勢在于：通過一片藥就可以將可疑樣品與原研藥加以鑒別，具有用量較少、特征明顯、容易鑒別的特點。

3.3 輔料相似的原研藥與仿冒藥鑒別 E、F廠家樣品的拉曼光譜與原研藥較相似，按上述方法，原研藥、E、F廠家與輔料庫中微晶纖維素的相似度值分別為0.954 27、0.953 67、0.818 24，結合查找特征峰，發(fā)現(xiàn)各廠家樣品中均含有微晶纖維素（表1）。

圖1 20種常用片劑藥用輔料拉曼光譜圖

表1 3個廠家樣品和微晶纖維素的特征峰查找結果

主成分分析（PCA）是一種數(shù)學降維技術，運用少數(shù)變量代替處理前的眾多變量，盡可能表達原有信息，以達到提取特征信息的目的。應用SIMCA-P軟件，得到2個主成分PC1和PC2的得分（圖3），反映各樣品的聚集程度［7］。本研究共收集原研藥A絡活喜7個批次，E廠樣品7個批次，F(xiàn)廠樣品6個批次，每批次樣品采集3次，求得各批次的平均光譜。如圖3所示，原研藥的光譜能夠較好地聚在一起，E、F廠樣品與原研藥均有一定距離。

圖2 各廠家苯磺酸氨氯地平片及其主要輔料的拉曼光譜圖

圖3 PCA分析絡活喜與待檢樣品拉曼光譜的得分圖

4 結論

本研究針對“專業(yè)仿冒”——API相同、生產(chǎn)工藝不同的一類仿冒藥。建立基于輔料的仿冒藥鑒別方法，能夠提供部分內(nèi)容物信息，結果快速、準確、可靠，可為快速鑒別仿冒藥提供參考。

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Identification of Norvasc and counterfeit drugs based on Raman spectra of pharmaceutical excipients

QIAN Xiaofeng，LIU Yan，CHEN Hui，LU Feng（Department of Pharmaceutical Analysis，Schoolof Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo build an identificationmethod for Norvascand its counterfeit drugs based on the differences of their pharmaceutical excipientswith the original and generic Am lodipine besylatetablets as tools.MethodsRaman spectra of pharmaceutical excipientswhich were usually used in tabletswere collected.Sim ilarity algorithm and characteristic Raman bands were used to search the excipients contained in the tablets.If the excipients was not the same as excipients contained in Norvasc，the tabletwas judged as counterfeit drugs.Otherw ise，principal component analysiswas used to identify counterfeit and generic.Results and conclusionThemethod based on Raman spectra of pharmaceutical excipients could identify Norvasc and counterfeit drugs efficiently and accurately.

pharmaceutical excipients；Raman spectrum；counterfeit drugs；sim ilarity algorithm；characteristic Raman bands；PCA

R927

A

1006-0111（2015）04-0334-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.012

2014-07-09

2015-01-14［本文編輯］李睿旻

錢小峰，碩士研究生.Tel：13817636166；E-mail：xiaofengtou＠126.com

陸 峰，教授.研究方向：藥物質(zhì)量信息學.E-mail：fenglufeng＠hotmail.com