補(bǔ)體因子D及脂聯(lián)素在子癇前期孕婦胎盤組織 血清及尿液中的表達(dá)及相關(guān)性研究

潘亞萍，漆洪波，羅 欣，劉西茹（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，重慶400016）

子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種，指妊娠20周以后出現(xiàn)的以高血壓和蛋白尿?yàn)樘攸c(diǎn)的一種全身性疾病，迄今為止仍是我國孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的重要原因。既往研究證實(shí)，子癇前期與成人代謝綜合征有諸多共同的病理生理特征，包括脂肪代謝異常、胰島素抵抗和血液高凝狀態(tài)，而這些異常狀態(tài)可能與脂肪細(xì)胞因子的異常分泌相關(guān)，包括瘦素、脂聯(lián)素（ADPN）、補(bǔ)體因子D（CFD）等[1-2]。子癇前期患者血清中ADPN水平降低，而CFD水平及其與ADPN的關(guān)系如何尚不清楚。本研究通過檢測子癇前期孕婦胎盤組織、血清及尿液中CFD以及ADPN的水平，探討其與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2014年3～9月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科住院行剖宮產(chǎn)術(shù)的子癇前期孕婦29例（子癇前期組），診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版全國統(tǒng)編教材，以及正常足月妊娠行擇期剖宮產(chǎn)術(shù)的孕婦30例（正常妊娠組）為研究對象。兩組均為單胎妊娠；既往無高血壓、心臟病、腎臟病、糖尿病及甲狀腺功能亢進(jìn)等病史；無復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、畸胎、死胎等不良孕產(chǎn)史；無吸煙、長期服用藥物史。孕期無急、慢性感染性疾?。惶簾o畸形。兩組孕婦年齡、體質(zhì)量指數(shù)、孕產(chǎn)次、孕周、新生兒性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 入院后，于治療及分娩前取孕婦的清潔中段尿4 mL，經(jīng)4℃低溫離心后將上清液移出。同時(shí)抽取孕婦空腹外周肘靜脈血5 mL，離心分離收集血清。血清及尿液樣品均轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待測。剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤娩出后5 min內(nèi)，避開肉眼可見的鈣化灶及壞死區(qū)，取胎盤母體面中央組織約1.0 cm3大小，PBS漂洗后立即置于液氮中保存，過夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 Western blotting檢測胎盤組織CFD、ADPN蛋白的表達(dá) 嚴(yán)格按照蛋白提取試劑盒（海門碧云天生物技術(shù)研究所）說明書提取胎盤組織總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度（南京凱基生物技術(shù)研究所）。行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（美國Millipore公司），置于含5%脫脂奶粉、0.1%吐溫-20的枸櫞酸鹽緩沖液中，室溫封閉1 h后，分別加入兔抗人CFD、ADPN單隆抗體（稀釋濃度分別為 1∶500 和 1∶1 000，美國 Abacm 公司，美國Santa Cruz公司）、兔抗人β-actin單克隆抗體（稀釋濃度為 1∶1000，美國 Santa Cruz公司），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（稀釋濃度為1∶1 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）二抗，室溫孵育1 h。加入ECL顯色液（南京凱基生物技術(shù)有限公司），利用ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）檢測蛋白質(zhì)印跡條帶灰度，用Quantity One 4.6.2版圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 血清及尿液中CFD、ADPN水平檢測 采用ELISA分別檢測CFD和ADPN的水平。CFD ELISA檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，ADPN ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美生物有限公司，操作按說明書進(jìn)行。所有標(biāo)本均行3個(gè)復(fù)孔檢測且為同批測定，取平均值為最終濃度，批內(nèi)變異小于0.5%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以ss表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，兩變量之間的相關(guān)關(guān)系用Spearsman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組孕婦胎盤組織中CFD與ADPN表達(dá)水平比較 子癇前期組孕婦胎盤組織中CFD水平較正常妊娠組明顯升高，而ADPN水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或 0.01），見圖 1。兩組 Western blotting 結(jié)果見圖2。

圖1 兩組蛋白相對表達(dá)量比較

圖2 Western blotting結(jié)果

2.2 兩組孕婦血清中CFD與ADPN的水平比較 子癇前期組孕婦血清中的CFD水平顯著高于正常妊娠組，而血清中ADPN的水平顯著低于正常妊娠組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 兩組孕婦血清CFD與ADPN水平比較（ss）

表1 兩組孕婦血清CFD與ADPN水平比較（ss）

注：與正常妊娠組比較，aP＜0.05。

組別子癇前期組正常妊娠組n CFD（μg/mL）ADPN（ng/mL）29 30 1.83±0.59a 0.67±0.04 13.16±2.01a 80.68±1.27

2.3 兩組孕婦尿液中CFD與ADPN的水平比較 子癇前期組孕婦尿液中的CFD水平顯著高于正常妊娠組，而ADPN水平顯著低于正常妊娠組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表 2。

表2 兩組孕婦尿液中CFD與ADPN水平比較（ss，ng/mL）

表2 兩組孕婦尿液中CFD與ADPN水平比較（ss，ng/mL）

注：與正常妊娠組比較，aP＜0.05。

子癇前期組正常妊娠組ADPN 29 30 174.95±23.61a 43.27±16.59 2.40±0.86a 9.29±1.33

2.4 子癇前期孕婦胎盤組織、血清及尿液中CFD與ADPN的相關(guān)性 子癇前期孕婦胎盤組織中，CFD與ADPN 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.82，P＜0.05），血清中 CFD和 ADPN 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.78，P＜0.05），在尿液中，二者的關(guān)系也呈負(fù)相關(guān)（r=-0.63，P＜0.05）。而在正常妊娠組中，胎盤組織、血清及尿液中的CFD與ADPN水平均無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 子癇前期與代謝綜合征 代謝綜合征是以中心性肥胖、糖脂代謝紊亂、高血壓為主要臨床特點(diǎn)的一組嚴(yán)重影響健康的臨床綜合征，是引發(fā)心、腦血管事件的高危因素，也是成人致死和致殘的主要原因[3]。近年來越來越多的證據(jù)顯示，子癇前期與代謝綜合征具有密切的關(guān)聯(lián)，而且二者在發(fā)病機(jī)制和遠(yuǎn)期后遺癥方面都存在明顯的相似性，例如都存在胰島素抵抗、血管內(nèi)皮功能紊亂、高尿酸血癥、高半胱氨酸血癥及血栓前狀態(tài)等[4-5]。因此有學(xué)者提出，妊娠期高血壓疾病尤其是子癇前期可稱之為妊娠期代謝綜合征[6]。早期識(shí)別妊娠期代謝綜合征有助于定義該類群體，因?yàn)檫@些女性不僅易發(fā)展為妊娠相關(guān)疾病狀態(tài)，例如妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病等，發(fā)生不良圍生期結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，而且其將來發(fā)生代謝性疾病和心血管疾病的危險(xiǎn)性也顯著增加[7]。近20年來對糖類及脂肪在妊娠期間代謝機(jī)制的傳統(tǒng)觀念正在不斷地被修正，由此發(fā)現(xiàn)的一些脂肪因子，如瘦素、抵抗素、ADPN等，證實(shí)對妊娠期婦女的糖脂代謝存在不同程度的影響。而這些影響不僅作用于孕婦本身，對胎嬰兒亦具有較大的影響[8]，這也符合“成人疾病胎兒起源學(xué)說（DoHAD）”的觀念，亟須引起產(chǎn)科學(xué)者重視。

3.2 CFD與子癇前期 CFD又稱為降脂素，是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的脂肪分泌蛋白，既往發(fā)現(xiàn)其在肥胖的嚙齒類動(dòng)物中表達(dá)降低，但并未引起廣泛關(guān)注[9]。CFD是胰凝乳蛋白酶的絲氨酸蛋白酶家族的成員之一，參與調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活的替代途徑的關(guān)鍵步驟，并刺激三酰甘油在脂肪細(xì)胞中的積累，從而抑制脂肪分解。?；碳さ鞍鬃鳛橐环N補(bǔ)體蛋白，經(jīng)酶反應(yīng)產(chǎn)生，其由脂肪組織分泌，在調(diào)節(jié)脂肪代謝和能量平衡方面發(fā)揮重要作用。一方面提高脂肪細(xì)胞捕獲脂肪酸和合成三酰甘油的能力；另一方面通過抑制激素敏感脂酶的活性來抑制三酰甘油的分解。而在其形成過程中需要一種補(bǔ)體成分——CFD的參與[10]。越來越多的研究證實(shí)，CFD與肥胖、胰島素抵抗、血脂異常及心血管疾病的發(fā)生呈正相關(guān)。這與本研究結(jié)果類似，在具有胰島素抵抗及血脂代謝異常的子癇前期孕婦的血清及尿液中，CFD的水平顯著高于正常妊娠者，由此提示，CFD的異常表達(dá)可能是引發(fā)子癇前期一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

值得關(guān)注的是，CFD作為一個(gè)新的指標(biāo)，已經(jīng)被證實(shí)在宮頸鱗癌、胃腸道惡性腫瘤、口腔鱗癌等疾病中存在異常表達(dá)[11]。由于胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞類似的侵襲能力[12]，而本研究顯示，CFD在子癇前期胎盤組織中存在異常的表達(dá)升高，因此，CFD是否作用于子癇前期的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，參與調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力損傷，從而造成“胎盤淺著床”，最終引發(fā)子癇前期，值得進(jìn)一步研究。

3.3 ADPN與子癇前期 ADPN又稱為ACRP30，是由脂肪細(xì)胞分泌的一種特異性蛋白。ADPN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子，有降低三酰甘油和血糖水平、改善胰島素抵抗、保護(hù)血管內(nèi)皮和抑制動(dòng)脈粥樣硬化等作用[13]。在肥胖者血清中，ADPN水平明顯降低，并且其水平與體質(zhì)量指數(shù)、脂肪百分比、腰臀比有著顯著的相關(guān)性[14]。Machado等[15]發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者血漿中ADPN水平明顯低于正常孕婦，而重度子癇前期降低更明顯，并且血漿ADPN水平與孕婦年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)、收縮壓和尿蛋白成負(fù)相關(guān)。而另一項(xiàng)研究也證實(shí)，子癇前期患者的胎盤中ADPN及其受體存在異常的表達(dá)及調(diào)節(jié)[16]。本研究結(jié)果也表明，ADPN在子癇前期患者的胎盤組織、血清和尿液中的水平明顯下降，與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)通過相關(guān)性分析證實(shí)，在子癇前期孕婦的胎盤組織、血清和尿液中的CFD與ADPN水平均呈顯著負(fù)相關(guān)性，但其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。同時(shí)低脂聯(lián)素血癥和高降脂素血癥是否能作為敏感的子癇前期危險(xiǎn)因子和判斷病情預(yù)后的重要指標(biāo)，還需大樣本的進(jìn)一步研究。需重點(diǎn)指出的是，由于尿液檢測的方便性和無創(chuàng)性，聯(lián)合檢測孕婦尿液中的CFD與ADPN水平，有望成為一種新型、高效的預(yù)測早期診斷子癇前期的方法。

子癇前期的發(fā)生是一個(gè)多因素、分階段動(dòng)態(tài)發(fā)展的過程，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，而與糖脂代謝紊亂相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。本研究通過檢測子癇前期及正常晚期妊娠孕婦胎盤組織、血清及尿液中CFD與ADPN水平，初步探討了二者在子癇前期發(fā)病中的作用，以期為子癇前期發(fā)病機(jī)制提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。同時(shí)依據(jù)二者在尿液中的異常表達(dá)，有望為子癇前期的早發(fā)現(xiàn)、早診斷提供新的預(yù)警機(jī)制。

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