缺氧及復(fù)氧對(duì)hepG2細(xì)胞STC-1和STC-2的mRNA表達(dá)影響

吳子安, 譚志容, 徐 寧, 李 濤, 李 曼, 尹芳芳

(1. 廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院, 廣東 廣州 510370； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院, 廣東 廣州 510405)

缺氧及復(fù)氧對(duì)hepG2細(xì)胞STC-1和STC-2的mRNA表達(dá)影響

吳子安1, 譚志容2, 徐 寧1, 李 濤1, 李 曼1, 尹芳芳2

(1. 廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院, 廣東 廣州 510370； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院, 廣東 廣州 510405)

目的:研究缺氧及復(fù)氧對(duì)hepG2細(xì)胞STC-1和STC-2的mRNA表達(dá)影響。方法:用化學(xué)缺氧劑氯化鈷模擬缺氧環(huán)境,用RT-PCR法分別檢測(cè)在hepG2細(xì)胞缺氧和復(fù)氧條件下STC-1、STC-2的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果:在hepG2細(xì)胞中,STC-1 mRNA無論在缺氧還是復(fù)氧情況下,幾乎不表達(dá)；STC-2 mRNA在缺氧條件下表達(dá)升高,并隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而升高,復(fù)氧后表達(dá)又降低,并隨復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)而恢復(fù)至正常。結(jié)論:STC-2與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。

hepG2細(xì)胞; 人斯鈣素-1; 人斯鈣素-2; 缺氧; 復(fù)氧

近年來腫瘤發(fā)病率不斷升高,早期的發(fā)現(xiàn)、診斷和治療可降低死亡率、有效改善預(yù)后。因此,尋找合適的腫瘤標(biāo)志物一直是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。隨著對(duì)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制了解的不斷深入,對(duì)多種信號(hào)通路和生物大分子在腫瘤中作用的確立,新的腫瘤標(biāo)志物不斷出現(xiàn)。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物有上百種,但缺乏高敏感性和高特異性,真正能夠用于臨床的相當(dāng)有限。人斯鈣素(human stanniocalcin,hSTC)是近年來比較受關(guān)注的潛在腫瘤標(biāo)志物之一,很多圍繞hSTC功能或作為腫瘤標(biāo)志物可行性的研究已經(jīng)展開。

斯鈣素(stanniocalcin,STC)是一種糖蛋白激素,由Stannius首先在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)[1]。人類STC家族(hSTC)由STC-l和STC-2組成,以旁分泌和自分泌的方式參與機(jī)體的多種生理功能[2]。隨著對(duì)STC研究的深入,不斷有研究表明 STC 的表達(dá)與人類癌癥的發(fā)展過程相關(guān)[3]。缺氧是腫瘤細(xì)胞生存環(huán)境的常態(tài)。研究證明缺氧刺激可以促使包括結(jié)腸癌、鼻咽癌、卵巢癌在內(nèi)的多種人類癌細(xì)胞的STC-1基因表達(dá)。本研究意在探索肝癌細(xì)胞中氧含量的變化對(duì)STC表達(dá)的影響,評(píng)價(jià)STC能否成為肝癌早期檢測(cè)的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肝癌細(xì)胞株 (hepG2)來自本實(shí)驗(yàn)室,gibico DMEM培養(yǎng)基,hyclone胎牛血清,gibco胰酶,氯化鈷。

Thermo紫外分光光度計(jì)、Thermo臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、sartorius天平、ABI梯度PCR儀、ROCHE逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；STC-1上游引物為5-CAAACCCAACTAAGCCAGGA-3,下游為5-CAGCAAACACAAGACGAAGC-3,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為320bp；STC-2上游引物為5-CCAAATCCAATCCCAGTCTT-3,下游為5-ACTCAGCAACGCAGGAGAAT-3,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為333bp；GAPDH作為內(nèi)參照,其引物為上游5-GGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3和下游5-CAAATGAGCCCCAGCCTTC-3,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為330bp; HIF-1上游引物為5-CTCAAAGTCGGACAGCCTCA-3,下游為5-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT-3,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為441bp；VEGF-A上游引物為5-CTCTACCTCCACCATGCCAAGT-3,下游為5-ATCTGGTTCCCGAAACCCTGAG-3,擴(kuò)增片段有兩條,長(zhǎng)度為VEGF121 445bp,VEGF165 577bp,引物委托Invitrogen 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞用含10%的FBS的DMEM培養(yǎng)基在12孔板中培養(yǎng)。將第一孔設(shè)為對(duì)照組,其余孔分別加氯化鈷溶液至終濃度為200 μmol/L,置于培養(yǎng)箱中37 ℃、5%二氧化碳中培養(yǎng)。

1.2.2 計(jì)時(shí)提取RNA

分別在加氯化鈷1、3、6、12、24 h及復(fù)氧1h、3h、6h、12h時(shí)用TRIzol 試劑以硫氰酸胍-酚-氯仿法提取總RNA。

1.2.3 RNA濃度及純度檢測(cè)

提取的RNA沉淀用20μL的DEPC水溶解,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A280/A260值、RNA純度(比值均在1.8～2.0之間)及含量計(jì)算。

1.2.4 RT-PCR及PCR

逆轉(zhuǎn)錄步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作為在冰上取總RNA 1μg、Oligo(dT )1 μL,加DEPC水將體積補(bǔ)至13 μL于0.2 mL微量離心管中。瞬時(shí)離心后置PCR儀中65 ℃、10 min；再置于冰上5 min,分別加入5×buffer 4 μL、dNTP mix 2 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、Transcriptase 0.5 μL后再置于PCR儀中。PCR儀反應(yīng)程序:55℃、30 min 1循環(huán);85 ℃、5 min 1循環(huán);4 ℃、無限循環(huán)。PCR反應(yīng)體系:master mix 12.5 μL,目的基因上下游引物各1 μL,cDNA1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 預(yù)變性2 min； 94 ℃、30 s,60 ℃、30 s、72 ℃、45 s,35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8、min。

1.2.5 電泳及凝膠成像

PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳,并用marker作比較,在凝膠成像儀上判斷PCR產(chǎn)物片段大小及得到條帶灰度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和相關(guān)回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 缺氧模型的建立

HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi),是由α、β亞基組成的異二聚體，其中HIF-1α是特異性催化亞基。在缺氧時(shí)HIF-1α表達(dá)增加,與HIF-1β形成穩(wěn)定復(fù)合體,調(diào)節(jié)多種靶基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-1等的表達(dá),使細(xì)胞和組織適應(yīng)缺氧狀態(tài)[4]。故選取HIF-1α、VEGF-1作為缺氧標(biāo)志。將hepG2細(xì)胞以200 μmol/L的氯化鈷[5]分別處理1、3、6、12、24 h,提取總RNA,用RT-PCR測(cè)HIF-1 mRNA、VEGF mRNA的表達(dá)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，氯化鈷缺氧處理組較正常對(duì)照組的HIF-1 mRNA的表達(dá)量升高,且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。圖2結(jié)果趨勢(shì)與圖1類似,但比圖1更明顯。二者表達(dá)量的升高經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),P<0.05。這些結(jié)果表明,200 μmol/L的氯化鈷確實(shí)能使細(xì)胞缺氧,缺氧模型構(gòu)建成功。VEGF、HIF-1、STC-2缺氧復(fù)氧環(huán)境下的表達(dá)量見表1。

圖1 缺氧環(huán)境下HIF-1α表達(dá)情況

圖2 缺氧環(huán)境下VEGF-1

表1 VEGF、HIF、STC-2缺氧-復(fù)氧環(huán)境下的表達(dá)量

注：P值為VEGF、HIF、STC-2在不同缺氧、復(fù)氧時(shí)間段的表達(dá)差異比較

2.2 STC-1、STC-2 mRNA表達(dá)

如圖4所示,hepG2細(xì)胞在缺氧條件下,STC-1 mRNA表達(dá)用普通PCR方式幾乎檢測(cè)不到；如圖5所示,在hepG2細(xì)胞中,STC-2 mRNA表達(dá)在缺氧刺激下上調(diào)(P<0.01),且呈時(shí)間依賴模式,缺氧時(shí)間越長(zhǎng)其表達(dá)量越多?；謴?fù)常氧條件時(shí)這種上調(diào)的表達(dá)可以可逆地下調(diào)。

圖4 缺氧條件下STC-1mRNA表達(dá)情況

圖5 缺氧條件下STC-2mRNA表達(dá)情況

3 討論

缺氧是腫瘤細(xì)胞生存環(huán)境的常態(tài)。研究證明，缺氧刺激可促使包括結(jié)腸癌、鼻咽癌、卵巢癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞的STC-1基因表達(dá)。RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)源性HIF-1是缺氧誘導(dǎo)的STC-l表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,HIF-1直接與STC-1啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合,調(diào)節(jié)STC-1的表達(dá)。此外,STC-2也是HIF-1作用的靶基因之一。Law等[6]使用卵巢癌細(xì)胞研究結(jié)果表明,缺氧條件下HIF-l可以上調(diào)STC-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。STC-2在缺氧條件下表達(dá)上調(diào)可能是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的一種反應(yīng)[6]。為研究腫瘤細(xì)胞氧含量變化是否會(huì)影響STC的表達(dá),研究中選擇肝癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。肝癌在我國是一種常見的腫瘤,具有發(fā)現(xiàn)晚、發(fā)展迅速、治療棘手、療效欠佳、病死率高特點(diǎn)，故早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷尤為重要。肝癌又是一種多血管腫瘤,對(duì)血管有很強(qiáng)的依賴性。血循環(huán)中氧含量的變化對(duì)肝癌細(xì)胞的影響頗大。本研究意在探索肝癌細(xì)胞中氧含量的變化對(duì)STC表達(dá)的影響,評(píng)價(jià)STC能否成為肝癌早期檢測(cè)的指標(biāo)。

STC是近來新興的待開發(fā)腫瘤標(biāo)志物。一系列臨床病例對(duì)照試驗(yàn)表明,在胃癌、大腸癌、肺腺癌、乳腺癌等組織或外周血標(biāo)本中,STC表達(dá)明顯增多,且與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)。在侵入性乳腺癌中，STC-2可作為預(yù)兆標(biāo)志物,并與較長(zhǎng)的無病生存率(disease flee survival,DFS)相關(guān)。STC-1可能是脈絡(luò)叢腫瘤敏感和特異的標(biāo)志物。在白血病患者診斷和復(fù)發(fā)時(shí)STC-1轉(zhuǎn)錄水平升高[7]。在人類中,STC-1主要表達(dá)于卵巢、腎、前列腺、甲狀腺、胰腺細(xì)胞、神經(jīng)、骨和肌肉,但主要集中在卵巢。STC-2主要在腎臟、心臟、胰腺和脾臟表達(dá)。鄔匡杰等[8]檢測(cè)STC-2 基因在15種人體正常組織 (腦、心、肺、脾、腎、 胃、食管、小腸、卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、胎肝、肝及睪丸 )和肝癌組織中的表達(dá)研究中顯示,STC-2在正常肝中表達(dá)量極低,而在肝癌組織與癌旁組織中表達(dá)有明顯差異。

本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺氧可以引起STC-2 mRNA表達(dá)升高,但對(duì)STC-1 mRNA表達(dá)幾乎不影響。腫瘤細(xì)胞外環(huán)境氧含量的變化確實(shí)能影響STC-2的表達(dá)。缺氧時(shí),STC-2 mRNA表達(dá)量增多,與缺氧時(shí)間呈正相關(guān)；復(fù)氧后,其表達(dá)量又能逐漸下調(diào)?，F(xiàn)有研究[9]已經(jīng)證明，HIF-1在STC表達(dá)上調(diào)中起重要的作用，這可能是缺氧信號(hào)先引起HIF-1增多,HIF-1再作用其下游靶基因如VEGF、STC等,促進(jìn)缺氧區(qū)血管生成,維持腫瘤細(xì)胞的生存和代謝等以提高腫瘤細(xì)胞的缺氧耐受性。而其中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,調(diào)節(jié)機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。另外,STC表達(dá)量的變化與缺氧密切相關(guān),而腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和存活狀態(tài)常受到氧含量的調(diào)控。一方面因?yàn)槟[瘤細(xì)胞增殖快,對(duì)氧的需求高；另一方面,血管的生長(zhǎng)跟不上腫瘤的生長(zhǎng),使得部分腫瘤區(qū)域供血不足,細(xì)胞缺氧。故腫瘤與STC亦密切相關(guān)。Iata等[10]檢測(cè)138例結(jié)腸癌患者組織中STC-2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期等相關(guān)。Kanellis等[11]研究發(fā)現(xiàn)，STC-1可有效抑制免疫反應(yīng)助腫瘤細(xì)胞逃避患者免疫系統(tǒng)的攻擊等研究結(jié)果。這些可以得出STC作為一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。除此之外,借由STC表達(dá)與缺氧的相關(guān)性,STC的檢測(cè)亦可為血管栓塞性疾病提供一種輔助檢查手段評(píng)估局部缺氧及耐受情況[12]。但本研究只是針對(duì)缺氧時(shí)STC 在轉(zhuǎn)錄水平的影響,對(duì)其翻譯水平的影響欠缺。STC作為檢測(cè)指標(biāo)的具體可行性還需要結(jié)合一定數(shù)量臨床病例研究,診斷性試劑盒開發(fā)技術(shù)有待進(jìn)一步探索。

References)

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Influence of anoxia-reoxygen for expression of STC-1 and STC-2 mRNA in hepG2 cell

Wu Zian1, Tan Zhirong2, Xu Ning1, Li Tao1, Li Man1, Yin Fangfang2

(1. Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510370, China; 2. Second Clinical Medicine Institute, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective To reserch the influence of anoxia-reoxygen for the expression of STC-1 and STC-2 mRNA in hepG2 cell. Methods Using CoCl2 to simulate an anoxia environment,then detecting the expression of STC-1 and STC-2 mRNA of hepG2 cell in different timing during the process of anoxia-reoxygen.Results There is no expression of STC-1 mRNA in hepG2 cell during the whole process of anoxia-reoxygen.But there is an expression of STC-2 mRNA in hepG2 cell when it is anoxia.The degree of the expression will be increased for the length of the time of anoxia and returned to normal after reoxygen. Conclusion There is a close correlation between STC-2 and liver cancer in occuring and developing process.

hepG2 cell; STC-1; STC-2; anoxia;reoxygen

2015- 02- 19

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項(xiàng)課題(B2013169)

吳子安(1980—)，男，廣東順德，碩士，主管技師，主要研究領(lǐng)域?yàn)榕R床免疫學(xué)

E-mail：beancurdwu@163.com

徐寧(1970—)，男，河南夏邑，博士，主任技師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué).

E-mail：xu_ning21@163.com

Q57

B

1002-4956(2015)8- 0058- 04