五味子對冰乙酸性胃潰瘍寒、熱證大鼠模型IL-8、VEGF水平的影響

胡國洪 舒 晴 聶紅海 徐海英

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬清遠(yuǎn)醫(yī)院/清遠(yuǎn)中醫(yī)院病理科，廣州，511500;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬清遠(yuǎn)醫(yī)院/清遠(yuǎn)市中醫(yī)院肛腸普外科，廣州，511500;3廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬清遠(yuǎn)醫(yī)院/清遠(yuǎn)市中醫(yī)院病案統(tǒng)計(jì)室，廣州，511500)

胃潰瘍是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，胃潰瘍的發(fā)生主要是胃黏膜的損害因素與自身防御修復(fù)因素之間的失衡有關(guān)［1］，受到多種因子及其受體的調(diào)控。五味子是一種具有辛、甘、酸、苦、咸五種藥性的果實(shí)，五味俱全、五行相生，能對人體五臟的心、肝、脾、肺、腎發(fā)揮平衡作用，兼具精、氣、神三大補(bǔ)益的藥材［2］。大量研究表明，具有五種藥性的五味子能對人體五臟發(fā)揮積極作用，為了深入探討五味子對于消化系統(tǒng)的平衡作用，了解中醫(yī)方證相應(yīng)理論應(yīng)用于胃潰瘍寒熱證的治療功效，本研究通過聯(lián)合應(yīng)用ELISA、PCR、免疫組化方法檢測五味子對冰乙酸胃潰瘍寒、熱證大鼠模型IL-8、VEGF表達(dá)水平的影響。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性SD大鼠250～300 g 30只，購自上海伊萊克斯動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為五組:即正常對照組6只，模型組(冰乙酸涂抹模型組)6只，五假組(五味子+假手術(shù))6只，五熱酸組(五味子+熱因素+乙酸涂抹)6只、五寒酸組(五味子+寒因素+乙酸涂抹)6只。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 熱因素:先將辣椒粉過120目篩，后溶入60%無水乙醇，配制成8%干辣椒粉的乙醇混懸液。寒因素:電子天平稱取6 g氫氧化鈉(NaOH)，溶入500 mL雙蒸水配制成0.3 mol/L混合液。冰水:冷凍保存，使用時(shí)提前取出解凍。五味子藥湯:購自西安新通制藥有限公司(批號200806)，加8倍量沸水浸泡15 min，過濾;藥渣再加入6倍量沸水浸泡15 min，過濾。將兩次浸泡藥液合并，濃縮成含生藥0.15 g/L，冰箱存儲(chǔ)備用。

1.3 試劑 100%冰乙酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，20081211);VEGF試劑盒(美國RD公司，20081217);IL-8試劑盒(美國RD公司，20081217);醫(yī)用酒精(黑龍江華潤酒精有限公司，20091207);氫氧化鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，20090712)1.4 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(SANYO，型號XD-101);酶標(biāo)儀(BIO-RAD Model，型號550);低溫離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司，型號KDC-40)

1.5 造模方法［3-4］胃熱模型:按10 mL/kg灌服8%干辣椒粉的乙醇混懸液，早晚各1次，連續(xù)7 d。胃寒模型:按10 mL/kg灌服冰水機(jī)0.3 mol/L NaOH溶液，早晚各1次，連續(xù)7 d。冰乙酸涂抹胃潰瘍模型:禁食不禁水24 h，乙醚麻醉后剖腹，拉出全胃于胃底部，用自制胃夾將直接6 mm長2 cm的塑料管固定于上，然后向管內(nèi)注入100%冰乙酸0.1 mL，與腺胃部前壁漿膜接觸60 s后撤去胃夾，用生理鹽水清洗局部，然后牽引大網(wǎng)膜包覆，縫合腹壁切口，常規(guī)消毒，紗布包扎。假手術(shù):實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠用乙醚麻醉，固定于木板上，開腹輕輕拉出全胃，用鑷子或其他手術(shù)器械刺激腺胃部，將結(jié)扎線置于幽門部，但不結(jié)扎，縫合腹腔切口，用生理鹽水清洗創(chuàng)口并消毒。五味子給藥方式:造模術(shù)后24 h開始灌胃給藥，按100 mg/kg每日1次灌胃。正常對照組、灌胃模型組喂予等容積的生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d。

1.6 實(shí)驗(yàn)取材 末次給藥后24 h，頸動(dòng)脈取血，分離血清，剖腹取胃，取適量胃組織，部分用于石蠟包埋用于免疫組化，部分生理鹽水反復(fù)沖洗吸干，稱取0.3～0.4 g研磨制成10%組織勻漿，離心后取上清液，-20℃冰箱保存，待測。

1.7 HE染色、免疫組化 標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，切成4μm厚的切片。蘇木-伊紅法進(jìn)行HE染色。采用免疫組化SP法。即用型UltraSensitive-SP試劑盒，IL-8一抗工作濃度1∶100，VEGF一抗工作濃度1∶500。染色步驟參照說明書進(jìn)行。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，脫水，透明，封片。磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。潰瘍面積的計(jì)算:用油標(biāo)卡尺測量HE染片上潰瘍的橫徑和縱徑，計(jì)算潰瘍面積(UA)，潰瘍面積=×d1×d2×1/4(d1、d2分別為通過潰瘍中心的最大橫徑和縱徑)。免疫組化結(jié)果分析:IL-8、VEGF陽性表達(dá)判定以細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為表達(dá)陽性。每張切片在200倍光鏡下拍10個(gè)視野，采用Motic image advanced 6.0軟件對圖像進(jìn)行分析，以灰度值表示陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度，以陽性著色面積占總面積百分比表示陽性密度。

1.8 ELISA測定血清IL-8及VEGF 按照試劑盒步驟進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用EXCEL軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算濃度。

1.9 RT-PCR 用RNA TRIzol試劑盒提取標(biāo)本的RNA，按說明書操作。抽提RNA經(jīng)過DNase(Promega)處理后，反轉(zhuǎn)錄酶PowerScriptTM Reverse transcriptase(Clontech)合成 cDNA.cDNA引物IL-8:5’ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGC3’(sense)和 5’ATGACTTCCAAGCTGGCCCGTGGC3’(antisense)［5］。擴(kuò)增條件:94℃變性1 min;94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);終止延伸72℃5 min。VEGF:5’AAGATCCGCAGACGTGTAAATGTT3’(sense)和5’CGGCTTGTCACATGCAAGTA3’(antisense)［6］.擴(kuò)增條件:94 ℃變性1 min;94 ℃變性40 sec，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán);終止延伸72℃5 min。所得結(jié)果用Motic image advanced 6.0軟件對圖像進(jìn)行灰度分析實(shí)現(xiàn)對IL-8及VEGF的半定量檢測。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)用(ˉx±s)表示，用單因素方差分析(One-way ANOVA)LSD或S-N-K法進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Spearman等級相關(guān)分析潰瘍面積和IL-8或者VEGF間的相關(guān)程度。

2 結(jié)果

2.1 HE結(jié)果顯示五味子能夠縮小胃潰瘍面積 結(jié)果見圖1、表1。

2.2 免疫組化結(jié)果及分析 免疫組化結(jié)果顯示正常對照組及五假組胃組織中僅見極少量的IL-8陽性表達(dá)，而模型組中的IL-8陽性表達(dá)明顯增多，而五味子灌胃治療后，寒、熱證胃潰瘍大鼠胃內(nèi)IL-8的陽性表達(dá)均有所減少(見圖2)。免疫組化結(jié)果顯示正常對照組及五假組胃組織中有少量VEGF陽性表達(dá)，而模型組中的VEGF陽性表達(dá)則增多，經(jīng)過五味子灌胃治療后，胃潰瘍大鼠胃內(nèi)VEGF的陽性表達(dá)均更加明顯(見圖3)對各組免疫組化結(jié)果圖按前述的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表2。

圖3 各組胃部切片VEGF免疫組化結(jié)果比較

圖1 各組胃部切片HE染色比較

表1 各組胃潰瘍面積的比較(ˉx±s)

表2 各組大鼠IL8、VEGF免疫組化結(jié)果分析

2.3 ELISA結(jié)果 模型組中的IL-8表達(dá)量顯著高于正常組(P＜0.01)，而五味子能夠下調(diào)乙酸涂抹胃潰瘍寒熱證模型的IL-8表達(dá)(P＜0.05)。模型組中VEGF的表達(dá)水平較正常組升高(P＜0.01)，而五味子灌胃治療則進(jìn)一步促進(jìn)VEGF的表達(dá)(P＜0.01)。(表3)

表3 各組大鼠血清中IL-8及VEGF表達(dá)水平比較(ˉx±s，pg/mL)

圖2 各組胃部切片IL-8免疫組化結(jié)果比較

2.4 PCR定量結(jié)果 模型組中的IL-8 mRNA數(shù)顯著高于正常組(P＜0.01)，而五味子治療能夠減少乙酸涂抹胃潰瘍寒熱證模型的IL-8mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。模型組中VEGF mRNA的表達(dá)量較正常組增高(P＜0.01)，而五味子灌胃治療則進(jìn)一步促進(jìn)VEGF的表達(dá)(P＜0.01)。見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-8及VEGF RTPCR結(jié)果OD值比較(ˉx±s)

3 討論

胃潰瘍是常見的消化系統(tǒng)疾病，是我國人群中的常見病、多發(fā)病之一。引起潰瘍的常見病因主要有幽門螺桿菌感染、非甾體抗炎藥(如阿司匹林)以及胃酸分泌異常［7］。研究表明，正常人胃黏膜的防御修復(fù)機(jī)制，足以平衡胃酸和胃蛋白酶的損傷作用，但當(dāng)某些致病因素?cái)_亂胃黏膜的平衡后，胃酸和胃蛋白酶侵蝕自身黏膜組織，從而形成胃潰瘍［8］。五味子是一種具有辛、甘、酸、苦、咸五種藥性的果實(shí)，含有豐富的有機(jī)酸、維生素、類黃酮、植物固醇以及有強(qiáng)效復(fù)原作用的木酚素，能夠抑制胃酸分泌，抑制胃蛋白酶活性，從而減少胃酸和胃蛋白酶對胃黏膜的損傷作用;而從中醫(yī)學(xué)的角度，胃潰瘍寒熱證致使胃氣陰兩傷，五味子性溫且益氣生津，這些均暗示著五味子用于治療胃潰瘍的可行性。此次研究證實(shí)了，應(yīng)用五味子灌胃后，寒熱證胃潰瘍大鼠模型中的潰瘍面積均有不同程度的減小(P＜0.05)，說明五味子能夠?qū)ξ笣兊男纬善鸬揭种菩宰饔?。但是對于五味子的最佳用量、給藥方式等還有待進(jìn)一步探討。

胃潰瘍的一個(gè)特點(diǎn)是大量的炎性細(xì)胞浸潤，這些炎性細(xì)胞之間通過釋放炎性因子彼此之間構(gòu)成復(fù)雜的炎性網(wǎng)絡(luò)。IL-8在胃潰瘍的致病機(jī)制中起到十分重要的作用，俄而抑制IL-8的表達(dá)無疑能夠?qū)ρ仔跃W(wǎng)絡(luò)的蔓延起到抑制性作用。本次研究通過ELISA、PCR、免疫組化等多種手段對不同組血清或組織勻漿重的IL-8水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)模型組中IL-8的表達(dá)對照正常組顯著上升，這與之前的多數(shù)研究意一致，而通過五味子灌胃治療，無論是在寒證還是熱證胃潰瘍胃潰瘍模型中，IL-8的表達(dá)均收到抑制，并且相關(guān)性研究顯示，五味子對胃潰瘍面積的縮小作用與其對IL-8表達(dá)的抑制作用呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，說明五味子對胃潰瘍的抑制性作用很可能是通過其對IL-8的表達(dá)抑制實(shí)現(xiàn)。

VEGF屬于內(nèi)源性生長因子家族，能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)血管的形成，提高血管的通透性［10］。VEGF主要由主要由損傷處的角質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠保護(hù)胃黏膜和通過刺激腺體和血管生成促進(jìn)潰瘍愈合，其受體僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。血管內(nèi)皮生長因子在生理和病理?xiàng)l件下均有表達(dá)，但在病理?xiàng)l件下表達(dá)量增加。這與本次課題的研究結(jié)果一致，而通過五味子灌胃后，VEGF的表達(dá)量又進(jìn)一步上升，VEGF的表達(dá)水平和潰瘍處的血管生長情況呈正相關(guān)，可用于胃潰瘍寒熱證治療效果的評價(jià)。五味子對胃潰瘍面積的縮小作用與其對VEGF表達(dá)的促進(jìn)作用呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，更進(jìn)一步證實(shí)了五味子對胃潰瘍的積極療效。

五味子能夠改善冰乙酸性胃潰瘍寒、熱證大鼠模型胃潰瘍黏膜面積，可能通過下調(diào)IL-8的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)VEGF的表達(dá)有關(guān)。此次研究證實(shí)了五味子對冰乙酸胃潰瘍寒熱證的治療功效。揭示五味子應(yīng)用于消化系統(tǒng)的臨床前景，以及中醫(yī)方證相應(yīng)的理論依據(jù)。然后，其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步探討和證實(shí)。

［1］王兆彬.106例消化性潰瘍臨床觀察［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2012，7(24):92-93.

［2］蘇桂云，郭紅星.五味子的炮制與功效［J］.首都醫(yī)藥，2012，19(11):44.

［3］才麗平，蔣寧，曲怡，等.胃粘膜表面局部投予乙酸制備大鼠胃潰瘍模型的方法［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2011，17(1):8-11，15.

［4］李冀，柴劍波，李勝智，等.寒熱方劑對幽門結(jié)扎型胃潰瘍寒熱證模型大鼠炎癥因子含量的影響［J］.陜西中醫(yī)，2011，32(11):1553-1555.

［5］Sharma SA，Tummuru MK，Miller gg，et al.Interleukin-8 response of gastric epithelial cell lines to Helicobacter pylori stimulation in vitro［J］.Infect Immun，1995，63(5):1681.

［6］李茜，韓曼麗，楊學(xué)文，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠 VEGF mRNA方法的建立及初步應(yīng)用［J］.分子診斷與治療雜志，2010(2):115-118.

［7］孟鈺.復(fù)方嗜酸乳桿菌聯(lián)合雷貝拉唑治療消化性潰瘍的療效觀察［J］.中國醫(yī)藥指南，2012，10(18):610-611.

［8］潘文，許麗娜.消化性潰瘍296例三、四聯(lián)療法對比分析［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，41(9):1253-1254.

［9］Fujiwara Y，Arakawa J，F(xiàn)ukuda T，et al.Interleukin-8 stimulates leukocyte migration across a monolayer of cultured rabbit gastric epithelial cells［J］.Dig Dis Sci，1997，42(6):1210.

［10］徐晶晶，黃萍，吳清和，等.胃瘍寧丸抗實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的藥效及機(jī)制研究［J］.中國中藥雜志，2013，38(5):736.