高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離篩選及多樣性分析

胡甜　江林峰　陳青云等

摘要：采用生長(zhǎng)曲線指導(dǎo)的富集培養(yǎng)法，從生活污水排放渠中分離篩選出高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌，并對(duì)其多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，從分離得到的27株異養(yǎng)硝化細(xì)菌中篩選出6株高效菌株Ni1-2、Ni1-8、Ni2-5、Ni2-7、Ni3-1和Ni3-4，其48 h氨氮去除率分別為88.9%、76.6%、87.7%、93.1%、99.2%和91.4%；結(jié)合菌落形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)、掃描電鏡觀察和16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株的種類較為豐富，初步確定Ni1-2和Ni1-8為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter），Ni2-5和Ni3-1為產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes），Ni2-7為無(wú)色桿菌屬（Achromobacter），Ni3-4為芽孢桿菌屬（Bacillus）。該結(jié)果可為高效異養(yǎng)硝化菌的分離篩選及其多樣性分析提供參考。

關(guān)鍵詞：異養(yǎng)硝化；節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）；產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）；無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）；芽孢桿菌屬（Bacillus）

中圖分類號(hào)：X703 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1181-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.039

Abstract：High-efficient heterotrophic nitrifying bacterial strains were isolated from sewage ditches after enrichment and cultivation guided by growth curves. The diversity of these bacterial strains was analyzed. Six strains named as Ni1-2， Ni1-8， Ni2-5， Ni2-7， Ni3-1 and Ni3-4 were screened from 27 isolates for their high-efficient heterotrophic nitrification. The NH4+-N removal ratio of the six strains within 48 h reached 88.9%， 76.6%， 87.7%， 93.1%， 99.2% and 91.4%， respectively. Based on colony morphology observation， Gram stain， scanning electron microscope observation and homology analysis of 16S rDNA sequence， the six strains had diversity. Ni1-2 and Ni1-8 were identified as Arthrobacter. Ni2-5 and Ni3-1 were identified as Alcaligenes. Ni2-7 was identified as Achromobacter and Ni3-4 was identified as Bacillus. It will provide technical support for screening high-efficient heterotrophic nitrifying bacterial strains and studing their biodiversity.

Key words：Heterotrophic nitrification；Arthrobacter；Alcaligenes；Achromobacter；Bacillus

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和人民生活水平的提高，未經(jīng)適當(dāng)處理的含氮廢水，如生活污水、工業(yè)、種植業(yè)及禽畜養(yǎng)殖業(yè)廢水等，大量排放入江河湖泊，造成了越來(lái)越嚴(yán)重的水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題，危害到農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、旅游業(yè)等諸多行業(yè)，對(duì)飲水衛(wèi)生和食品安全也構(gòu)成了巨大威脅。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在脫氮微生物菌株的篩選和培育研究方面非?；钴S，一些異養(yǎng)硝化菌、好氧反硝化菌、自養(yǎng)反硝化菌、厭氧氨氧化菌等非傳統(tǒng)脫氮微生物不斷被發(fā)現(xiàn)[1-4]，為研究開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的氮污染物凈化技術(shù)提供了新的理論和思路。

異養(yǎng)硝化菌是指在好氧條件下能將氨氮或還原態(tài)有機(jī)態(tài)氮氧化成羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的一類微生物[5]。異養(yǎng)硝化微生物的發(fā)現(xiàn)，是對(duì)傳統(tǒng)硝化理論的豐富與突破，特別是一些異養(yǎng)硝化微生物同時(shí)具有好氧反硝化的特性，可實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化的全新脫氮工藝[6]。因此，異養(yǎng)硝化微生物的重要性日益受到關(guān)注[7-10]。

異養(yǎng)硝化微生物種類繁多，分布于藻類、放線菌、真菌和細(xì)菌中[7]。由于其遺傳背景的差異性，不同的異養(yǎng)硝化微生物的生長(zhǎng)及硝化特點(diǎn)都有所不同[6]。并且異養(yǎng)硝化菌可以利用的基質(zhì)范圍廣泛，如銨、胺、酰胺、N-烷基羥胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等，這使得異養(yǎng)硝化機(jī)理到目前仍不清楚，其代謝途徑也未被確定和證實(shí)[11]。從自然環(huán)境中分離不同的異養(yǎng)硝化菌，對(duì)研究異養(yǎng)硝化途徑和異養(yǎng)硝化微生物多樣性，以及開(kāi)發(fā)新型高效脫氮工藝具有重要意義。為此，本研究通過(guò)四級(jí)富集培養(yǎng)法從生活污水排放渠中分離篩選高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌，分析其多樣性，為異養(yǎng)硝化菌的理論研究和應(yīng)用研究提供材料。

1 材料和方法

1.1 環(huán)境樣品

采集排污溝渠距水面10 cm處的水樣以及其附近10 cm深度的土樣。采樣后立即用于異養(yǎng)硝化細(xì)菌的篩選。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（pH 7.0）：C6H5O7Na3 5.00 g，（NH4）2SO4 1.24 g，KH2PO4 1.00 g，Na2HPO4 7.85 g，NaCl 0.50 g，MgSO4 0.05 g，微量元素溶液[12] 1 mL，補(bǔ)充去離子水至1 L。用于異養(yǎng)硝化菌的富集培養(yǎng)。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基（pH 7.0）：C6H5O7Na3 7.50 g，（NH4）2SO4 0.66 g，Na2HPO4 3.7 g，其余成分同富集培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂。用于異養(yǎng)硝化菌的分離純化及氨氮去除能力研究。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（pH 7.2）：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，補(bǔ)充去離子水至1 L。固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂。用于菌株的形態(tài)觀察、保存及活化。

1.3 異養(yǎng)硝化菌的篩選

1.3.1 富集培養(yǎng) 取土樣10 g或水樣10 mL加入到90 mL含有玻璃珠的無(wú)菌水中，震搖30 min使樣品充分分散。取上清5 mL接種到95 mL富集培養(yǎng)基中，于30 ℃，160 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定富集液的OD600 nm繪制生長(zhǎng)曲線，在穩(wěn)定期初期轉(zhuǎn)接20 mL培養(yǎng)液至80 mL新鮮的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次。富集期間定期檢測(cè)培養(yǎng)液中氨氮含量，若氨氮顯著減少，表示富集液中含有硝化微生物，可用于后續(xù)分離純化試驗(yàn)。

1.3.2 分離純化 取富集培養(yǎng)液作梯度稀釋，涂布固體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取不同形態(tài)的菌落接種到液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，30 ℃震蕩培養(yǎng)36 h，檢測(cè)培養(yǎng)液中氨氮的含量，將氨氮去除率較高的培養(yǎng)液再次稀釋涂布平板進(jìn)行分離和篩選，直到得到氨氮去除效果較好的純培養(yǎng)菌株。

1.4 菌株的多樣性分析

1.4.1 形態(tài)觀察 將分離得到的菌株涂布牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)以及掃描電子顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)。

1.4.2 16S rDNA的PCR擴(kuò)增、測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA作為模板，采用通用引物[13] 27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）進(jìn)行16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（50 μL）：10×Pfu Buffer 5 μL， 2.5 mmol/L dNTP 2 μL， 10 μmol/L引物各2.0 μL， 基因組DNA 50 ng，Pfu DNA聚合酶 2 U，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。測(cè)序所獲序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，下載部分相似性高的序列及一些常見(jiàn)的異養(yǎng)硝化細(xì)菌和自養(yǎng)硝化細(xì)菌的16S rDNA序列，利用MEGA 5.1軟件中基于Kimura 2-parameter模型的Neighbour-joining （NJ）鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[14]。

1.5 氨態(tài)氮（NH4+-N）的檢測(cè)

定性檢測(cè)：取600 μL待測(cè)樣品于比色板上，滴加50 μL鈉氏試劑，呈黃色，則培養(yǎng)液中含氨氮，顏色越深，氨氮含量越高。

定量檢測(cè)：采用國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)氨氮的測(cè)定—鈉氏試劑分光光度法》（HJ 535-2009）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

通過(guò)生長(zhǎng)曲線指導(dǎo)的四級(jí)富集培養(yǎng)得到氨氮?dú)埩袅枯^少的培養(yǎng)液，對(duì)稀釋后的培養(yǎng)液進(jìn)行涂布平板分離和連續(xù)多次劃線純化，成功獲得具有異養(yǎng)硝化能力的異養(yǎng)型菌株共27株，分別編號(hào)為Ni1-1—Ni1-13，Ni2-1—Ni2-9，Ni3-1—Ni3-5。

2.2 菌株的篩選

將分離純化后的菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，各取600 μL培養(yǎng)液于白色的比色板上，用定性檢測(cè)方法檢測(cè)氨氮的去除情況，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，菌株Ni1-2、Ni1-8、Ni2-5、Ni2-7、Ni3-1、Ni3-4培養(yǎng)液用納氏試劑顯色后顏色較淺，表明培養(yǎng)液中氨氮?dú)埩袅枯^少，這6株菌株的異養(yǎng)硝化能力較強(qiáng)。

2.3 菌株的氨氮去除率

將篩選得到的6株異養(yǎng)硝化能力較強(qiáng)的菌株接種于液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，30 ℃ 60 r/min搖床培養(yǎng)48 h， 檢測(cè)氨氮濃度的變化， 結(jié)果顯示6株菌株的氨氮去除效果較好（表2），氨氮去除率為76.6%～99.2%。

2.4 菌株的多樣性分析

2.4.1 形態(tài)學(xué)分析 將活化后的菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)2 d后，分別觀察其菌落形態(tài)、菌體細(xì)胞形態(tài)和革蘭氏染色反應(yīng)。結(jié)果顯示，6株菌株在菌落大小、顏色、形狀、邊緣、表面光澤、透明程度、以及菌體細(xì)胞大小和形態(tài)方面的差異明顯（表3，圖1和圖2），呈現(xiàn)出較好的多樣性。

2.4.2 16S rDNA序列分析 用引物27F和1492R對(duì)6株菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，均得到長(zhǎng)約為1.5 kb的16S rDNA序列，將所獲序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)見(jiàn)表4。用BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)Ni1-2、Ni1-8、Ni2-5、Ni2-7、Ni3-1、Ni3-4的16S rDNA序列分別與Arthrobacter sp. 5118 （JX566636）、Arthrobacter sp. W1（EU339930）、Alcaligenes faecalis TZQ4 （HQ143627.1）、Achromobacter sp. SR4（KC577545）、Alcaligenes faecalis B_IV_2L10 （JF710956.1）、Bacillus licheniformis CGMCC 2876 （GQ148817.1）的一致性均達(dá)98%以上（表4）。利用MEGA5.1軟件中基于Kimura2-parameter模型的Neighbour-joining （NJ）鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。從圖3可知，6株菌株聚為4個(gè)類群，其中Ni1-2和Ni1-8與節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的親緣關(guān)系較近，Ni3-4與芽孢桿菌屬（Bacillus）的親緣關(guān)系較近，Ni2-7與無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）的親緣關(guān)系較近，Ni2-5和Ni3-1與產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）的親緣關(guān)系較近。

3 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)氮循環(huán)理論認(rèn)為，執(zhí)行硝化作用的微生物是一群生長(zhǎng)緩慢的化能自養(yǎng)型硝化細(xì)菌[10]。自1949年Quastel等[15]以丙酮肟作為選擇性培養(yǎng)基，首次分離獲得異養(yǎng)硝化菌株以來(lái)，異養(yǎng)硝化微生物和異養(yǎng)硝化作用引起研究者們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，與自養(yǎng)硝化細(xì)菌相比，雖然異養(yǎng)硝化細(xì)菌單位菌體的硝化活性低，但其生長(zhǎng)速率快，在有大量有機(jī)物存在條件下，對(duì)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物的競(jìng)爭(zhēng)比自養(yǎng)細(xì)菌強(qiáng)，容易成為優(yōu)勢(shì)菌，而且異養(yǎng)硝化細(xì)菌對(duì)高濃度氨氮的耐受性強(qiáng)[10，16]，因此異養(yǎng)硝化細(xì)菌對(duì)污水中氨氮的凈化作用不可小覷。

本研究在富集培養(yǎng)異養(yǎng)硝化細(xì)菌時(shí)，用生長(zhǎng)曲線指導(dǎo)富集培養(yǎng)的時(shí)間，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)接，使自養(yǎng)硝化菌來(lái)不及充分生長(zhǎng)而快速被淘汰，從而增加分離異養(yǎng)硝化菌的成功率。在初篩時(shí)，以鈉氏試劑為指示劑對(duì)氨氮進(jìn)行定性檢測(cè)，在操作上簡(jiǎn)單快速，可大大提高篩選效率。

目前報(bào)道的異養(yǎng)硝化細(xì)菌有糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）[17]、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）[18]、惡臭假單胞菌（P. putida）[19]、醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）[1]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[20]、泛養(yǎng)硫球菌（Thiosphaera pantotropha）[21]、球形節(jié)桿菌（Arthrobacter globiformis）[22]、脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans）[23]等。通過(guò)16S rDNA序列分析，本研究從1份環(huán)境樣品中篩選得到4個(gè)不同屬的高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌共6株，結(jié)合菌落形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)、掃描電鏡觀察和16s DNA序列的比對(duì)分析，初步確定Ni1-2和Ni1-8為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter），Ni2-5和Ni3-1為產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes），Ni2-7為無(wú)色桿菌屬（Achromobacter），Ni3-4為芽孢桿菌屬（Bacillus），菌株的種類較為豐富。該結(jié)果可為高效異養(yǎng)硝化菌的獲得及其多樣性分析提供參考。

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