CD4+CD25+Treg細胞及其相關細胞因子在HBV感染孕婦胎盤組織中的表達

曾曉明，鄭九生，龔維

(江西省婦幼保健院產科，江西 南昌330006)

乙型肝炎病毒(HBV)感染已成為全世界重大公共衛(wèi)生問題，與各種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，我國乙肝病毒慢性攜帶者高達1億多，其中30%~50%是通過母嬰垂直傳播感染導致[1]，因此，故控制和減少HBV母嬰垂直傳播是防治HBV感染的重要途徑。宮內感染是HBV母嬰傳播最主要途徑，目前阻斷HBV宮內感染的最有效方法為新生兒出生24h內聯(lián)合使用乙肝高效價免疫球蛋白及乙肝疫苗，但HBeAg陽性孕婦的新生兒有5%~15%阻斷失敗。因此，有必要進一步研究HBV宮內感染機制，尤其是孕產婦HBeAg陽性時宮內感染率高的機制，以便探討更有效的阻斷方法。

目前對于HBV宮內感染的機制仍不十分明確。近年來，CD4+CD25+Treg細胞(Tregs)對HBV宮內感染影響的研究受到關注。FOXP3是目前公認的Tregs特異的免疫標志[2];IL-10、TGF-β1是Tregs所分泌的抑制性細胞因子，對Tregs的抑制功能具有重要作用[3]?，F(xiàn)階段對于Tregs與HBV宮內感染關系主要集中在孕婦外周血及新生兒臍帶血Tregs表達的研究，對于孕婦胎盤組織中細胞因子水平與HBV宮內感染發(fā)生的研究較少，在這方面有必要進一步探索。本研究采用免疫組化(二步法)檢測HBV宮內感染孕婦胎盤組織中Foxp3表達，將Foxp3作為檢測Tregs的指標；同時采用免疫組化法檢測胎盤組織中細胞因子IL-10及TGF-β1的表達，研究HBV感染孕婦胎盤組織中Tregs及其相關因子與HBV宮內感染的相關性，探討孕產婦HBeAg陽性時宮內感染發(fā)生率高的機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012年6月至2014年10月在我院分娩109例HBV感染孕婦作為研究對象(其中HBsAg及HBeAg雙陽性58例；HBsAg陽性且HBeAg陰性孕婦51例)，納入標準：(1)足月、單胎妊娠；(2)HBsAg陽性但肝功能正常；(3)無子癇前期、胎兒生長受限等并發(fā)癥。HBV宮內感染診斷標準：臍靜脈血檢測提示HBsAg陽性或合并HBVDNA陽性，考慮HBV宮內感染[4]。

按照HBV宮內感染診斷標準，將發(fā)生HBV宮內感染的孕婦設為宮內感染組，將未發(fā)生宮內感染的孕婦設為宮內未感染組，兩組孕婦的臨床資料(年齡、孕產次、孕周)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；依據孕婦HBV血清學標志物檢查結果，將HBsAg及HBeAg雙陽性孕婦設為HBeAg陽性組；將HBsAg陽性且HBeAg陰性孕婦設為HBeAg陰性組，兩組孕婦的臨床資料(年齡、孕產次、孕周)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

1.2 主要試劑 Foxp3鼠抗人單克隆抗體、IL-10兔抗人多克隆抗體購自艾博抗公司；TGF-β1兔抗人多克隆抗體購自福州邁新公司；通用型二抗、DAB試劑盒購自中杉金橋公司。

1.3 實驗方法 標本采集：新生兒娩出并斷臍后，在胎盤娩出前，抽5ml臍靜脈血，送本院檢驗科檢測臍帶血HBV-DNA以及乙肝六項；娩出胎盤后，快速用手術刀取小塊包括母體面和胎兒面的胎盤組織，采取的部位在胎盤中央附近，避開鈣化點，采取面積約2cm×2cm×2cm大小 ，生理鹽水洗凈，10%多聚甲醛液中固定24h，在病理科脫水，常規(guī)包埋制成石蠟塊，4℃冰箱內放置保存待用。

采用免疫組化(二步法)檢測宮內感染組及未宮內感染組孕婦胎盤組織中Foxp3、IL-10及TGF-β1的表達，F(xiàn)oxp3工作濃度分別為 1：200，IL-10及TGF-β1工作濃度為1：100，具體操作同說明書。每批染色均設陽性對照(Foxp3、IL-10陽性對照片由abcam公司提供，TGF-β1陽性對照片由福州邁新公司提供)和陰性對照(PBS代替一抗)。

1.4 結果判定 陽性細胞判定：細胞具有完整結構，細胞漿呈黃色或棕黃色顆粒，細胞核為藍色者為陽性細胞；陰性細胞判定：細胞具有完整結構，細胞漿未被染成棕褐色，顯示為淺藍色。半定量分析：在顯微鏡200放大倍數(shù)下觀察陽性細胞，每張切片隨機觀察5個視野，綜合陽性細胞所占比例(A)及細胞漿著色深淺(B)計分。 陽性細胞所占比例 (A)：<5% 計 0分，5%～25%計 1分，26%～50%計2分，>50% 計3分；細胞漿著色深淺(B)：無著色計0分，淺棕黃色計1分，黃色計2分，棕褐色計3分。兩項指標的計分數(shù)相乘(A×B)進行半定量：積分0分為陰性，1～3分為輕度陽性，4～6分為中度陽性，7～9 分為強陽性[5]。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSSl7.0軟件分析數(shù)據，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；細胞因子表達強度采用等級資料秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBV宮內感染率 109例HBV感染孕婦共發(fā)生宮內感染12例，宮內感染率為11.01%。采用χ2檢驗方法統(tǒng)計分析，結果顯示HBeAg陽性組宮內感染率明顯高于HBeAg陰性組(P<0.01)，見表1。

表1 HBV宮內感染率

2.2 胎盤組織中 Foxp3、IL-10、TGF-β1 陽性細胞定位及表達部位 胎盤組織的病理圖片均為DAB染色，F(xiàn)oxp3、TGF-β1及IL-10陽性細胞都主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞、絨毛血管內皮細胞、蛻膜細胞，在絨毛間質細胞有少量表達，表達部位在細胞漿。Foxp3、IL-10、TGF-β1陽性細胞在各組中分布基本一致。各組胎盤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1的表達及PBS陰性對照見圖1~6。

2.3 宮內感染組與宮內未感染組孕婦胎盤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1表達的陽性率比較 宮內感染組 Foxp3、IL-10、TGF-β1 在胎盤組織中較宮內未感染組表達的陽性率顯著增高，采用秩和檢驗

圖1 Foxp3在宮內未感染組與宮內感染組胎盤組織中的表達(×200)

圖3 TGF-β1在宮內未感染組與宮內感染組胎盤組織中的表達(×200)

圖5 IL-10在HBeAg陰性組與HBeAg陽性組胎盤組織中的表達(×200)

圖4 Foxp3在HBeAg陰性組與HBeAg陽性組胎盤組織中的表達(×200)

圖6 TGF-β1在 HBeAg陰性組與HBeAg陽性組胎盤組織中的表達(×200)

方法統(tǒng)計分析，顯示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見 表2~4。

表2 宮內感染組與宮內未感染組孕婦胎盤組織中Foxp3表達的陽性率[n(%)]

表3 宮內感染組與宮內未感染組孕婦孕婦胎盤組織中IL-10表達的陽性率[n(%)]

表4 宮內感染組與宮內未感染組孕婦胎盤組織中TGF-β1表達的陽性率[n(%)]

2.4 HBeAg陽性組及HBeAg陽性組胎盤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1 表達的陽性率比較 HBeAg陽性組 Foxp3、IL-10、TGF-β1 在胎盤組織中較HBeAg陰性組表達的陽性率顯著增高，采用秩和檢驗方法統(tǒng)計分析，顯示差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，見表 5~7。

3 討論

3.1 胎盤組織中CD4+CD25+Treg細胞與HBV宮內感染發(fā)生的關系 Tregs是一種具有抑制功能的T細胞亞群 ,能抑制自身反應性T淋巴細胞、CD4+和CD8+T細胞、NK細胞、B細胞及其他免疫細胞的功能[6]。其表面表達很多表面分子，主要有FOXP3、TNFR、CD122、CTLA4、CD134 等[7]， 其 中 Foxp3 是目前公認的Tregs特異的免疫標志，國內也有許多研究檢測胎盤組織中Foxp3表達作為胎盤組織Tregs 的指標[8，9]。

表5 HBeAg陽性組與HBeAg陰性組孕婦胎盤組織中Foxp3表達的陽性率[例(%)]

表6 HBeAg陽性組與HBeAg陰性組孕婦胎盤組織中IL-10表達的陽性率[例(%)]

表7 HBeAg陽性組與HBeAg陰性組孕婦胎盤組織中TGF-β1表達的陽性率[例(%)]

輔助性T淋巴細胞 (Th)屬于CD4+T細胞亞群，分為Th1和 Th2細胞，Th1細胞產生IL-2和IFN-γ 等細胞因子，Th2 細胞產生 lL-4、IL-10、與IL-13等細胞因子，Th1/Th2細胞處于動態(tài)平衡才能維持細胞免疫和體液免疫正常的功能。近年許多研究表明，發(fā)生HBV宮內感染時，新生兒及其母親外周血 Tregs數(shù)量增多，并存在Th1/Th2細胞免疫失衡[10，11]。鄭九生等采用流式細胞儀檢測HBV宮內感染的母親及其新生兒Tregs表達水平和DAS-ELISA法檢測IFN-γ水平及IL-4水平，提示宮內感染組孕婦存在Th1/Th2細胞免疫失衡，Th1細胞免疫反應下調而 Th2細胞免疫反應增強，病毒難以被清除，參與HBV宮內感染[12]。

胎盤中絨毛間隙充滿著母體的血液，HBV病毒可以通過感染胎盤再而感染胎兒[13]。但胎盤感染發(fā)生的細胞因子機制尚不明確，現(xiàn)階段對于Tregs與HBV宮內感染關系主要集中在孕婦外周血及新生兒臍帶血Tregs水平的研究，對于孕婦胎盤組織中細胞因子水平與HBV宮內感染發(fā)生的研究較少，有必要進一步研究。本研究采用免疫組化(二步法)檢測HBV感染孕婦胎盤組織中Foxp3表達水平，作為檢測 Tregs的指標，研究胎盤組織Tregs表達與HBV宮內感染發(fā)生的關系。我們的研究顯示胎盤組織中Foxp3陽性細胞主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞、絨毛血管內皮細胞、蛻膜細胞，在絨毛間質細胞有少量表達，主要表達部位為細胞漿，這與何永文等報道基本一致[8]；宮內感染組孕婦胎盤組織中Foxp3表達陽性率91.6%，明顯高于宮內未感染組的42.2%，說明Tregs數(shù)量增多可能是HBV宮內感染發(fā)生的危險因素之一，推測胎盤感染HBV時，Tregs通過其免疫抑制功能，抑制HBV特異性免疫應答，使清除HBV和抑制炎癥反應對組織的損傷達到免疫平衡，當Tregs增多，這種免疫平衡被打破，胎盤組織中HBV難以被清除，導致胎盤感染持續(xù)，參與HBV宮內感染的發(fā)生。但是目前國內外對于胎盤組織中Tregs與HBV宮內感染的相關研究不多，其發(fā)生機制并不明確，胎盤組織中Tregs增多在HBV宮內感染的發(fā)生中是否起關鍵作用并不清楚。

3.2 胎盤組織中TGF-β1和IL-10與HBV宮內感染 TGF-β1和IL-10是具有免疫抑制作用的細胞因子，主要是由Tregs分泌產生，妊娠過程中胎盤滋養(yǎng)細胞也可產生。TGF-β1可以明顯抑制T細胞增生及NK細胞、CTL的活性；IL-10可阻止T細胞受體介導的CD4+T細胞的活化，能抑制TNF等細胞因子，兩者在免疫功能調節(jié)中具有重要作用。周建研究結果發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者HBV載量越高，IL-10的水平越高，說明IL-10水平增高不利于HBV 的清除[14]。

解長銀等[15]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1主要表達于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞和蛻膜細胞，主要表達部位為細胞漿 ；趙芳等[16]發(fā)現(xiàn)，IL-10主要表達于胎盤合體滋養(yǎng)細胞和細胞滋養(yǎng)細胞中。本實驗應用免疫組化二步法對HBV感染孕婦患者胎盤的TGF-β1和IL-10的表達進行定位和半定量檢測，結果顯示，TGF-β1及IL-10陽性細胞都主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞、絨毛血管內皮細胞、蛻膜細胞，在絨毛間質細胞有少量表達，主要表達部位在細胞漿。與解長銀、趙芳等報道分布基本一致。

同時，我們的研究還顯示HBV宮內感染孕婦胎盤組織中TGF-β1和IL-10陽性表達率均較宮內未感染組明顯增高，說明胎盤組織中細胞因子IL-10、TGF-β1表達水平升高可能是HBV宮內感染發(fā)生機制之一，推測胎盤組織中細胞因子TGF-β1和IL-10表達水平升高時，通過其免疫抑制作用，導致Th1/Th2細胞免疫失衡，HBV特異性免疫應答受到抑制，胎盤組織中病毒難以被清除，導致HBV宮內感染的發(fā)生。

3.3 HBeAg陽性與HBV宮內感染 HBeAg是HBV復制和傳染的指標，大量研究表明孕婦血HBeAg陽性是HBV宮內感染的高危因素。謝小娟等[17]發(fā)現(xiàn)大三陽孕婦宮內感染率其新生兒HBV感染率明顯升高，且隨HBV-DNA量的升高而增加。我們的研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性組宮內感染率18.96%，遠高于HBeAg陰性組(1.96%)，差異有顯著意義，說明孕產婦HBeAg陽性會增加HBV宮內感染發(fā)生率，這與謝小娟等研究結果一致。

目前關于孕產婦HBeAg陽性增加HBV宮內感染發(fā)生風險的機制存在爭議，馬麗娟等[18]研究認為孕婦HBeAg陽性者其新生兒存在Th1/Th2細胞免疫失衡，導致不能及時有效地清除HBV使宮內感染易于發(fā)生；張永臣等[19]研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性組孕產婦的新生兒外周血Tregs明顯高于HBeAg陰性組，導致新生兒免疫調節(jié)功能低下；也有學者認為HBeAg導致滋養(yǎng)細胞發(fā)育不良，使胎盤喪失其對胎兒的屏障保護作用，從而導致宮內感染的發(fā)生；而張薇莉等[20]認為HBeAg可選擇性通過胎盤屏障進入胎兒體內，使新生兒出生后出現(xiàn)HBeAg血癥；

而我們的研究顯示HBeAg陽性組胎盤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1 較 HBeAg 陰性組陽性表達率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明孕產婦HBeAg陽性時，其胎盤組織中存在Tregs增多及其相關因子表達水平升高，推測這可能是HBeAg陽性孕產婦HBV宮內感染發(fā)生率高的機制之一。

3.4 總結與展望 綜上所述，我們的研究說明：HBV感染孕婦胎盤組織中Tregs增多可能是發(fā)生HBV宮內感染的危險因素之一；胎盤組織中IL-10和TGF-β1表達增高可能是HBV宮內感染的發(fā)生機制之一；孕產婦HBeAg陽性時，其胎盤組織中存在Tregs增多及其相關因子表達水平升高，推測這可能是HBeAg陽性孕產婦HBV宮內感染發(fā)生率高的機制之一。我們推測Tregs增多及其相關因子表達水平升高時，通過其免疫抑制功能，導致Th1/Th2細胞免疫失衡，抑制HBV特異性免疫應答，使胎盤組織中病毒難以被清除，導致感染持續(xù)，進一步導致HBV宮內感染發(fā)生。

但是目前國內外對于胎盤組織中Tregs與HBV宮內感染的相關研究不多，胎盤組織中Tregs增多及其相關因子表達水平升高在HBV宮內感染的發(fā)生中是否起關鍵作用并不清楚，仍然需要進一步研究，以探索預防HBV宮內感染的更好辦法。

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