骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響

黑悅樊才瑞龍乾發(fā)羅強(qiáng)魏禮洲伊西才劉衛(wèi)平

·基礎(chǔ)研究·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響

黑悅1樊才瑞2龍乾發(fā)3羅強(qiáng)3魏禮洲1伊西才1劉衛(wèi)平1

目的 探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及海馬CA1區(qū)域GAD67、GABABR1的表達(dá)的影響。 方法 成年雄性SD大鼠60只隨機(jī)分為假手術(shù)組 (n= 20)，模型組(n=20)和移植組(n=20)。結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立大鼠血管性癡呆模型，2 h后BMSCs尾靜脈移植，28 d后水迷宮檢測(cè)認(rèn)知變化，Western blotting和免疫組化分析大鼠海馬CA1區(qū)GAD67和GABABR1的表達(dá)變化。 結(jié)果 (1)Western blotting和免疫組化結(jié)果顯示，模型組相比假手術(shù)組在慢性期海馬CA1區(qū)GAD67和GABABR1表達(dá)水平(蛋白水平以及免疫組化染色強(qiáng)度)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (分別為1.347±0.357比2.237±0.956，t=5.478，P=0.0076；0.779±0.181比1.691±0.337，t=4.893，P=0.0073)。(2)移植組GAD67和GABABR1表達(dá)水平改變均比模型組輕微，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為1.611±1.007比1.347±0.357，t=2.379，P=0.0373；1.009±0.257比0.779±0.181，t=2.678，P= 0.0441)。(3)水迷宮認(rèn)知功能測(cè)試顯示，移植組比模型組潛伏期縮短(20.817±2.891比30.192±3.472，t= 2.743，P=0.0442)，且在游泳軌跡方面顯示出更好的方向性。 結(jié)論 BMSCs移植可提升血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能并上調(diào)海馬CA1區(qū)GAD67和GABABR1表達(dá)水平。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 血管性癡呆； 細(xì)胞移植； GAD67； GABABR1

近年來(lái)血管性癡呆 (vascular dementia，VaD)相關(guān)認(rèn)知功能障礙在動(dòng)物模型中被證實(shí)與慢性全腦缺血相關(guān)[1-2]。永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎(two vessel occlusion，2VO)在皮層和海馬區(qū)域都造成了顯著而持續(xù)的低灌注，被廣泛運(yùn)用于血管性癡呆認(rèn)知功能的研究之中[3-4]。而海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元是2VO引起的認(rèn)知功能障礙重要靶點(diǎn)，而其中γ氨基丁酸能系統(tǒng)(GABAergic system)的選擇性調(diào)控對(duì)認(rèn)知改善有十分積極的作用[1,5,6]。抑制性神經(jīng)元中GAD67的表達(dá)和突觸中GABABR1的表達(dá)是該系統(tǒng)的重要組成部分[7-9]，分別在GABA神經(jīng)遞質(zhì)的合成和功能發(fā)揮中扮演重要角色，并且兩者的調(diào)控能夠引起細(xì)胞外GABA水平和認(rèn)知功能的改變[7,9]。然而BMSCs能否通過(guò)調(diào)控GAD67和GABABR1的水平仍未可知。本研究擬利用2VO模型探究BMSCs移植對(duì)認(rèn)知功能的改善，以及對(duì)海馬CA1區(qū)域GABA能系統(tǒng)重要靶點(diǎn)GAD67和GABABR1表達(dá)的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

全部健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，230～250 g)60只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=20)，模型組(n= 20)和移植組(n=20)，后續(xù)處理中如有死亡或者造模不成功則另行補(bǔ)充。

二、大鼠血管性癡呆模型的制作

造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前12 h禁食，采用2VO制作大鼠血管性癡呆模型。大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)，仰臥位固定，于頸部正中做1.5 cm切口，暴露并分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，注意盡量不牽扯迷走神經(jīng)，取7號(hào)線于頸總動(dòng)脈近遠(yuǎn)心端做2處方結(jié)，做永久性結(jié)扎。術(shù)后6 h以Longa五級(jí)四分法[10]評(píng)分為1～3分者為模型建立成功。

三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)和移植

取2周齡SD雄性大鼠，腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)后浸泡在75%酒精中15 min，取出雙側(cè)股骨骨髓，用5 ml生理鹽水反復(fù)沖洗后收集5 ml骨髓液，2 500 r/min離心20 min，生理鹽水洗2遍后 加 入 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 (alpha-minimum essential medium，α-MEM)，10%胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)接種于25 ml塑料培養(yǎng)瓶，放入37°C，5%CO2的孵箱中靜置培養(yǎng)48 h后換液。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶平底80%左右時(shí)用胰酶消化傳代。取第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞待用。模型建立2 h后，腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 ml/kg)，經(jīng)尾靜脈注射1 ml濃度為1×107個(gè)第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，模型組和假手術(shù)組經(jīng)尾靜脈注射1 ml生理鹽水。

四、行為學(xué)分析

水迷宮測(cè)試一共分為兩步。首先連續(xù)4 d進(jìn)行定位航行，各組大鼠(n=5)進(jìn)行平臺(tái)尋找訓(xùn)練，每天分別從4個(gè)象限固定的位置入水，時(shí)間限定為60s，各象限之間間隔15 s，記錄大鼠分別從4個(gè)象限不同入水點(diǎn)找到平臺(tái)所需的時(shí)間，即游泳潛伏期(4次游泳潛伏期平均值)。若其沒(méi)有找到平臺(tái)，則記為60 s，同時(shí)仍使大鼠站在平臺(tái)上15 s。而后是空間探索測(cè)試，在第5天將平臺(tái)撤去后記錄大鼠從4個(gè)象限不同入水點(diǎn)到平臺(tái)的游泳軌跡(左上是目標(biāo)象限，平臺(tái)所在位置用圓框標(biāo)注)。時(shí)間設(shè)定為60 s，其余相同。

五、大鼠腦組織標(biāo)本制備及GAD67、GABABR1免疫組化染色

模型建立后第28天取大鼠(模型組、移植組各6只和假手術(shù)組5只)，用200 ml生理鹽水灌注后用4%多聚甲醛灌注固定。常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片(厚度為2 mm)。石蠟切片常規(guī)脫蠟止水，pH 6.0的檸檬酸修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)；磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferedsaline，PBS)漂洗3次，每次6 min；加入0.3%H2O2溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶15 min；PBS漂洗3次，每次6 min；加入驢血清封閉1 h后甩去血清分別加入GAD67(1∶800，Sigma，美國(guó))GABABR1 (1∶400，Abcam，美國(guó))抗體，在4°C冰箱中孵育過(guò)夜，洗脫。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明并封片，光鏡下分析計(jì)數(shù)。

六、大鼠海馬CA1區(qū)域GAD67、GABABR1的Western blotting檢測(cè)

各組大鼠(模型組、移植組各6只和假手術(shù)組5 只)麻醉狀態(tài)下經(jīng)左心室持續(xù)灌注200 ml 0．01 mol／L PBS后，在冰上斷頭輕柔分離大鼠海馬CA1組織加入強(qiáng)效組織裂解液1 ml提取蛋白，進(jìn)行蛋白定量(西安鼎國(guó))。配制10%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，按80 μg總蛋白上樣量上樣，5%濃縮膠、10%分離膠電泳后，100 V電壓2 h將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)上，麗春紅染色預(yù)染條帶，1×三乙醇胺緩沖鹽水溶液 (tris buffered saline and tween，TBST)洗3×5 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，1× TBST洗3×5 min。而后使用GAD67(1∶800，Sigma，美國(guó))GABABR1(1∶400，Abcam，美國(guó))抗體在4°C冰箱中孵育過(guò)夜，加入二抗后辣根過(guò)氧化物酶顯色。使用計(jì)算機(jī)-熒光掃描儀系統(tǒng)掃描底片而后用Image J統(tǒng)計(jì)分析。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SE)表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。雙因素方差分析用于水迷宮各參數(shù)分析，單因素方差分析用于檢測(cè)GAD67和GABABR1的表達(dá)水平。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2VO模型造模并移植BMSCs 28 d后，對(duì)三組(模型組，移植組和假手術(shù)組，各組n=5)進(jìn)行為期5 d的水迷宮測(cè)試(圖1)。模型組相比假手術(shù)組的游泳潛伏期有明顯差距。模型組在訓(xùn)練的3 d游泳潛伏期相比假手術(shù)組顯著上升(第2天44.167±2.313對(duì)比30.933±1.572，t=3.953，P=0.0341；第3天41.732± 2.372對(duì)比22.969±4.372，t=5.387，P=0.0181；第4天30.192±3.472對(duì)比14.300±3.157，t=4.690，P=0.0041)，而BMSCs移植后在移植組的表現(xiàn)則相比模型組更好(第3天33.165±1.777對(duì)比41.732±2.372，t=2.325， P=0.0372；第4天20.817±2.891對(duì)比30.192±3.472，t=2.743，P=0.0442)。而在隨后的空間探索測(cè)試中，移植組相比模型組在游泳軌跡方面顯然擁有更好的方向性(圖2)。

圖1 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期

二、免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

隨機(jī)選取各組大鼠(模型組、移植組各6只，假手術(shù)組5只)進(jìn)行海馬CA1區(qū)GAD67和GABABR1免疫組化染色切片，在光鏡下計(jì)數(shù)至少10個(gè)以上的高倍視野(200×)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖3)。模型組相比對(duì)照組GAD67(7.347±0.937對(duì)比21.544±1.333，t= 4.377，P=0.0053)和 GABABR1(5.374±0.057對(duì)比14.007±1.593，t=8.949，P=0.0007)染色強(qiáng)度明顯下降。相比模型組，移植組不同程度地上調(diào)了GAD67 (11.911±1.131對(duì)比7.347±0.937，t=3.992，P=0.0426) 和GABABR1(7.527±1.037對(duì)比5.374±0.057，t=4.012，P=0.0361)受體的表達(dá)。

三、Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的游泳軌跡

圖3 GAD67和GABABR1的免疫組化染色結(jié)果

與免疫組化結(jié)果相對(duì)應(yīng)，大鼠(模型組、移植組各6只，假手術(shù)組5只)海馬CA1區(qū)GAD67和GABABR1蛋白水平也呈現(xiàn)相應(yīng)的變化(圖4)。模型組相比假手術(shù)組，海馬CA1區(qū)GAD67(1.347±0.357對(duì)比2.237±0.956，t=5.478，P=0.0076)和GABABR1 (0.779±0.181對(duì)比 1.691±0.337，t=4.893，P=0.0073)蛋白水平顯著下降。而相比模型組，移植組GAD67 (1.611±1.007對(duì)比 1.347±0.357，t=2.379，P=0.0373) 和GABABR1(1.009±0.257對(duì)比0.779±0.181，t= 2.678，P=0.0441)表達(dá)水平明顯上調(diào)。

討論

圖4 GAD67和GABABR1的Western blot結(jié)果

血管性癡呆為老年癡呆的主要類型之一，其認(rèn)知障礙由腦組織血液循環(huán)障礙引起[1]，而2VO手術(shù)能夠很好復(fù)制疾病機(jī)制，引起血腦屏障破壞、認(rèn)知功能下降以及神經(jīng)元損傷等[4]，是近年來(lái)使用頻率最多且被廣泛認(rèn)可的血管性癡呆動(dòng)物模型之一。本研究發(fā)現(xiàn)在血管性癡呆大鼠造模28 d后，水迷宮測(cè)試(無(wú)論定位航行或者空間探索測(cè)試)模型組的表現(xiàn)比假手術(shù)組更差，提示2VO模型能夠復(fù)制認(rèn)知缺損。與此同時(shí)，GABA能系統(tǒng)缺陷在阿爾茲海默氏病，癲癇以及慢性缺血性腦損傷中都有報(bào)道[9,11,12]，本研究證實(shí)了海馬GABA能系統(tǒng)中GAD67和GABABR1 在2VO造模后慢性期(28 d)蛋白水平以及免疫組化染色強(qiáng)度明顯下降(尤其是在CA1區(qū))，提示CA1區(qū)GABA能系統(tǒng)可能是血管性癡呆相關(guān)認(rèn)知缺陷的重要靶點(diǎn)。

前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠2VO模型中BMSCs移植后能夠穿透血腦屏障，遷移到損傷的皮層，紋狀體以及海馬區(qū)域[13]，最終促進(jìn)神經(jīng)元、血管再生和認(rèn)知功能改善[14-16]。BMSCs由于其易于分離擴(kuò)增、多向分化、低免疫原性特征，在缺血性腦損傷中有巨大的治療潛力，然而有關(guān)于BMSCs治療的機(jī)制仍未明晰[17]。近年來(lái)不斷有研究發(fā)現(xiàn)雖然BMSCs在體內(nèi)定向分化的能力有限，但能夠以旁分泌的方式釋放GABA，VEGF和NGF等營(yíng)養(yǎng)因子[18,19]，在體外能夠直接提升共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元GABA能神經(jīng)傳導(dǎo)水平[20]，在體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)局部的微環(huán)境并促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、血管再生[13]。GABA能中間神經(jīng)元大量存在于海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元中，并且對(duì)認(rèn)知功能有重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大鼠血管性癡呆模型慢性期，BMSCs移植后海馬CA1區(qū)域GABA能系統(tǒng)中重要靶點(diǎn)(GAD67、GABABR1)的表達(dá)水平相比模型組不同程度上調(diào)，水迷宮認(rèn)知能力測(cè)試亦發(fā)現(xiàn)移植組的表現(xiàn)比模型組展現(xiàn)出更好的認(rèn)知能力，提示BMSCs移植對(duì)血管性癡呆相關(guān)認(rèn)知改善可能是通過(guò)上調(diào)海馬CA1區(qū)域的GAD67和GABABR1的表達(dá)進(jìn)行的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的血管性癡呆模型，探討了BMSCs移植對(duì)血管性癡呆大鼠的認(rèn)知功能改善和GAD67、GABABR1的表達(dá)的調(diào)控作用，證明了BMSCs移植能夠通過(guò)上調(diào)血管性癡呆大鼠海馬區(qū)域GAD67、GABABR1等GABA能系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子來(lái)減輕認(rèn)知功能障礙。為臨床BMSCs自體移植治療血管性癡呆提供了一定理論依據(jù)。然而BMSCs在移植之后如何整合入抑制性神經(jīng)突觸中并且促進(jìn)抑制性神經(jīng)元的相關(guān)分子表達(dá)仍未明晰，還有待于進(jìn)一步探討。

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The effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on the cognitive ability in arat model of vascular dementia

Hei Yue1,Fan Cairui2,Long Qianfa3,Luo Qiang3,Wei Lizhou1,Yi Xicai1,Liu Weiping1.1Department of Neurosurgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University, Xi’an 710032,China;2Department of Neurosurgery,187th Hospital of PLA,Haikou 571100，China; 3 Department of Neurosurgery,Xi’an central hospital,Xi’an Jiao Tong University,Xi’an 710003,China Corresponding author:Liu Weiping,Email:liuwp@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) transplantation on bilateral common carotid artery occlusion (2VO)-induced cognitive impairments and expression of GAD67 and GABABR1 in the hippocampal CA1 subfield.Methods 60 adult male SD rats were randomly divided into Sham group(n=20),group(n=20)and BMSCs group(n=20).BMSCs transplantation was performed 2 h after the surgery of 2VO.After 28 days,Morris Water Maze(MWM) test was performed to investigate the cognitive changes,and Western blot and immunohistochemistry were used to evaluate the expression of GAD67 and GABABR1 in the hippocampal CA1 subfield.Results(1)Western blot and immunohistochemistry showed that compared to sham group,the expression of GAD67 and GABABR1 (protein level and the intensity of immunohistochemical staining) lowered(1.347±0.357 vs.2.237±0.956，t=5.478，P=0.0076；0.779±0.181 vs.1.691±0.337，t= 4.893，P=0.0073,respectively).(2)while BMSCs transplants partly reversed these changes(1.611± 1.007 vs.1.347±0.357，t=2.379，P=0.0373；1.009±0.257 vs.0.779±0.181，t=2.678，P=0.0441, respectively). (3)MWM also showed thatcognitive ability in the BMSCs group improved significantly(20.817±2.891 vs.30.192±3.472，t=2.743，P=0.0442)compared to VaD group.Conclusion BMSCs transplantation could improve the expression of GAD67 and GABABR1 in the hippocampal CA1 subfield and restore the cognitive ability in a rat model of vascular dementia.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Vascular dementia; Cell transplantation; GAD67;GABABR1

2015-05-11)

(本文編輯：張麗)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.05.007

陜西省科技統(tǒng)籌基金資助項(xiàng)目（2013KTCL03-08）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科1；571100?？?，解放軍第187醫(yī)院神經(jīng)外科2；710003西安，西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科3

劉衛(wèi)平，Email：liuwp@fmmu.edu.cn

黑悅,樊才瑞,龍乾發(fā),等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志, 2015,1(5)：281-285.