早期胃癌hMLH1和hMSH2基因表達及意義

鞠輝，劉希雙，夏頔，劉華，張翠萍，江月萍

(青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 消化內(nèi)科； 2 急診內(nèi)科)

?

早期胃癌hMLH1和hMSH2基因表達及意義

鞠輝1，劉希雙1，夏頔2，劉華1，張翠萍1，江月萍1

(青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 消化內(nèi)科； 2 急診內(nèi)科)

目的 探討早期胃癌胃黏膜組織hMLH1和hMSH2蛋白的表達及其意義。方法 選取內(nèi)鏡下切除早期胃癌組織45例、癌前病變組織38例以及胃鏡下活檢慢性胃炎組織42例，采用免疫印跡法檢測hMLH1和hMSH2蛋白的表達。結果 慢性胃炎及癌前病變組織hMLH1蛋白表達高于早期胃癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(F=9.578，P<0.05)；早期胃癌組織hMSH2蛋白表達高于癌前病變與慢性胃炎組織，差異有統(tǒng)計學意義(F=32.952，P<0.05)。早期胃癌病人hMSH2及hMLH1蛋白表達與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、組織學類型等無關(P>0.05)。幽門螺桿菌(Hp)感染組早期胃癌組織hMSH2陽性表達率低于非Hp感染組(χ2=22.361，P<0.05)，癌前病變、慢性胃炎組織hMSH2陽性表達率也低于非Hp感染組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Hp感染組早期胃癌、癌前病變和慢性胃炎組織hMLH1陽性表達率均低于非Hp感染組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 在慢性胃炎、癌前病變和早期胃癌的發(fā)展過程中，hMSH2基因表達增加，hMLH1基因表達減少。Hp感染可能通過影響hMSH2與hMLH1基因表達，影響早期胃癌的發(fā)生。

胃腫瘤；癌前狀態(tài)；DNA錯配修復；幽門螺桿菌

早期胃癌是指癌組織僅限于胃黏膜層與黏膜下層，不論有無淋巴結轉移[1]。早期胃癌的早期診斷與治療可提高胃癌的治愈率。目前胃癌的發(fā)生機制不明，近來研究表明，錯配修復基因(MMR)的突變參與腫瘤的發(fā)生，MMR基因中hMLH1和hMSH2的異常改變與胃腸道腫瘤發(fā)生有關[2-3]。幽門螺桿菌(Hp)感染也被認為是胃癌發(fā)生原因之一，但是目前機制不明。既往我們分析了胃癌、癌旁組織與慢性胃炎組織中hMLH1和hMSH2的表達[4]，本文進一步分析早期胃癌、癌前病變(低級別上皮內(nèi)瘤變)以及慢性胃炎組織中hMLH1和hMSH2基因表達及其與Hp感染的關系。

1 材料和方法

1.1 標本及其來源

標本均取自我院消化內(nèi)鏡中心切除或活檢的胃黏膜組織。早期胃癌組織45例，術后病理檢查為高級別上皮內(nèi)瘤變、高分化腺癌等；其中男28例，女17例，平均年齡為(50.3±10.6)歲。癌前病變組織38例，病理活檢為低級別上皮內(nèi)瘤變；其中男26例，女12例，平均年齡為(45.3±9.4)歲。慢性胃炎組織42例，其中慢性非萎縮性胃炎24例，慢性萎縮性胃炎18例；男24例，女18例，平均年齡為(52.3±11.5)歲。將上述標本取出后進行標記號碼，統(tǒng)一置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蛋白樣品制備與免疫印跡檢測

分別取早期胃癌、癌前病變及慢性胃炎黏膜組織，搗碎，裂解，高速離心15 min。取50 μg上清液在凝膠上恒壓電泳分離3 h，轉移至PVDF膜上，室溫封閉2 h，加入一抗(抗hMSH2、抗hMLH1小鼠單克隆抗體，SANTA CRUZ生物公司)，在4 ℃下與PVDF膜混合過夜。以TBS液洗滌4次，每次20 min，再與二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，聯(lián)科生物公司)結合，室溫放置2 h，然后再以TBS液洗3次，每次20 min。倒入ECL發(fā)光液，充分混合后，以保鮮膜覆蓋，暗盒中放置5 min，觀察結果。應用BIO-RAD圖像分析軟件進行分析，設空白對照相對密度值為0，以hMSH2及hMLH1蛋白表達的條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示各病變組織的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同組織hMSH2和hMLH1蛋白表達比較

慢性胃炎及癌前病變組織hMLH1蛋白的表達高于早期胃癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(F=9.578，P<0.05)；慢性胃炎與癌前病變組織比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。慢性非萎縮性胃炎組織hMLH1蛋白表達與萎縮性胃炎組織比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。早期胃癌組織hMSH2蛋白表達均高于癌前病變與慢性胃炎組織，癌前病變組織高于慢性胃炎組織，差異均有統(tǒng)計學意義(F=32.952，P<0.05)。見圖1、表1。

2.2 hMSH2和hMLH1蛋白表達與早期胃癌臨床病理特征的關系

早期胃癌病人hMSH2和hMLH1蛋白表達與病人年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、組織學類型等無關(P>0.05)。見表2。

2.3 不同組織hMSH2和hMLH1基因表達與Hp感染的關系

Hp感染組早期胃癌組織hMSH2基因的表達陽性率低于非Hp感染組(χ2=22.361，P<0.05)，癌前病變、慢性胃炎組織hMSH2陽性表達率也低于非Hp感染組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Hp感染組早期胃癌組織、癌前病變組織和慢性胃炎組織hMLH1陽性表達率均低于非Hp感染組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

①、③早期胃癌組織；②、④癌前病變組織；⑤慢性胃炎組織。

表1 各組織hMSH2和hMLH1蛋白表達比較

表2 hMSH2和hMLH1蛋白表達與早期胃癌臨床病理特征的關系

3 討 論

腫瘤的發(fā)生過程中包括多個癌基因的激活和抑癌基因的失活。MMR基因由一系列酶分子組成，能夠在DNA修復過程中識別錯配堿基，消除不配對堿基，具有修復DNA堿基錯配、增強DNA復制忠實性、維持基因組穩(wěn)定性和降低自發(fā)性突變的功能[5-6]。hMSH2和hMLH1是MMR家族中較為重要的基因，如果出現(xiàn)異常，可能會導致細胞錯配修復功能缺陷，表現(xiàn)為復制錯誤或微衛(wèi)星不穩(wěn)定，因而易發(fā)生腫瘤[7-8]。hMSH2基因位于染色體2p22-21，基因全長73 000 bp，其中含有16個外顯子，cDNA全長3 116 bp，其開放閱讀框架長為2 727 bp，編碼909個氨基酸序列[9-10]。hMLH1基因則位于染色體3p21.3-23，基因全長58 000 bp，含有19個外顯子，cDNA開放閱讀框架長2 268 bp，編碼765個氨基酸序列[3,11]。hMSH2蛋白易與hMSH6、hMSH3蛋白分別形成復合體，識別錯配位點，啟動錯配修復[12]。hMLH1可與hMLH3形成復合物，協(xié)助hMLH1完成修復功能。但是大部分hMLH1基因可能會突變形成終止密碼,導致蛋白翻譯不能完成，致使其修復基因功能不全,導致腫瘤發(fā)生[13]。

表3 各組hMSH2和hMLH1基因表達與Hp感染的相關性(例(χ/%))

通常認為，胃癌發(fā)生是一個多病因、多階段的連續(xù)過程，包括慢性胃炎、癌前病變和胃癌(包括早期胃癌)[1,14]。本文結果顯示，早期胃癌組織hMSH2蛋白的表達高于癌前病變和慢性胃炎組織，考慮hMSH2蛋白在胃癌中高表達的原因可能為，在某些因素的不斷刺激下，一些增殖活躍的細胞容易出現(xiàn)基因的多點突變和DNA復制錯誤，使hMSH2基因表達代償性上調(diào)，但增多的基因產(chǎn)物仍不足以修復已發(fā)生損傷的基因，使細胞惡性轉化，也不排除hMSH2基因自身可能發(fā)生突變，編碼有缺陷的產(chǎn)物增加，促進腫瘤的發(fā)生。一些分化未成熟細胞，其DNA表達出現(xiàn)堿基錯配或缺失，需要錯配基因修復系統(tǒng)的修復[3]，此時MMR基因尤其是hMSH2與hMLH1表達就會發(fā)生改變，這種改變在消化道、生殖腺等組織變化更為明顯[15]。既往研究結果顯示，hMSH2蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織和胃炎黏膜組織，癌旁組織hMSH2的表達較胃炎組織明顯增多，表明癌細胞旺盛的增殖活動對hMSH2基因表達具有上調(diào)作用[16]。LEACH等[17]研究顯示，在原發(fā)性膀胱癌病人的膀胱沖洗液中hMSH2陽性表達增加。但也有一些研究結果顯示，在某些腫瘤組織中hMSH2基因表達減少或缺失，而hMSH2表達下調(diào)或缺失的腫瘤通常伴有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性反映了錯配修復系統(tǒng)的缺陷[18-19]。

本文的研究結果顯示，早期胃癌病人hMLH1和hMSH2的表達與其年齡、性別及腫瘤部位、組織學類型、浸潤深度、分化程度等無關。既往有研究顯示，消化系統(tǒng)惡性腫瘤中MMR基因表達與病人的年齡、性別及腫瘤部位、組織學類型、浸潤深度、分化程度、腫瘤分期、有無淋巴結轉移等無關[4,20]。但也有研究表明，不同性別、年齡結腸癌病人hMLH1基因甲基化表達存在差異，并且其表達呈增加趨勢，導致hMLH1基因表達減少[21]。

本文研究結果還顯示，早期胃癌組織hMLH1基因表達明顯低于癌前病變組織及慢性胃炎組織，表明hMLH1的高表達在一定程度上可能會抑制DNA突變或損傷所造成的細胞惡變趨勢，進而抑制惡性腫瘤的發(fā)生。hMLH1在執(zhí)行錯配修復時與hPMS2構成異源二聚體hMutLα，具有提高與錯配修復基因結合效率的功能[22]。hMLH1表達下調(diào)的原因，可能是基因突變引起的表達缺失，而更可能的是因為啟動子區(qū)域甲基化。hMLH1表達下調(diào)導致錯配修復效率下調(diào)，造成突變的累積及腫瘤的發(fā)生。一般認為，慢性萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變是胃癌發(fā)生發(fā)展中的一個階段。本研究癌前病變組與慢性胃炎組相比，hMLH1基因表達減少，但差異無統(tǒng)計學意義，這可能在一定程度上預示病變進一步發(fā)展，最終可能發(fā)生胃癌。既往某些研究結果與本文結果相似，BAEK等[23]研究顯示，大部分胃癌病人可見hMLH1表達缺失或減少；PEIRO等[24]研究顯示，子宮內(nèi)膜癌病人MLH1表達缺失。

既往認為Hp感染導致胃癌一般遵循從慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、不典型增生到胃癌的演變過程[1]。一般認為，Hp侵襲胃黏膜引起的慢性炎癥可導致大量氧自由基的產(chǎn)生，部分代謝產(chǎn)物為基因毒性物質(zhì)[25]。本文結果顯示，Hp感染組早期胃癌組織hMLH1、hMSH2陽性表達率顯著低于非Hp感染組，而Hp感染組癌前病變和慢性胃炎組織hMLH1、hMSH2陽性表達率與非Hp感染組比較差異無顯著意義，但是表達水平存在下降的趨勢，提示Hp感染可能對hMLH1、hMSH2表達有影響，其機制目前不明確。有研究結果表明，向胃黏膜培養(yǎng)細胞液中加入Hp后，hMLH1和hMSH2的表達均有所下降[26]。

綜上所述，在慢性胃炎、癌前病變、早期胃癌的疾病發(fā)展過程中，hMSH2基因表達增加，hMLH1基因表達減少。Hp感染可能通過影響hMSH2和hMLH1基因表達，影響早期胃癌的發(fā)生。但仍有許多問題，如慢性萎縮性胃炎、癌前病變、早期胃癌與MMR家族其他修復基因的關系等，今后需要進一步研究。

[1] JACOB S, PRAZ F. DNA mismatch repair defects: role in colorectal carcinogenesis[J]. Biochimie, 2002,84(1):27-47.

[2] APADOULOS N, LINDBLOM A. Molecular basis of HNPCC: mutations of MMR genes[J]. Hum Mutat, 1997,10(2):89-99.

[3] 馬堅妹,王朝暉,劉敏,等. 錯配修復基因hMSH2和hMLH1在胃癌組織中的表達及其與幽門螺桿菌感染的關系[J]. 癌癥, 2004,23(5):535-539.

[4] 夏頔,劉希雙,楊堃,等. 錯配修復基因hMLH1和hMSH2在胃癌組織中的表達及其意義[J]. 世界華人消化雜志, 2009,17(33):3446-3450.

[5] ARAI T, KASAHARA I, SAWABE M, et al. Role of methylation of the hMLH1 gene promoter in the development of gastric and colorectal carcinoma in the elderly[J]. Geriatr Gerontol Int, 2010,10(Suppl 1): S207-S212.

[6] KULKE M H, THAKORE K S, THOMAS G, et al. Microsatellite instability and hMLH1/hMSH2 expression in Barrett esophagus-associated adenocarcinoma[J]. Cancer, 2001,91(8):1451-1457.

[7] 任志華,譚齊賢,劉成玉. DNA錯配修復與白血病關系的研究進展[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2004,19(6):553-555.

[8] FLANAGAN S, KROKOSKY C M, MANNAVA S, et al. MLH1 deficiency enhances radiosensitization with 5-fluorodeoxyuridine by increasing DNA mismatches[J]. Mol Pharmacol, 2008,74(3):863-871.

[9] LYNCH H T, WATSON P, SHAW T G, et al. Clinical impact of molecular genetic diagnosis, genetic counseling, and management of hereditary cancer. Part Ⅱ: Hereditary nonpo-lyposis colorectal carcinoma as a model[J]. Cancer, 1999,86(11 Suppl):2457-2463.

[10]LEE H J, JANG Y J, LEE E J, et al. The significance of mismatch repair genes in gastric cancer[J]. J Cancer Res Ther, 2013,9(1):80-83.

[11]MOGHBELI M, MOAVEN O, MEMAR B, et al. Role of hMLH1 and E-cadherin promoter methylation in gastric cancer progression[J]. J Gastrointest Cancer, 2014,45(1):40-47.

[12]GRAS E, CATASUS L, ARGUELLES R, et al. Microsatellite instability, MLH-1 promoter hypermethylation, and fra-meshift mutations at coding mononucleotide repeat microsatellites in ovarian tumors[J]. Cancer, 2001,92(11):2829-2836.

[13]YOSHIKAWA H. DNA methylation and cancer[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2007,34:145-149.

[14]郝建波,張勁峰,羅波,等. 胃癌陰性淋巴結微轉移的檢測及意義[J]. 青島大學醫(yī)學院學報, 2012,48(6):495-497,499.

[15]HIRAI Y, BANNO K, SUZUKI M, et al. Molecular epidemiological and mutational analysis of DNA mismatch repair (MMR) genes in endometrial cancer patients with HNPCC-associated familial predisposition to cancer[J]. Cancer Sci, 2008,99(9):1715-1719.

[16]FISHEL R, EWEL A, LEE S, et al. Binding of mismatched microsatellite DNA sequences by the human MSH2 protein[J]. Science, 1994,266(5189):1403-1405.

[17]LEACH F S, HSIEH J T, MOLBERG K, et al. Expression of the human mismatch repair gene hMSH2:a potential marker for urothelial malignancy[J]. Cancer, 2000,88(10):2333-2341.

[18]PRTILO A L, LEACH F S, MARKWALDER R E, et al. Tissue microarray analysis of hMSH2 expression predicts outcome in men with prostate cancer[J]. J Urol, 2005,174(5):1814-1818.

[19]KOSTER F, SCHROER A, FISCHER D, et al. Correlation of DNA mismatch repair protein hMSH2 immunohistochemistry with p53 and apoptosis in cervical carcinoma[J]. Anticancer Res, 2007,27(1A):63-68.

[20]馬德民,張杰,張濤. 錯配修復基因 hMLH1、hMLH2與胰腺癌的相關性[J]. 中華消化病與影像雜志:電子版, 2014,4(5):203-207.

[21]MENIGATTI M, TRUNINGER K, GEBBERS J O, et al. Normal colorectal mucosa exhibits sex-and segment-specific susceptibility to DNA methylation at the hMLH1 and MGMT promoters[J]. Oncogene, 2009,28(6):899-909.

[22]LIPKIN S M, WANG V, JACOBY R, et al. MLH3: a DNA mismatch repair gene associated with mammalian microsatellite instability[J]. Nat Genet, 2000,24(1):27-35.

[23]BAEK M J, KANG H, KIM S E, et al. Expression of hMLH1 is inactivated in the gastric adenomas with enhanced microsa-tellite instability[J]. Br J Cancer, 2001,85(8):1147-1152.

[24]PEIRO G, DIEBOLD J, MAYR D, et al. Prognostic relevance of hMLH1,hMSH2,and BAX protein expression in endometrial carcinoma[J]. Mod Pathol, 2001,14(8):777-783.

[25]KAKAR S, BURGART L J, THIBODEAU S N, et al. Frequency of loss of hMLH1 expression in colorectal carcinoma increases with advancing age[J]. Cancer, 2003,97(6):1421-1427.

[26]KIM J J, TAO H, CARLONI E, et al. Helicobacter pylori impairs DNA mismatch repair in gastric epithelial cells[J]. Gastroenterology, 2002,123(2):542-553.

(本文編輯 馬偉平)

THE EXPRESSIONS AND SIGNIFICANCE OF HMLH1 AND HMSH2 IN EARLY GASTRIC CANCER

JUHui,LIUXishuang,XIADi,LIUHua,ZHANGCuiping,JIANGYueping

(Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the expressions of hMLH1 and hMSH2 proteins in mucous membrane of early-stage gastric cancer and their significance.MethodsSamples from 45 cases of early gastric cancer resected through endoscopic surgery, and 38 cases of premalignant lesions were collected, and 42 cases of chronic gastritis confirmed by gastroscopic biopsies were collected as well. The expressions of hMLH1 and hMSH2 in three kinds of the tissues were detected using Western blotting.ResultsThe expression of hMLH1 in chronic gastritis and precancerous lesions was higher than that in early gastric cancer, the difference was statistically significant (F=9.578,P<0.05); the expression of hMSH2 in early gastric cancer was higher than that in chronic gastritis and precancerous lesions (F=32.952,P<0.05). The expressions of hMLH1 and hMSH2 protein in early gastric cancer were not correlated with patient’s age and sex, location and size of tumor, depth of infiltration and histological type (P>0.05). The positive rate of hMSH2 in early gastric cancer infected with Hp was lower than that in non-Hp-infected (χ2=22.361,P<0.05), the expression of hMSH2 in precancerous lesions and chronic gastritis was also lower than that in non-Hp-infected group, but the difference was not statistically significant (P>0.05).ConclusionIn the development process from chronic gastritis to precancerous lesions to early gastric cancer, the expression of hMSH2 increases and that of hMLH1 decreases. Hp infection impacts the occurrence of early gastric cancer probably through affecting the expressions of both hMSH2 and hMLH1.

stomach neoplasms; precancerous conditions; DNA mismatch repair;Helicobacterpylori

2015-03-11;

2015-06-05

鞠輝(1980-)，男，博士研究生，主治醫(yī)師。

劉希雙(1964-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導師。

R735.2

A

1008-0341(2015)04-0415-04