張 凱, 宋希雨, 謝孔良
(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620)
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研究與技術(shù)
蠶絲絲素肽的制備及其自由基清除性能的研究
張 凱, 宋希雨, 謝孔良
(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620)
絲素肽是蠶絲蛋白的基本組成成分,在紡織品功能整理和生物技術(shù)領(lǐng)域有重要的潛在應(yīng)用。采用三元溶劑溶解法和蛋白酶Alcalase水解法將蠶絲水解制得一定相對(duì)分子質(zhì)量的絲素肽,以茚三酮比色法和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)測(cè)定Alcalase蛋白酶法水解絲素的水解度及制得的絲素肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布。通過正交試驗(yàn),確定的Alcalase酶法水解家蠶絲最佳工藝為:蠶絲絲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%,酶與底物質(zhì)量比為2.0%,pH值8,水解溫度55 ℃,時(shí)間6 h。酶水解最佳工藝下水解產(chǎn)物的水解度為18.3%,得到的絲素肽相對(duì)分子質(zhì)量分布在5~14 kD。文章研究了絲素肽對(duì)2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼自由基(DPPH)的清除性能,其對(duì)DPPH自由基的清除率為50%時(shí),絲素肽的質(zhì)量-體積濃度為1.85 mg/mL,絲素肽表現(xiàn)出良好的自由基清除功能。研究為開發(fā)絲素肽功能材料提供了一定的理論基礎(chǔ)。
絲素蛋白;水解度;茚三酮比色法;SDS-PAGE凝膠電泳;自由基消除
蠶絲是蛋白質(zhì)纖維,它由絲膠蛋白和絲素蛋白組成,其中絲素蛋白的含量約占70%~80%。作為蠶絲蛋白的重要組成部分,絲素蛋白是一種天然的高分子蛋白質(zhì)[1]。近年來,絲素蛋白在紡織、食品、化妝品及生物材料等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多,絲素蛋白的分離提純、結(jié)構(gòu)與性能的研究受到了廣泛關(guān)注。
家蠶絲素蛋白結(jié)構(gòu)由三部分組成,包括重鏈、輕鏈及輔助蛋白結(jié)構(gòu)[2]。作為一種天然的生物大分子,實(shí)際應(yīng)用中往往需要將其降解為具有生物活性的小分子多肽。生物活性多肽由于具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、降血壓、降血脂、抗疲勞、抗氧化等生理調(diào)節(jié)功能,成為當(dāng)前國(guó)際醫(yī)藥、食品、生物化工及生物功能材料等領(lǐng)域的熱門研究課題[3]。
目前,關(guān)于蠶絲絲素肽的制備方法,文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要包括酸水解、堿水解及酶水解等。酸水解可使絲素蛋白充分水解,但使色氨酸全部破壞,絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸部分破壞[4];堿水解會(huì)引起消旋作用,從而降低絲素肽的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5];酶水解由于反應(yīng)條件溫和,對(duì)氨基酸破壞小,而成為降解絲蛋白的最有前途的方法[6-7]。Alcalase酶是一種重要的蛋白酶,可以有效控制蛋白質(zhì)的水解程度[8]。本文采用Alcalase酶水解家蠶絲蛋白,得到一定相對(duì)分子質(zhì)量的絲素肽產(chǎn)品,以茚三酮比色法測(cè)試絲素肽的水解度,采用SDS-PAGE凝膠電泳法測(cè)定所得絲素肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布,并研究絲素肽對(duì)DPPH自由基的體外清除性能。
1.1 材料和儀器
材料:家蠶絲生絲(浙江嘉欣絲綢股份有限公司),透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量,MWCO:14 kD,上海綠鳥科技發(fā)展有限公司)。
試劑:乙醇、冰醋酸、鹽酸、甲醇、氯化鈣、脲、丙烯酰胺(ACR)、甲叉雙丙烯酰胺(BIS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、抗壞血酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼(DPPH自由基,Alfa Aesar,95%),Alcalase堿性蛋白酶(食品級(jí),丹麥諾維信),蛋白質(zhì)Marker標(biāo)準(zhǔn)品(BM523,上海生工生物工程股份有限公司)。
儀器:U-2910紫外可見分光光度計(jì)(日本日立公司),RY-25012常溫振蕩染色機(jī)(上海龍靈電子科技有限公司),低溫冷凍干燥機(jī)(Ilshinbiobase, Korea),DYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(北京六一儀器廠),超純水儀(PURELAB Option, ELGA)。
1.2 方 法
1.2.1 蠶絲的溶解
蠶絲脫膠:在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的Na2CO3溶液中,脫膠液的體積(mL)與蠶絲的質(zhì)量(g)之比為50,煮沸30 min,重復(fù)2次。
脫膠完成后,用三元溶劑體系(氯化鈣,水,乙醇)對(duì)蠶絲進(jìn)行溶解,三者的摩爾比為n(CaCl2)︰n(H2O)︰n(C2H5OH)=1︰8︰2,所用蠶絲與三元溶劑的質(zhì)量比為1︰10,溶解溫度為(78±2) ℃[9]。蠶絲可以完全溶解,得到蠶絲的絲素蛋白溶液。
將絲素蛋白的鹽溶解液轉(zhuǎn)移到處理過的透析袋中,為了防止蛋白質(zhì)的變性和避免透析時(shí)微生物的生長(zhǎng),采用低溫4 ℃下透析。用自來水透析2 d后,用蒸餾水透析1 d,以此達(dá)到充分去除鈣離子、氯離子及溶劑小分子的目的。最后離心分離,取上清液即是絲素蛋白水溶液。
1.2.2 絲素肽的制備
絲素蛋白水溶液采用酶法水解,其具體工藝為:家蠶絲水溶液→Alcalase堿性蛋白酶水解→透析除鹽→絲素肽水溶液。
影響酶水解的主要因素包括水解時(shí)間A、pH值B、酶與底物的質(zhì)量比C、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)D及溫度E。試驗(yàn)中以這5個(gè)因素為主要考察因素,利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)蠶絲水解的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。采用5因素4水平進(jìn)行正交試驗(yàn),如表1所示。
表1 Alcalase堿性蛋白酶的作用水平與因素Tab.1 Effect factors and levels of Alcalase alkaline protease
1.2.3 水解度的測(cè)定
以茚三酮比色法[10]測(cè)定不同絲素蛋白的水解度,水解度DH的計(jì)算見下式[11]:
DH=h/htot×100%
(1)
式中:h為水解后1 g蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù),htot為1 g原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù),n為水解液中游離氨基的含量,n0為蛋白質(zhì)原液中的游離氨基的含量,N為再生絲素蛋白水解液中的蛋白質(zhì)含量(注:10.2 mmol為1 g絲素蛋白含有的肽鍵毫摩爾數(shù)[7])。
1.2.4 凝膠電泳(SDS-PAGE)
1.2.4.1 電泳儲(chǔ)存液的配制
SDS-PAGE凝膠電泳參照文獻(xiàn)[12-13]的方法進(jìn)行。電泳緩沖液和凝膠貯存液的配制分別如表2和表3所示。
表2 SDS-PAGE電泳緩沖液Tab.2 SDS-PAGE electrophoretic buffer solution
注:a.以HCl調(diào)節(jié)pH值;b.pH值無需調(diào)節(jié),緩沖液的pH值約為8.25。
表3 SDS-PAGE凝膠貯存液Tab.3 SDS-PAGE gel storage solution
注:T代表ACR和BIS的總質(zhì)量分?jǐn)?shù);C代表交聯(lián)度,表示BIS質(zhì)量占ACR和BIS總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)。
1.2.4.2 凝膠的制備
分離膠在電泳系統(tǒng)中起分子篩和載體的作用,據(jù)文獻(xiàn)[14]當(dāng)分離膠總質(zhì)量分?jǐn)?shù)T=15%(C=5%~7.5%)時(shí),凝膠分子間隙最小,對(duì)蛋白質(zhì)的分離效果好。所以本文選用的分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)T=15%,交聯(lián)度C=6%;濃縮膠的制備方法與一般的SDS-PAGE相似。分離膠和濃縮膠的組成如表4所示。
表4 分離膠和濃縮膠的組成Tab.4 Composition of separation gel and stacking gel
電泳槽的內(nèi)、外槽分別裝陰、陽極緩沖液見表2,在起始電壓為60 V的條件下開始電泳,當(dāng)樣品前沿(溴酚藍(lán))進(jìn)入分離膠后,將電壓調(diào)整為100 V,直至樣品中染料遷移至離下端1 cm左右時(shí),停止電泳。
電泳結(jié)束后,將凝膠放在盛有染色液的染色槽中浸泡1 h左右,然后倒去染色液,用蒸餾水清洗一次,然后加入脫色液,放在搖床上振蕩使其脫色,更換幾次洗脫液,直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止。脫色結(jié)束后,測(cè)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品各個(gè)條帶的遷移距離,得到各蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率Rf(Rf為分離膠上沿至溴酚藍(lán)的距離與蛋白質(zhì)移動(dòng)的距離的比值)。SDS-PAGE凝膠電泳中蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值與其在SDS-PAGE凝膠中的相對(duì)遷移率存在線性關(guān)系,如下式所示:
LogMw=mRf+n
(2)
式中:Mw為蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量;Rf為蛋白質(zhì)在凝膠中的相對(duì)遷移率;m,n分別為以LogMw對(duì)Rf作直線擬合時(shí)直線的斜率及直線在Y軸上的截距。
1.2.5 DPPH自由基消除性能
絲素肽的固體樣品通過低溫真空冷凍干燥后得到,其對(duì)DPPH自由基的消除試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]的方法。
DPPH甲醇溶液的配制:取0.004 g DPPH自由基用甲醇定容于100 mL的容量瓶中,得到0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液。
絲素肽水溶液的配制:取0.10 g絲素肽固體粉末溶于10 mL的蒸餾水中,配制成10 mg/mL的絲素肽水溶液。
試驗(yàn)中以標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物抗壞血酸(維生素C)的DPPH自由基清除能力作參照。稱取10 mg的維生素C溶于10 mL的蒸餾水中,配制成1 mg/mL的維生素C水溶液。
取2 mL絲素肽樣品稀釋液,加人2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液,搖勻后于暗處放置30 min,測(cè)定體系在517 nm處的吸光度值,記為A。以樣品溶液加甲醇作為對(duì)照組,其在517 nm處的吸光度,記為A對(duì)照;測(cè)定2 mL DPPH甲醇溶液和2 mL水的混合溶液在517 nm處的吸光度值,記為A空白。
自由基清除率(SC,%)的計(jì)算公式如下:
(3)
SC50為自由基清除率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度,可經(jīng)線性回歸后計(jì)算出。
2.1 絲素蛋白的酶法水解
為了更好地進(jìn)行水解,脫膠后的蠶絲可以被氯化鈣、水、乙醇的三元溶劑體系溶解,得到蠶絲的絲素蛋白溶液。酶水解由于反應(yīng)條件溫和,可以有效控制蛋白質(zhì)的水解程度,Alcalase酶被應(yīng)用于絲素蛋白溶液的降解。通過正交試驗(yàn)對(duì)酶法水解絲素蛋白的條件進(jìn)行了優(yōu)化。正交試驗(yàn)中以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶與底物質(zhì)量比、溫度、pH值及水解時(shí)間為主要考察因素,以水解度為響應(yīng)因素,試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。
表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal experiment
從表5的正交試驗(yàn)結(jié)果可知,Alcalase酶水解的最佳工藝為B2C4A3E2D1,即絲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%,水解溫度55 ℃,酶與底物質(zhì)量比為2%,pH值為8.0,反應(yīng)時(shí)間6 h。采用最佳工藝條件對(duì)絲素水解液進(jìn)行酶水解,以茚三酮比色法測(cè)定水解度為18.3%
2.2 絲素肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布
SDS-PAGE凝膠電泳譜可以測(cè)定絲素肽蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分布。在SDS-PAGE電泳試驗(yàn)中,使用的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品BM523的組成如表6所示。
表6 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 BM523的組成Tab.6 Components of protein marker BM523
SDS-PAGE凝膠電泳譜圖如圖1所示,樣品a為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品BM523,樣品b為三元溶劑體系溶解后的絲素蛋白水溶液,樣品c為酶水解制備的絲素肽溶解液,d為酶空白試驗(yàn)樣品(體系中僅存在酶及緩沖液)。
圖1 不同樣品的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE gel electrophoretogram of different test samples
對(duì)圖1中的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品譜帶進(jìn)行分析,通過測(cè)量求得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品各個(gè)條帶的相對(duì)遷移率Rf,然后以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Mw的對(duì)數(shù)值LogMw對(duì)Rf作圖,并進(jìn)行直線擬合,如圖2所示。
圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品SDS-PAGE數(shù)據(jù)的線性擬合Fig.2 Linear fitting of SDS-PAGE data of protein marker
SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量時(shí),通過計(jì)算得到凝膠電泳后的未知蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠上的相對(duì)遷移率,然后利用圖2中的擬合直線方程式進(jìn)行運(yùn)算,便可求得未知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)合圖1和圖2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知:酶空白實(shí)驗(yàn)的電泳圖上不顯示任何區(qū)帶,這說明在酶用量很低的情況下,酶本身對(duì)測(cè)試結(jié)果沒有干擾;三元溶劑溶解后得到的再生絲素蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布很寬;酶水解條件下制備的絲素肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布較集中,相對(duì)分子質(zhì)量也較小,主要分布在5~14 kD的相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)間內(nèi)。由此可見,絲素蛋白經(jīng)過Alcalase酶法水解后,絲素蛋白大分子被降解成相對(duì)分子質(zhì)量較小的絲素多肽,接下來以絲素肽為研究對(duì)象,研究絲素肽的DPPH自由基清除性能。
2.3 絲素肽的自由基清除性能
2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼自由基有單電子,在517 nm處有一強(qiáng)吸收峰,其醇溶液呈紫色。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí),由于自由基清除劑與其單電子配對(duì),而使其在517 nm處的吸收逐漸消失,其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系,因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析自由基清除性能[16]。DPPH法自由基清除率測(cè)試的原理如圖3所示。
圖3 DPPH自由基清除機(jī)理Fig.3 Mechanism of DPPH radical scavenging
絲素肽和維生素C的DPPH自由基清除性能通過分光光度計(jì)進(jìn)行定量的測(cè)定,維生素C的DPPH自由基清除性能被用來作為參照對(duì)比。它們的自由基清除性能及線性擬合方程如圖4所示。
圖4 絲素肽(A)和維生素C(B)的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging ability of fibroin peptide (A) and Vitamin C (B)
從圖4可以看出,DPPH的自由基清除率隨著絲素肽質(zhì)量-體積濃度的增大而提高,維生素C的自由基清除率試驗(yàn)也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。SC50是表征自由基清除能力的重要指標(biāo),為自由基清除率為50%時(shí)樣品的質(zhì)量-體積濃度。絲素肽和維生素C的SC50可以通過圖4中的線性擬合方程求得兩者的DPPH自由基清除率的SC50分別為1.85 mg/mL和0.024 mg/mL。Aranya Manosroi等[16]研究了不同絲膠水解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率,研究認(rèn)為絲膠水解產(chǎn)物、維生素C及亞油酸對(duì)DPPH自由基清除率的SC50分別為34.3、0.42、218.9 mg/mL。由于DPPH自由基試驗(yàn)操作方法不同,因此文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)與本文數(shù)據(jù)存在差異,維生素C對(duì)DPPH自由基的清除能力是一定的,所以兩組數(shù)據(jù)中絲素肽和絲膠水解產(chǎn)物相對(duì)于維生素C的相對(duì)值可以間接反映本文中制備的絲素肽與文獻(xiàn)中絲膠水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力間的差異。本文中絲素肽的DPPH自由基清除率的SC50是維生素C的77倍,而文獻(xiàn)中報(bào)道的絲膠水解產(chǎn)物的SC50是維生素C的81倍。由此可知Alcalase酶水解制備的絲素肽與文獻(xiàn)中的絲膠水解產(chǎn)物具有相近的DPPH自由基清除能力。綜上分析可知,采用Alcalase酶水解制備的絲素肽具有良好的自由基清除能力,這類由蠶絲獲得的絲素肽分子在生物功能材料、功能紡織面料及化妝品領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
1)酶水解絲素制備絲素肽的最佳工藝為:絲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%,水解溫度55 ℃,酶與底物質(zhì)量比為2%,pH值為8.0,反應(yīng)時(shí)間6 h。以茚三酮比色法測(cè)定了絲素水解產(chǎn)物的水解度為18.3%。
2)采用SDS-PAGE凝膠電泳法測(cè)定了絲素蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布。三元溶劑溶解后的絲素蛋白水溶液的相對(duì)分子質(zhì)量很大且分布很寬,Alcalase酶水解后制備的絲素肽相對(duì)分子質(zhì)量,主要分布在5~14 kD。
3)絲素肽和維生素C對(duì)DPPH自由基清除率的SC50分別為1.85 mg/mL和0.024 mg/mL,絲素肽具有良好的DPPH自由基清除性能,在化妝品、功能紡織品等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
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Preparation of Silk Fibroin Peptide and Study on Its Free Radical Scavenging Property
ZHANG Kai, SONG Xiyu, XIE Kongliang
(College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620,China)
Silk fibroin peptide (SFP) is the basic composition of silk fibroin protein. It has important potential application in textile and biotechnology. In this paper, ternary solvent dissolution method and protease Alcalase hydrolysis were adopted to hydrolyze silk to gain fibroin peptide with certain molecular weight. Ninhydrin colorimetric method and SDS-PAGE were used to determine hydrolysis degree of Alcalase protease and molecular weight distribution of fibroin peptide. The optimal process of Alcalase alkaline proteinase hydrolysis was determined by orthogonal experiment: silk fibroin concentration 4%, mass-volume concentration of enzyme dosage and substrate 2.0%, pH value 8, hydrolysis temperature 55 ℃,and time 6 h. Under the best process of enzyme hydrolysis, hydrolysis degree of hydrolysate was 18.3%, and molecular weight distribution of fibroin peptide was between 5 kD and 14 kD. The scavenging property of silk fibroin peptide on DPPH free radical was investigated in this paper. The results show that 1.85 mg/mL fibroin peptide could scavenge 50% DPPH free radical. SFP showed good free radical scavenging property. This paper offers certain theoretical basis for developing SFP functional materials.
silk fibroin; hydrolysis degree; ninhydrin colorimetric method; sds-page gel electrophoresis; free radical scavenging
2015-03-10;
2015-06-26
TS149
A
1001-7003(2015)10-0001-06 引用頁碼: 101101
doi.org/10.3969/j.issn.1001-7003.2015.10.001