恒河猴BST-2基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性及其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響

董志會(huì)，王 衛(wèi)，叢 喆，熊圣文，駱 楊，陳 霆，魏 強(qiáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

恒河猴BST-2基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性及其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響

董志會(huì)，王 衛(wèi)，叢 喆，熊圣文，駱 楊，陳 霆，魏 強(qiáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的篩查恒河猴BST-2基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(coding－region single nucleotide polymorphism，cSNP），研究其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。方法提取恒河猴外周血RNA，RT－PCR擴(kuò)增，單克隆測(cè)序比對(duì)，確定猴BST-2的cSNP位點(diǎn);通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;比較不同基因型猴體內(nèi)SHIVSF162p3復(fù)制水平的差異。結(jié)果 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)8個(gè)非同義突變位點(diǎn);經(jīng)Psipred軟件預(yù)測(cè)，其中G41A、T128C、C129和A333C cSNP位點(diǎn)可影響B(tài)ST－2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。在SHIVSF162p3感染平臺(tái)期，參考基因型猴(DLQ）病毒復(fù)制水平要高于GLQ型猴(P＜0．05），其他基因型猴之間無(wú)顯著差異。結(jié)論 cSNP(G41A）可能影響B(tài)ST－2的抗病毒功能，這為后續(xù)研究提供參考信息。

BST－2;cSNP;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);恒河猴

骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原－2(bone marrow stromal cell antigen 2，BST－2），也稱tetherin，CD317或MH1．24，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的包膜病毒限制因子之一［1－2］。BST－2是一種具有特殊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的脂筏相關(guān)跨膜蛋白，其通過(guò)連接病毒和宿主細(xì)胞膜，將新出芽病毒束縛在細(xì)胞膜表面，從而限制病毒的釋放［1］。有研究表明，其他天然抗病毒蛋白在與病毒協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)某些位點(diǎn)核苷酸的突變，從而影響它們的抗病毒能力［1，3－4］;有文獻(xiàn)報(bào)道，人BST-2基因部分氨基酸殘基位點(diǎn)的改變可能影響HIV－1vpu對(duì)BST－2的敏感性［5］。但有關(guān)恒河猴BST-2基因多態(tài)性，及對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)基因測(cè)序、序列比對(duì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等技術(shù)找到恒河猴BST-2基因中影響抗SIV功能的cSNP位點(diǎn)，以及比較不同基因型猴艾滋病病毒復(fù)制的峰值與控制值，從而為后面探究猴BST－2抗病毒作用提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

中國(guó)恒河猴55只，購(gòu)自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所【SCXK(京）2005－2005】;分別采集動(dòng)物外周血1 mL，EDTA抗凝，樣品采集后4 h內(nèi)提取RNA。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒感染與指標(biāo)測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)55只猴中選取20只恒河猴采取靜脈注射感染，感染病毒為SHIVSF162p3，毒力為300TCID50，在攻毒后3 d，7 d，10 d，后每隔7 d采集動(dòng)物外周血1 mL，EDTA抗凝;樣品采集后4 h內(nèi)，分血漿，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)血漿病毒載量，流式細(xì)胞術(shù)和血常規(guī)對(duì)全血進(jìn)行分析。

1.3 外周血RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

實(shí)驗(yàn)猴EDTA抗凝全血使用RNA BLOOD MINI KIT(購(gòu)自QIAGEN公司）進(jìn)行總RNA的提取，提取過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū);提取RNA后立即對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增

BST-2基因擴(kuò)增采用兩步法，第一步使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連）進(jìn)行RT－PCR合成cDNA第一條鏈，操作過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū);第二步用高保真酶KOD－Plus試劑盒(TOYOBO，上海）擴(kuò)增BST-2基因，操作過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。BST-2基因引物來(lái)自參考文獻(xiàn)［6］，由 Invitrogene公司合成。引物序列為：F 5'－ATA ACT CGA GGT GGA ATT CAT GGC ACC TAT TTT GTA TGA C－3'，R 5'－ATA TTG GTA CCT CAC AGC AGC AGA GCG CTC AAG CCC AGC AGC AG－3'，退火溫度63℃。PCR在System 9700 PCR儀上進(jìn)行(Applied Biosystems公司）

1.5 單克隆分型檢測(cè)

使用 QIAquick PCR Purification Kit(購(gòu)自QIAGEN公司）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，純化回收過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū);對(duì)純化回收回來(lái)的DNA片段用DNA A－Tailing Kit(TaKaRa，大連）進(jìn)行加A尾，加A尾過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū);對(duì)加完A尾的DNA片段回收，與pMDTM18－T Vector進(jìn)行連接，連接步驟參照pMDTM18－T Vector Cloning Kit(TaKaRa，大連）說(shuō)明書(shū);對(duì)連接好后的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，感受態(tài)細(xì)胞為 E．coli JM109 Competent Cells(TaKaRa，大連），轉(zhuǎn)化過(guò)程參考試劑盒說(shuō)明書(shū);轉(zhuǎn)化好后的感受態(tài)細(xì)胞放于1 mL無(wú)抗生素的SOS培養(yǎng)基中，在搖床上37℃，180 r/min培養(yǎng)1 h，然后從1 mL的菌液中抽取300 uL平鋪在帶有氨芐抗性的平板上，37℃恒溫培養(yǎng)16 h;待平板長(zhǎng)出菌落，挑取菌落，進(jìn)行菌落PCR，每個(gè)樣品選取6個(gè)陽(yáng)性菌，送諾塞(北京）公司測(cè)序。

1.6 序列比對(duì)和生物軟件分析

DNA測(cè)序由北京諾賽基因公司完成。利用BioEdit軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)，恒河猴［Macaca mulatta］ BST-2參考 cDNA 序列為： Transcript_id="NM_001161666．1";恒河猴［Macaca mulatta］BST－2氨基酸參考序列為：Protein_id="NP _001155138．1"。分別用 Psipred軟件，SWISSMODEL軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 中國(guó)恒河猴BST-2基因編碼區(qū)cSNP位點(diǎn)的分布

提取20只恒河猴全血RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR后進(jìn)行測(cè)序比對(duì)(參照序列為 NCBI上公布的 BST－2 cDNA序列，NM_001161666），一共找到9個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于基因的胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)(表1）;通過(guò)使用BioEdit軟件進(jìn)行翻譯和氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)突變位點(diǎn)為非同義突變，在BST－2蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)上的位置分別是：9(C/G），12(P/ S），14(D/G），29(I/V），43(L/P），111(Q/H），159(P/S）(圖1）。其中G9R，P12S，D14G分布在BST－2的胞質(zhì)區(qū);I29V，L43P分布在BST－2的跨膜區(qū)上;Q111H，P159S分布在BST－2的胞外區(qū)上。

圖1 恒河猴BST－2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及SNP分布情況Fig．1 Protein structure and SNP distribution in BST－2 of rhesus macaques

表1 恒河猴BST-2基因突變位點(diǎn)Tab．1 Nucleotide mutants of rhesus macaques

2.2 非同義cSNP對(duì)BST-2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

Psipred軟件分析結(jié)果顯示，3個(gè)非同義cSNP位點(diǎn)突變影響了BST－2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，具體分析，在13～15氨基酸殘基位置由一個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲變成α螺旋，40～42氨基酸殘基由α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲，111氨基酸殘基從原來(lái)的α螺旋轉(zhuǎn)變成無(wú)規(guī)則卷曲，其它結(jié)構(gòu)均未發(fā)生變化(圖2）。

2.3 基因分型及cSNP位點(diǎn)的頻率測(cè)定

通過(guò)單克隆測(cè)序，用BioEdit軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)55只中國(guó)恒河猴中G41A基因頻率占2．17%;T128C的基因頻率為 22．5%;C129G的基因頻率為50%;A333C的基因頻率為5%。對(duì)基因分型結(jié)果進(jìn)行分析，共找到了6種主要基因型(自然存在的）(表2）。

圖2 BST-2基因cSNP引起的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Fig．2 The change of secondary structure caused by cSNP of BST-2

表2 恒河猴BST-2基因型及比率Tab．2 Genotypes of rhesus macaques’BST-2

2.4 不同基因型對(duì)猴艾滋病疾病進(jìn)程的影響

經(jīng)過(guò)對(duì)不同基因型猴BST－2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，我們對(duì)這20只猴進(jìn)行了基因型的分類，共分成了5群，分別是GLP(4只），DLQ(5只），DLQ/DPQ (4只），DLQ/GLQ(5只），DPH/DPQ(2只）。G/D是第14位氨基酸殘基類型，L/P是第43位氨基酸殘基類型，Q/H第111位氨基酸殘基類型。在這里，我們對(duì)不同基因型猴感染SHIVSF162p3之后病毒復(fù)制峰值和病毒復(fù)制控制值做了統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，通過(guò)Student－Newman－Keuls檢測(cè)，進(jìn)行兩兩比較，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從圖中我們可以看出，除了在病毒復(fù)制控制值上，DLQ型基因猴組高于GLQ型猴組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P＜0．05），其他基因型猴組在病毒復(fù)制峰值和病毒控制值上兩兩之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。具體來(lái)說(shuō)，GLQ型與DLQ相比，DLQ型組峰值要高于GLQ;比較DLQ型和DLQ/DPQ型，DLQ組峰值和控制值要高于 DLQ/DPQ組;比較 DLQ/DPQ型和DPH/DPQ型，DLQ/DPQ型組與DPH/DPQ型組峰值差異不明顯，DLQ/DPQ組控制值要略高于DLQ/ DPQ組(圖3）。

圖3 不同BST-2基因型的病毒復(fù)制峰值和控制值Fig．3 The replication peak value and set－point value of different BST-2 genotype

3 討論

BST－2主要在未分化的B細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)是一種典型的II型跨膜蛋白［7］。BST－2氨基端位于胞質(zhì)內(nèi)，隨后是一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白域，胞外區(qū)也呈α螺旋結(jié)構(gòu)，其羧基端有一個(gè)糖基磷脂酰肌醇錨定點(diǎn)［5］。BST－2不僅可以抑制免疫缺陷病毒的釋放，還可以抑制多重包膜病毒的釋放［7－8］，由此，我們可以看出BST－2具有廣泛的的抗包膜病毒釋放作用，因此，BST－2抗病毒的作用不可能是與病毒特異性的結(jié)合，2009年，Perez－Caballero年發(fā)現(xiàn)與BST－2具有相似拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的二聚體分子同樣具有束縛HIV－1的作用，表明是BST－2的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而不是其一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸的序列起抗病毒作用［9］。現(xiàn)在，人們普遍認(rèn)為，BST－2作為一個(gè)橋梁連接宿主細(xì)胞和病毒，從而把病毒粘連在宿主細(xì)胞表面，進(jìn)而把一部分病毒內(nèi)吞降解。研究發(fā)現(xiàn)，不同病毒對(duì)BST－2的抗病毒作用有拮抗作用，如HIV－1vpu可以與人BST－2的跨膜區(qū)結(jié)合，從而誘導(dǎo)BST－2膜定位的轉(zhuǎn)移及降解［1］; SIV nef蛋白可以與猴BST－2的胞質(zhì)區(qū)氨基酸殘基結(jié)合，誘導(dǎo)降解BST－2［10］。比較人與恒河猴的BST－2蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)人BST－2胞質(zhì)區(qū)比猴的BST－2蛋白胞質(zhì)區(qū)少了5個(gè)氨基酸殘基，而這5個(gè)氨基酸殘基正是 SIVnef與猴 BST－2相互作用的關(guān)鍵部位［11］。Marina Laplana 2013年發(fā)現(xiàn)，不同的人BST－2基因型對(duì)艾滋病疾病進(jìn)程具有一定的影響［12］。因此，有可能不同猴BST-2基因型對(duì)猴艾滋病疾病進(jìn)展有影響。

由cSNP堿基序列的不同而產(chǎn)生的非同義突變會(huì)造成蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，從而影響蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這種改變常常造成蛋白質(zhì)一些功能的變化。本研究主要找出猴BST-2非同義cSNP堿基序列的改變，通過(guò)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和結(jié)合猴艾滋病疾病進(jìn)程來(lái)分析這些 cSNP對(duì)猴 BST－2功能的影響。

在這里，我們發(fā)現(xiàn)了八個(gè)非同義cSNP位點(diǎn)，用Psipred軟件分析顯示，只有三個(gè)cSNP位點(diǎn)的改變對(duì)猴BST－2的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，尤其是第14為G/D的變化使得猴BST－2胞質(zhì)區(qū)的一小段α螺旋得以延伸，而第14，15，16，17，18，19位這幾個(gè)氨基酸殘基正是SIV nef的結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)，而其他兩個(gè)cSNP位點(diǎn)的改變雖對(duì)BST－2的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一些變化，但是用SWISS－MODEL軟件分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)cSNP對(duì)猴BST－2的三級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有影響，而且在BST－2是以其獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)揮其抗病毒作用，因此這兩個(gè)cSNP對(duì)BST－2的功能可能不會(huì)有太大影響。在不同基因型猴艾滋病疾病進(jìn)程的比較中，DLQ型峰值和控制值要高于GLQ型，DLQ型峰值和控制值要高于DLQ/DPQ型，DLQ/DPQ型與DPH/DPQ型峰值差異不明顯，DLQ/DPQ型控制值要略高于DLQ/DPQ型，這些說(shuō)明了猴BST－2蛋白在第14位，第43位氨基酸殘基分別是G和P時(shí)，有可能可以增強(qiáng)其抗病毒作用，而111位氨基酸殘基的變化可能對(duì)猴BST－2抗病毒作用并無(wú)影響。在這里我們需要提出的是，艾滋病是一個(gè)極其復(fù)雜的病毒感染性疾病，有很多因素影響著其疾病進(jìn)程，因此，我們還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些位點(diǎn)與猴BST－2蛋白抗病毒作用有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究猴BST－2蛋白功能提供一定參考依據(jù)，為病毒拮抗該蛋白的機(jī)制研究提供參考。下一步，我們將在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上去驗(yàn)證這3個(gè)cSNP位點(diǎn)對(duì)猴BST－2抗病毒作用的影響。

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Polymorphisms of coding region in BST-2 gene of Rhesus macaques and their effects on protein structure and function

DONG Zhi－h(huán)ui，WANG Wei，CONG Zhe，XIONG Sheng－wen，LUO Yang，CHENG Ting，WEI Qiang
(Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College(PUMC）＆Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS）;Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese medicine，Beijing 100021，China）

Objective To explore the impacts of cSNP on the structure and function of rhesus macaque’s BST－2．Methods Extracting RNA from peripheral blood of rhesus macaques，then RT－PCR，Monoclonal sequencing to find the cSNP sites;Forecasting the structure of these proteins;Comparing the Level of SIVmac239 replication between the different genotypic Rhesus macaques．Results We found 8 non－synonymous mutation sites，in the 8 non－synonymous mutation sites，Only G41A，T128C，C129 and A333C change the secondary protein structure of BST－2 by forecasting of Psipred software;At the plateau of SHIVSF162p3 replication，The SHIVSF162p3 replication level of reference genotype rhesus macaque(DLQ）is higher than rhesus macaques of GLQ genotype，other genotypes rhesus macaques have no significant difference．Conclusion cSNP(G41A）may influence the antiviral activity of rhesus macaque’s BST－2，this study gives us a reference to further research work．

BST－2;cSNP;Structure;Rhesus macaque

魏強(qiáng)(1964－），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。E－mail：weiqiang0430@sohu．com。

R－332

A

1671－7856(2015）07－0020－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．005

“十二五”傳染病重大專項(xiàng)課題(2012ZX10004－501－001;2013ZX10004－608－003）

董志會(huì)(1988－），男，碩士生，專業(yè)：比較醫(yī)學(xué)。

2015－06－10