丙酮—丁醇的微生物發(fā)酵生產(chǎn)

朱會(huì)芹　王瑞飛

摘 要：在過(guò)去的一段歷史時(shí)期內(nèi)，丙酮-丁醇發(fā)酵一度因生產(chǎn)成本高，產(chǎn)率低而發(fā)展遲緩。近年來(lái)，隨著能源需求的改變及環(huán)境保護(hù)的要求，其可再生、無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)再次引起人們的關(guān)注。該文對(duì)丙酮-丁醇發(fā)酵過(guò)程中所需的可替代性原料、高產(chǎn)菌株選育技術(shù)及相關(guān)發(fā)酵工藝等方面的最新進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)這些方面進(jìn)行了簡(jiǎn)單評(píng)述。

關(guān)鍵詞：生物燃料 微生物發(fā)酵 可替代性原料 菌株選育 發(fā)酵工藝

中圖分類號(hào)：Q93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2015）12（a）-0120-03

丙酮-丁醇發(fā)酵歷史悠久，早在1912年，人們開始利用梭狀芽孢桿菌發(fā)酵，即以糧食作物為原料生產(chǎn)丙酮和丁醇[1]。該產(chǎn)業(yè)一度成為世界上第二大發(fā)酵產(chǎn)業(yè)，用于生產(chǎn)火藥、合成橡膠等重要的化學(xué)品。直到20世紀(jì)中葉，廉價(jià)的石油被大量開采和利用，以石油為原料來(lái)合成化工產(chǎn)品的方法快速興起，導(dǎo)致丙酮-丁醇發(fā)酵方法的利用越來(lái)越少，其發(fā)酵工藝的改進(jìn)也嚴(yán)重遲滯。進(jìn)入21世紀(jì)后，由于人類長(zhǎng)時(shí)間的開采，石化資源已接近耗竭；另外，由于工藝水平和處理技術(shù)的限制，大量含有石油類的廢渣、廢水排放引起了嚴(yán)重的環(huán)境污染。為了貫徹經(jīng)濟(jì)與生態(tài)環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展的方針政策，尋找綠色能源已經(jīng)成為迫在眉睫之事。此時(shí)，丙酮-丁醇發(fā)酵途徑再次引起人們的極大關(guān)注，微生物發(fā)酵制丙酮-丁醇較原來(lái)丙酮-丁醇發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵周期短、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高、代謝副產(chǎn)物少。因此即使目前微生物發(fā)酵產(chǎn)丙酮-丁醇成本高，尚不具有很大的競(jìng)爭(zhēng)市場(chǎng)，但是通過(guò)原料和技術(shù)的改進(jìn)后可以降低生產(chǎn)成本、增加產(chǎn)量，丁醇將成為最具實(shí)用價(jià)值的廉價(jià)、清潔的新型液態(tài)生物燃料。該文章對(duì)近年來(lái)改善丙酮-丁醇發(fā)酵的相關(guān)方法和措施進(jìn)行綜述，以期對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的研究人員有所幫助。

1 生產(chǎn)丙酮-丁醇的可替代性原料

目前，工業(yè)生產(chǎn)丙酮和丁醇主要以農(nóng)作物為原料，存在著成本高，產(chǎn)量相對(duì)較低的問(wèn)題。為了解決這種問(wèn)題，需要尋找可替代原料。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的可替代原料主要有木質(zhì)纖維素類、合成氣、廢棄蛋白質(zhì)類。目前認(rèn)為，木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)是世界上最豐富、最廉價(jià)的可再生能源，木質(zhì)纖維素類包括森林殘留物和農(nóng)業(yè)殘留物，都可用acetone-butanol-ethanol（ABE）梭狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮和丁醇，但是對(duì)于不同的木質(zhì)纖維素類原料，丙酮-丁醇的生產(chǎn)效率也不盡相同。Swana等[2]用4種原料：柳枝稷、楊樹、玉米秸稈、小麥秸稈生產(chǎn)丁醇時(shí)發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈是生產(chǎn)丁醇產(chǎn)量最高的原料，其在生產(chǎn)丙酮和丁醇過(guò)程中最大利用率可達(dá)75%。依據(jù)當(dāng)前情況看，玉米秸稈仍是纖維素類物質(zhì)中用于生產(chǎn)丙酮和丁醇的首要選擇。合成氣是由CO、H2、CO2等組成的混合氣體，合成氣發(fā)酵燃料是一種商業(yè)化的邊緣技術(shù)，其低成本的發(fā)酵媒介提高了發(fā)酵過(guò)程的可行性。例如，使用玉米漿（CSL）代替酵母提取物，發(fā)酵介質(zhì)成本減少了27%，乙醇的產(chǎn)量較原來(lái)多出78%。CSL介質(zhì)用于連續(xù)發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生乙醇、正丙醇、正丁醇的最大濃度分別是8 g·L-1、6 g·L-1、1 g·L-1[3]。隨著人們生活水平的提升，動(dòng)物垃圾和糞便越來(lái)越多，其中富含豐富的蛋白質(zhì)，回收利用廢棄蛋白質(zhì)用于生物燃料生產(chǎn)不僅有利于改善環(huán)境也擴(kuò)大了能源來(lái)源。但是，微生物很少利用廢棄蛋白來(lái)制得生物燃料，這就需要對(duì)現(xiàn)有菌株進(jìn)行改造。Choia等利用抑制B. subtilis的支鏈氨基酸代謝途徑以及敲除脂肪酰轉(zhuǎn)移酶的手段，發(fā)酵生產(chǎn)更多的丁醇、異丁醇等生物燃料。利用木質(zhì)纖維素類、合成氣、廢棄蛋白質(zhì)類可替代性廢棄原料生產(chǎn)丙酮-丁醇，仍然是相對(duì)不成熟的技術(shù)，需要繼續(xù)研究探討其商業(yè)化的可行性。

2 丙酮-丁醇高產(chǎn)菌株選育

丙酮-丁醇高產(chǎn)菌株選育是通過(guò)改良菌種以及改進(jìn)現(xiàn)有的發(fā)酵工藝來(lái)提高其產(chǎn)量的過(guò)程。改良菌種可以利用誘變育種、代謝工程改造和基因重組技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中，誘變育種技術(shù)需要外界環(huán)境對(duì)菌種產(chǎn)生干擾，如等離子體干擾等，進(jìn)而改變微生物的遺傳性狀增加丙酮-丁醇轉(zhuǎn)化率，這種育種方法操作簡(jiǎn)便、速度快、收效大，也是目前菌種選育的主要方法。例如，Li等在大氣和室溫等離子體環(huán)境下培養(yǎng)acetobutylicum梭狀芽胞桿菌PW12，獲得其突變菌株ART18，生產(chǎn)丁醇為（11.3±0.5） g·L-1，比原來(lái)野生型菌株高出31%。代謝工程改造通過(guò)基因表達(dá)、敲除基因等手段改進(jìn)細(xì)胞代謝特性。例如，Hou等使C.acetobutylicum菌株的adc基因失活消除丙酮生產(chǎn)，同時(shí)把與谷胱甘肽生物合成能力有關(guān)的大腸桿菌的adc gshAB基因?qū)隿 acetobutylicum菌株，以增強(qiáng)其健壯性。在此過(guò)程中，丁醇生產(chǎn)從（5.17±0.26） g·L-1提高到（8.27±0.27） g·L-1?；蚯贸歉淖兡承┗蛐蛄?，導(dǎo)致相關(guān)基因功能喪失，進(jìn)一步對(duì)生物體遺傳性狀造成影響的技術(shù)。該技術(shù)在丙酮-丁醇高產(chǎn)菌株選育中也有應(yīng)用，Xu等發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌突變珠acetobutylicum JB200的單一堿基缺失導(dǎo)致Cterminal cac3319基因不能編碼組氨酸激酶，致使丁醇產(chǎn)量（18.2±1.3和12.6±0.2 g·L-1）比野生型的菌株高出44.4%?；蛑亟M是指在生物體產(chǎn)生后代的過(guò)程中，控制不同性狀的基因重新組合，Gao等利用Clostridium acetobutylicumCICC 8012菌株，通過(guò)基因重組獲得高產(chǎn)菌株 F2-GA，其發(fā)酵72 h后丁醇/丙酮/乙醇總?cè)軇┑漠a(chǎn)量達(dá)到了22.21 g·L-1，與原始菌株比，丁醇產(chǎn)量提高了34.53%。丙酮-丁醇高產(chǎn)菌株選育改變了原有菌株的結(jié)構(gòu)，使菌株的遺傳性狀發(fā)生改變，大大提高了丙酮-丁醇的產(chǎn)量。在以后的研究中，人們所面臨的巨大挑戰(zhàn)是，如何進(jìn)一步將這些菌株進(jìn)行改造，使其能夠在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模使用。

3 改進(jìn)丙酮-丁醇發(fā)酵工藝

為了更好地發(fā)展丙酮-丁醇工藝，可以對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，或者增加對(duì)發(fā)酵過(guò)程中輔因子的調(diào)節(jié)。

3.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

對(duì)于不同的菌株所需培養(yǎng)的外界條件不同，為了使菌株產(chǎn)量達(dá)到最大化，必須尋找最佳培養(yǎng)條件，使高產(chǎn)基因有效表達(dá)。培養(yǎng)條件的影響因素包括多種，如最適pH和比較完善的培養(yǎng)系統(tǒng)等，都能影響丙酮-丁醇產(chǎn)量，Jiang等發(fā)現(xiàn)pH是梭狀芽胞桿菌生產(chǎn)丙酮、丁醇、乙醇過(guò)程中的一個(gè)重要影響因素。在這項(xiàng)研究中，梭狀芽胞桿菌beijerinckii IB4在不同pH值從4.9到6.0下進(jìn)行分批發(fā)酵，在pH值為5.5時(shí)，ABE產(chǎn)量逐漸占優(yōu)勢(shì)，其最大濃度達(dá)到24.6 g·L-1 （15.7 g·Lof-1丁醇、8.63 g·L-1的丙酮和0.32 g·L-1的乙醇），此過(guò)程歷經(jīng)36 h消費(fèi)60 g·L-1葡萄糖。與pH不受控制的情況相比，丙酮-丁醇產(chǎn)量大大提高。除了培養(yǎng)條件之外，培養(yǎng)系統(tǒng)也能影響丁醇生產(chǎn)效率。Wang等開發(fā)出一種培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用不同微生物的特定代謝能力直接產(chǎn)生丁醇。該研究主要目的在于尋找互補(bǔ)的微生物進(jìn)行丁醇生產(chǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新的微生物團(tuán)體N3和菌株c celevecrescens N3-2能有效降解纖維素和產(chǎn)生大量的丁醇。由此可知，通過(guò)改變發(fā)酵過(guò)程的培養(yǎng)條件，營(yíng)造適宜的轉(zhuǎn)化環(huán)境，可以從很大程度上推動(dòng)丁醇的發(fā)酵效率增加。

3.2 梭菌輔因子擾動(dòng)

丙酮-丁醇發(fā)酵過(guò)程中存在許多輔因子，它們有的能夠促進(jìn)丁醇生產(chǎn)，有的卻對(duì)丁醇產(chǎn)生很大干擾，這些輔因子（包括ATP/ADP，NADH/NAD+等）在微生物代謝系統(tǒng)中廣泛存在。它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中幾乎為全部生化反應(yīng)提供能量、還原力，所以具有掌控全局的效應(yīng)。正因?yàn)槿绱?，丙?丁醇梭菌輔因子的研究意義十分重大。ATP主要參與底物水平磷酸化和氧化磷酸化，是在線粒體中完成ATP合成，可以通過(guò)調(diào)節(jié)電子傳遞鏈以及氧氣供給量來(lái)影響ATP，進(jìn)而影響丁醇產(chǎn)量。因此，利用一系列酶的作用，對(duì)電子傳遞鏈的活性進(jìn)行調(diào)控，可以影響ATP合成。Kuit等改變C.acetobutylicum菌株基因結(jié)構(gòu)，減少醋酸酶激酶，抑制磷酸乙酰乙酸去磷酸化促使ADP生成ATP，致使C. acetobutylicum菌株增加乙醇（63%）、丁醇（16%）產(chǎn)量并減少乳酸（50%）的產(chǎn)生。另外，NADH/NAD+氧化還原力調(diào)控在調(diào)節(jié)微生物代謝方面起著至關(guān)重要的作用，它一般分為外源生化過(guò)程和內(nèi)源基因工程手段對(duì)氧化還原力進(jìn)行調(diào)控。例如，Yang等利用外源調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的還原力，通過(guò)人工控制溶解氧和酶物質(zhì)，效價(jià)提高到102.3 g·L-1，收益率是0.44 g·g-1，以及丁醇生產(chǎn)力達(dá)到1.16 g·L-1·h-1。Li等通過(guò)內(nèi)源調(diào)節(jié)把煙酸（NADH和NADPH的前體）加入野生型梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)介質(zhì)中，細(xì)胞生長(zhǎng)速率和丁醇生成速率大大增加。控制胞內(nèi)能量和還原力供應(yīng)能有效地改變微生物發(fā)酵過(guò)程中的代謝途徑，也可以促進(jìn)微生物最大化地合成目標(biāo)產(chǎn)物，增加代謝速率，提高微生物發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性和競(jìng)爭(zhēng)力。

4 結(jié)語(yǔ)

生物丁醇較乙醇是一種更好的可再生燃料，很可能代替汽油再次成為一種重要的化工原料。當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題是提高生物發(fā)酵丁醇產(chǎn)量及進(jìn)一步降低其生產(chǎn)成本。根據(jù)目前已有報(bào)道，可以從以下方面增加丁醇產(chǎn)量：丁醇在商業(yè)化的進(jìn)程中對(duì)原料選擇很苛刻，農(nóng)作物作為丁醇原料已不能滿足當(dāng)前的市場(chǎng)需求，因此，農(nóng)業(yè)廢棄物（木質(zhì)纖維原料）和便宜的工業(yè)廢棄物在未來(lái)將會(huì)被大規(guī)模利用；目前應(yīng)用的梭狀芽孢桿菌生產(chǎn)的丁醇產(chǎn)量較低，急需選育高產(chǎn)菌株和提高菌株利用率；丙酮-丁醇發(fā)酵工藝可以大大加速發(fā)酵進(jìn)程，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，實(shí)施梭菌輔因子擾動(dòng)，可以降低成本，增加丁醇產(chǎn)量。目前，我國(guó)對(duì)生物丁醇的研究也逐漸增加，國(guó)家許多項(xiàng)目如“973”“863”計(jì)劃等都涉及了丁醇生產(chǎn)。隨著國(guó)家的投入力度增大，丁醇技術(shù)也越來(lái)越成熟，我國(guó)丁醇發(fā)展前景將十分廣闊。

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