豬小腸上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

詹 康 左曉昕 陳銀銀 貢笑笑 占今舜 趙國琦（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

豬小腸上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

詹 康 左曉昕 陳銀銀 貢笑笑 占今舜 趙國琦?
（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

摘 要:為建立功能性永生化的豬小腸上皮細(xì)胞系，并為豬腸道營養(yǎng)吸收與免疫調(diào)控以及仔豬腸道疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供細(xì)胞模型，本試驗(yàn)采用組織塊培養(yǎng)法來分離純化豬小腸上皮細(xì)胞，并通過細(xì)胞角蛋白18、細(xì)胞增殖曲線、核型分析來鑒定豬小腸上皮細(xì)胞。結(jié)果表明:1）采用組織塊培養(yǎng)法能夠成功培養(yǎng)豬小腸上皮細(xì)胞并穩(wěn)定傳11代。2）本試驗(yàn)獲得的豬小腸上皮細(xì)胞角蛋白18抗原鑒定為陽性，染色體核型為二倍體。3）倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)至第11代的豬小腸上皮細(xì)胞仍然保持著上皮細(xì)胞的特征，呈現(xiàn)“鋪路石”和上皮樣形態(tài)。培養(yǎng)11代后的豬小腸上皮細(xì)胞間隙開始變大，規(guī)則不明顯，細(xì)胞開始凋亡。第15代的豬小腸上皮細(xì)胞則出現(xiàn)大量凋亡并從瓶底脫落，僅有很少細(xì)胞貼壁生長。綜上所述，采用組織塊培養(yǎng)法能夠獲得生物學(xué)功能穩(wěn)定的豬小腸上皮細(xì)胞系并能正常傳11代，可為細(xì)胞的永生化提供試驗(yàn)素材。

關(guān)鍵詞:豬小腸上皮細(xì)胞；功能性；腸道營養(yǎng)與免疫；永生化

小腸上皮細(xì)胞是動物體內(nèi)最重要的消化吸收細(xì)胞，在仔豬腸道營養(yǎng)吸收與腸道免疫調(diào)控發(fā)揮重要作用［1－2］。國外研究分離腸上皮細(xì)胞多采用酶消化法，但是主要用于研究人、小鼠等，豬小腸上皮細(xì)胞組織塊培養(yǎng)鮮見報道。多位研究人員證實(shí)，利用酶消化法獲得豬回腸、空腸上皮細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染SV40病毒基因可獲得永生化細(xì)胞［3－8］。Con?teas等［9］利用小腸上皮細(xì)胞為模型在體外研究表皮生長因子（EGF）和生長抑制因子對小腸上皮細(xì)胞DNA合成的影響，結(jié)果表明這些因子能夠上調(diào)小腸上皮細(xì)胞DNA的表達(dá)。Carrol等［10］在利用基質(zhì)膠來研究小腸上皮細(xì)胞的分化功能，并發(fā)現(xiàn)基質(zhì)膠能夠上調(diào)小腸上皮細(xì)胞基因的表達(dá)量。國外已經(jīng)建立了一些豬小腸上皮細(xì)胞系，但是這些細(xì)胞系在國內(nèi)還未永生化和商品化，很難重復(fù)獲得豬小腸上皮細(xì)胞系，而且這些細(xì)胞系還未進(jìn)行功能的驗(yàn)證［4］。本試驗(yàn)旨在建立功能性的豬小腸上皮細(xì)胞系并進(jìn)行功能性驗(yàn)證，為豬小腸上皮細(xì)胞的營養(yǎng)吸收、腸道免疫調(diào)控機(jī)制的研究和豬小腸上皮細(xì)胞系永生化提供功能性的細(xì)胞素材。

1 材料與方法

1.1 材料

剛出生的仔豬小腸組織塊（無菌活體采樣）。DMEM/F12完全培養(yǎng)基:10%澳洲胎牛血清（FBS）、0.25%Trypsin?EDTA、5 mL胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－硒－乙醇胺溶液（均為Gibco公司產(chǎn)品）。100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、4 mmol/L谷氨酰胺溶液、2.8 μmol/L氫化可的松、噻唑藍(lán)（MTT）（均為Sigma公司產(chǎn)品）。15 ng/mL EGF （Peprotech公司產(chǎn)品）。細(xì)胞角蛋白18單克隆抗體、抗羊異硫氰酸熒光素（FITC）熒光二抗（Santa Cruz公司產(chǎn)品）。

1.2 豬小腸上皮細(xì)胞原代的培養(yǎng)

在實(shí)驗(yàn)室超凈臺中，將剛出生的仔豬進(jìn)行無菌活體采樣并放入含有3倍體積的青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中。用杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）清洗小腸組織數(shù)次，剔除腸系膜。將組織移至另一培養(yǎng)皿中，用DPBS再次清洗，直至上清液清亮。再用DMEM/F12完全培養(yǎng)基反復(fù)清洗組織，直至培養(yǎng)基上清液清亮并轉(zhuǎn)移至100 mL小燒杯中，并用小剪刀將組織剪成＜1 mm3的組織塊，靜置5 min自行沉淀，棄上清。繼續(xù)剪碎，加無血清培養(yǎng)基懸浮組織塊，再轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中清洗，1 000 r/min離心5 min，棄上清。反復(fù)清洗組織塊，直至上清液清亮。加入2 mL的10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基懸浮組織塊，用擴(kuò)口移液管將組織塊轉(zhuǎn)入6孔板中，放入二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。剛開始加入適量的DMEM完全培養(yǎng)基潤濕組織即可，切記不能讓組織塊漂起來。第2天，再加入1 mL的DMEM完全培養(yǎng)基。

1.3 豬小腸上皮細(xì)胞的純化和克隆

當(dāng)6孔板內(nèi)培養(yǎng)的豬小腸上皮細(xì)胞開始出現(xiàn)大部分集落時，同時仍然有大量成纖維細(xì)胞，這時候可以加0.05%胰蛋白酶消化并放置在顯微鏡下觀察豬小腸上皮細(xì)胞的皺縮和發(fā)亮的程度。不時拍打6孔板和底部，這時大量的成纖維細(xì)胞會從底部脫落下來，然而也有少量的上皮細(xì)胞脫落下來。經(jīng)幾次反復(fù)敲打，大部分成纖維細(xì)胞脫落下來，但是豬小腸上皮細(xì)胞仍然貼壁。DPBS清洗3次，然后用EDTA消化，再用0.05%胰蛋白酶消化，血清培養(yǎng)基終止消化，吹打并懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為50個/mL。取100 μL細(xì)胞懸液加入96孔板中，培養(yǎng)1周。

1.4 豬小腸上皮細(xì)胞生長曲線的測定

取第5代豬小腸上皮細(xì)胞，96孔板接種細(xì)胞2×103個，24 h之后取8孔，每孔加20 μL的MTT溶液放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出MTT溶液再用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞2～3遍并吸棄，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min。吸出8孔的液體并轉(zhuǎn)入96孔板中，490 nm吸光度（OD）值，連續(xù)測9 d。

1.5 豬小腸上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定

將豬小腸上皮細(xì)胞按1×104個/cm2接種于4孔腔室玻片（chamber slide）。待細(xì)胞密度達(dá)到90%時用DPBS洗3次。用4%可溶性聚四氟乙烯（PFA）和丙酮/甲醇（1∶1）放置4℃冰箱固定30 min，然后DPBS輕輕洗3次，防止細(xì)胞脫落下來。3%雞血清室溫封閉30 min，移除血清。加細(xì)胞角蛋白18一抗，對照組加PBS，放置4℃冰箱過夜。DPBS洗3次，熒光素驢抗羊二抗室溫避光孵育1 h。DPBS清洗3次，4′，6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI）室溫染色7 min。DPBS洗3次，蒸餾水洗1次，封固劑封片，避光。

1.6 豬小腸上皮細(xì)胞核型分析

根據(jù)Sun等［11］染色體核型分析方法并進(jìn)行稍微的修改。取第10代豬小腸上皮細(xì)胞，加秋水仙素到培養(yǎng)液中至終濃度為0.05 μg/mL，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，大部分處于細(xì)胞分裂中期。胰蛋白酶消化分離細(xì)胞后轉(zhuǎn)入15 mL離心管，4℃下1 000 r/min離心3 min收集細(xì)胞。吸去上清液加入預(yù)熱至37℃的0.075 mol/L氯化鉀（KCl）溶液7 mL，輕輕吹打均勻，37℃培養(yǎng)箱中溫育17 min。懸液中加入新鮮固定液1 mL，輕輕吹打混勻。將懸液以1 400 r/min離心10 min去上清。加入新鮮固定液7 mL吹打混勻，室溫靜置30 min，1 400 r/min離心10 min棄上清液，重復(fù)上個步驟1次。視細(xì)胞量加入固定液0.5 mL，吹打均勻。取出預(yù)冷的載玻片，將載玻片傾斜45°，在載玻片上方用吸管迅速滴上2～3滴細(xì)胞懸液，用嘴輕輕吹散使細(xì)胞分散均勻，室溫干燥。吉姆薩（Giemsa）工作液染色15 min，沖洗，空氣干燥。先用低倍鏡尋找良好的分裂相，再使用高倍鏡觀察。

2　結(jié) 果

2.1 豬小腸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)

由圖1可知，組織塊在培養(yǎng)大約18 h后即可貼壁，但是貼壁不牢。此外，組織塊周圍輻射出少量的豬小腸成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞（圖2）。第5天豬小腸成纖維細(xì)胞大量增殖并處于對數(shù)生長期，豬小腸上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞夾雜著生長（圖3）。同時，豬小腸上皮細(xì)胞也開始大量增殖并形成細(xì)胞集落（圖4）。細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，一些豬小腸上皮細(xì)胞開始衰老，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變（圖5）。本試驗(yàn)對豬小腸上皮細(xì)胞每3 d進(jìn)行傳代，傳至第12代時，細(xì)胞開始衰老，細(xì)胞增殖緩慢；傳至第15代時，細(xì)胞增殖緩慢，基本上停止生長，細(xì)胞體積變大，最終從瓶底脫落。

2.2 豬小腸上皮細(xì)胞的純化和克隆

由圖6可知，通過96孔板單克隆豬小腸上皮細(xì)胞，成功克隆出4個孔為豬小腸上皮細(xì)胞。在克隆的過程中，也有一些孔生長出上皮樣細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時間增加，很多孔的豬小腸上皮細(xì)胞開始衰老、凋亡。但是，仍然有很少孔的細(xì)胞依然增殖。通過酶消化傳代接種至24孔板，對豬小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)觀察見圖7。

圖1　組織塊培養(yǎng)大約18 h后發(fā)生貼壁（物鏡）Fig.1 The tissue fragment adhering to the wall after about 18 h culture（objective，4×）

圖2　培養(yǎng)18 h后豬小腸成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞開始分裂（物鏡）Fig.2 The porcine intestinal fibroblast cells and epithelial cells began to divide after 18 h culture（objective，4×）

圖3　第5天豬小腸成纖維細(xì)胞開始大量增殖（物鏡）Fig.3 The porcine intestinal fibroblasts cells started to great proliferate in day 5（objective，4×）

圖4　第5天豬小腸上皮細(xì)胞開始大量增殖（物鏡）Fig.4 The porcine intestinal epithelial cells started to great proliferate in day 5（objective，4×）

圖5　第7天一些豬小腸上皮細(xì)胞開始衰老（物鏡）Fig.5 Some porcine intestinal epithelial cells started to senesce in day 7（objective，4×）

圖6　利用96孔板有限稀釋法獲得單克隆豬小腸上皮細(xì)胞系（物鏡）Fig.6 Use 96?well plates limiting dilution method to achieve monoclonal porcine intestinal epithelial cells line（objective，4×）

2.3 豬小腸上皮細(xì)胞生長曲線的測定

圖8顯示，第1～3天細(xì)胞生長緩慢，第4～6天細(xì)胞處于對數(shù)生長期增殖旺盛，第7天開始細(xì)胞達(dá)到平臺期，細(xì)胞增殖緩慢，細(xì)胞生長曲線為“S”形。以上數(shù)據(jù)暗示符合細(xì)胞生長的一般規(guī)律。

圖7 單克隆的豬小腸上皮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)（物鏡）Fig.7 The monoclonal porcine intestinal epithelial cell lines was cultured expand（objective，4×）

圖8 豬小腸上皮細(xì)胞生長曲線Fig.8 Growth curve of porcine intestinal epithelial cells

2.4 豬小腸上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定

由圖9可知，通過顯微鏡熒光拍照視野下的所有細(xì)胞都發(fā)出綠色熒光，這說明每個細(xì)胞表面都有細(xì)胞角蛋白18抗原表達(dá)，表明克隆的細(xì)胞為豬小腸上皮細(xì)胞。

圖9 豬小腸上皮細(xì)胞角蛋白18的免疫熒光Fig.9 The porcine intestinal epithelial cellscytokeratin 18 immunofluorescence

2.5 豬小腸上皮細(xì)胞核型分析

對傳至第10代的豬小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析（圖10）。由分析結(jié)果可知，第10代的豬小腸上皮細(xì)胞染色體數(shù)基本上是38條，只有很少細(xì)胞的染色體是37條，這可能是細(xì)胞懸液在滴板的時候細(xì)胞分散所致。以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明傳至第10代的豬小腸上皮細(xì)胞具有穩(wěn)定的生物學(xué)功能。

圖10 豬小腸上皮細(xì)胞核型分析Fig.10 Karyotype analysis of the porcineintestinal epithelial cells

3 討 論

3.1 組織塊法培養(yǎng)原代豬小腸上皮細(xì)胞

本試驗(yàn)利用的組織塊培養(yǎng)法是獲得豬小腸上皮細(xì)胞最可行的方法。由于該方法未經(jīng)任何酶的處理，因此能夠獲得活力很高且增殖旺盛的豬小腸上皮細(xì)胞，這為細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因奠定基礎(chǔ)。國外研究人員基本上是通過酶消化法獲得豬小腸上皮細(xì)胞，這種方法雖然能獲得大量的上皮細(xì)胞，但是經(jīng)過高濃度的酶消化后，細(xì)胞膜表面的一些蛋白受體會丟失［12－13］。細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要依賴于膜蛋白受體與膜外蛋白相互結(jié)合，改變膜蛋白受體結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生一系列的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如果膜蛋白受損，這將導(dǎo)致細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制，無法正常發(fā)揮細(xì)胞的生物學(xué)功能。因此，組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞是獲得功能性細(xì)胞的前提。Bouhet等［14］對新生的仔豬小腸采樣，通過組織塊培養(yǎng)建立了豬小腸上皮細(xì)胞系。本試驗(yàn)采用組織塊培養(yǎng)法成功獲得單克隆豬小腸上皮細(xì)胞。組織塊培養(yǎng)細(xì)胞時要注意:首先要避免組織被微生物污染。從冰上取出離心管之后，用酒精噴灑離心管周圍。所有玻璃移液管在吸取組織塊時，要預(yù)先潤濕玻璃管，以防止組織塊沾在管內(nèi)壁。小腸組織塊接種到6孔板的數(shù)量也是非常重要的，量少導(dǎo)致細(xì)胞難以增殖，過多會導(dǎo)致細(xì)胞聚集嚴(yán)重。組織塊接種到6孔板之后，孔內(nèi)培養(yǎng)液的用量是豬小腸上皮細(xì)胞能否成功培養(yǎng)的關(guān)鍵。接種的組織塊潤濕后輕輕貼在底部即可，組織上表面也不能干涸，組織過分的干涸會導(dǎo)致組織產(chǎn)生霉菌污染。24 h之后可以適當(dāng)增加培養(yǎng)基，但絕不能使組織塊漂起。原代培養(yǎng)過程中，要每天觀察孔內(nèi)細(xì)胞的培養(yǎng)狀況，如有污染應(yīng)立即丟棄。從培養(yǎng)箱拿出6孔板時，禁止晃動，防止組織塊漂起來。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，利用組織塊法培養(yǎng)豬小腸上皮細(xì)胞能夠獲得大量有活力的豬小腸上皮細(xì)胞，可為下游試驗(yàn)提供較好的素材。

3.2 豬小腸上皮細(xì)胞的分離純化與克隆

組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法最大的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞活力強(qiáng)，穩(wěn)定性好。但是，上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞夾雜生長，這對上皮細(xì)胞的純化產(chǎn)生困難。雖然，雜細(xì)胞對豬小腸上皮細(xì)胞生長是必需的，但是成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞過度增殖反而會抑制豬小腸上皮細(xì)胞的生長［15］。細(xì)胞純化方法有很多種，如相差貼壁和相差消化法、刮除法、克隆環(huán)和96孔有限稀釋法。Rose等［16］利用有限稀釋法在96孔板中每孔接種1個細(xì)胞，最終獲得單克隆的乳腺上皮細(xì)胞株。本試驗(yàn)采用相差消化法來純化豬小腸上皮細(xì)胞。首先用細(xì)胞刮刀將大部分成纖維細(xì)胞刮掉，用DPBS清洗以去除雜細(xì)胞。這時，與上皮細(xì)胞生長距離很近的成纖維細(xì)胞用刮除法是不可行，會導(dǎo)致上皮細(xì)胞也會被刮掉。這時采用0.05%胰蛋白酶來消化細(xì)胞，敲打皿壁，放入培養(yǎng)箱溫育1 min。在純化的過程中，胰蛋白酶的濃度和消化時間非常重要。由于成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對胰蛋白酶的敏感性不同，0.05%胰蛋白酶就可以輕松把成纖維細(xì)胞消化下來，而上皮細(xì)胞只有很少部分皺縮發(fā)亮，但是不會脫落仍繼續(xù)貼壁。消化時間是本實(shí)驗(yàn)室摸索出來的最佳時間，能夠最低限度減少對上皮細(xì)胞的傷害。如果在純化過程中還有雜細(xì)胞生長，可采用相差貼壁法，這是由于成纖維細(xì)胞比上皮細(xì)胞貼壁快。放入培養(yǎng)箱中20 min，成纖維細(xì)胞基本上貼壁，上皮細(xì)胞沒有貼壁或貼壁不牢，輕輕晃動培養(yǎng)皿將培養(yǎng)基移入另一培養(yǎng)瓶中，此時培養(yǎng)瓶中基本上是上皮細(xì)胞。此外，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面也漂浮著很少發(fā)亮死細(xì)胞，這可能是胰蛋白酶二次消化和吹打過程造成的，只要上皮細(xì)胞貼壁之后立即吸棄死細(xì)胞，基本對細(xì)胞生長無影響。然而，單克隆細(xì)胞才是本試驗(yàn)最理想的豬小腸上皮細(xì)胞系。國外克隆細(xì)胞一般采用克隆環(huán)方法，但是本試驗(yàn)未獲得成功，可能是由于技術(shù)上不夠嫻熟，有待進(jìn)一步研究。利用96孔有限稀釋法克隆細(xì)胞，最關(guān)鍵的是避免孔與孔之間的污染。每孔里面大約5個細(xì)胞，每隔2 d觀察細(xì)胞生長情況，直至細(xì)胞密度達(dá)到50%即可轉(zhuǎn)入到24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。PBS清洗細(xì)胞時用排槍吸棄，避免用單道槍，防止孔與孔交叉污染。

3.3 豬小腸上皮細(xì)胞生長曲線的測定

豬小腸上皮細(xì)胞的生長特性對于上皮細(xì)胞的形態(tài)及功能具有至關(guān)重要的作用。由于本試驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞是非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，因此生長的速度要比轉(zhuǎn)化的細(xì)胞慢。為了克服這個障礙，細(xì)胞每3 d傳代1次。本試驗(yàn)接種的細(xì)胞數(shù)目為1.2× 104個/cm2，3 d之后豬小腸上皮細(xì)胞生長密度為70%。細(xì)胞培養(yǎng)前5代時，上皮細(xì)胞增殖比較旺盛。在接種數(shù)目相同的情況，第7代之后細(xì)胞生長速度明顯減慢，細(xì)胞開始出現(xiàn)衰老和凋亡，細(xì)胞間隙開始變大，單個細(xì)胞開始變大，之后細(xì)胞開始脫落。有研究認(rèn)為原代培養(yǎng)的細(xì)胞群體倍增20 （PD20）之后，細(xì)胞經(jīng)過死亡階段0期（M0期），一部分細(xì)胞開始死亡，之后，開始進(jìn)入死亡階段1期（M1期）和死亡階段2期（M2期），這時候細(xì)胞開始大量凋亡。一些病毒蛋白可使腫瘤抑制蛋白（pRb）失活并可越過MI期，細(xì)胞繼續(xù)生長［17－18］。Liu等［19］利用E6病毒蛋白使腫瘤抑制因子p53失活并激活端粒酶，使細(xì)胞成功逃離M2期，細(xì)胞產(chǎn)生無限增殖的永生化細(xì)胞。本試驗(yàn)所培養(yǎng)的豬小腸上皮細(xì)胞是未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，細(xì)胞生長曲線符合細(xì)胞的生長特性。以上數(shù)據(jù)表明本試驗(yàn)所培養(yǎng)的豬小腸上皮細(xì)胞是良好的試驗(yàn)素材，為細(xì)胞的營養(yǎng)吸收和免疫調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

3.4 豬小腸上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定

細(xì)胞骨架蛋白是上皮細(xì)胞重要的標(biāo)志蛋白，其中以角蛋白7、8、18為主。本試驗(yàn)利用角蛋白18來對豬小腸上皮細(xì)胞的進(jìn)行鑒定。細(xì)胞角蛋白18主要分布在上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，是細(xì)胞的主要骨架蛋白。細(xì)胞角蛋白18的主要功能是維持上皮細(xì)胞的穩(wěn)定性及連續(xù)性。從細(xì)胞的形態(tài)上也能夠一定程度地辨別成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。利用組織塊培養(yǎng)細(xì)胞，早期培養(yǎng)從組織塊周圍輻射出來的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，接著上皮細(xì)胞從組織塊周圍分裂出來。成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的形態(tài)差異較大，成纖維細(xì)胞的形態(tài)呈現(xiàn)梭形，上皮細(xì)胞的形態(tài)呈現(xiàn)“鋪路石”狀。組織塊培養(yǎng)原代細(xì)胞呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞夾雜著生長，而且成纖維細(xì)胞增殖速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上皮細(xì)胞，這樣就會導(dǎo)致成纖維細(xì)胞形成細(xì)胞簇，細(xì)胞間相互擠壓，從而改變成纖維細(xì)胞的形態(tài)，形態(tài)似乎也是“鋪路石”狀。這樣從顯微鏡下很難辨別這2種細(xì)胞的形態(tài)。國內(nèi)外鑒定是否為上皮細(xì)胞，一般是通過免疫熒光檢測上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜表面表達(dá)細(xì)胞角蛋白18抗原［20－21］。本試驗(yàn)采用免疫熒光來鑒定上皮細(xì)胞角蛋白18表面抗原。在鑒定過程中，一抗和二抗稀釋的比例、孵育時間要確定好，否則會導(dǎo)致背景過高。從圖9可知，在熒光顯微鏡視野下的所有細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞角蛋白18抗體的免疫反應(yīng)，顯示出綠色熒光。以上結(jié)果證明，本試驗(yàn)分離純化獲得的是純的豬小腸上皮細(xì)胞。

3.5 豬小腸上皮細(xì)胞核型分析

細(xì)胞核型分析對于細(xì)胞的生物學(xué)功能具有重要的指示作用。Balducci等［22］在研究人脂肪細(xì)胞過程中發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)增加，人脂肪細(xì)胞的染色體開始異常。Zhang等［23］在研究鼻咽上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，NP69?LMP1亞細(xì)胞系傳至第54代，染色體結(jié)構(gòu)重排，顯示出細(xì)胞傳代次數(shù)越多，細(xì)胞正常的生物學(xué)功能喪失?；虻恼１磉_(dá)是基于細(xì)胞染色體功能穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)的。一旦細(xì)胞染色體缺失將會引起基因表達(dá)調(diào)控的紊亂，尤其是轉(zhuǎn)錄活性區(qū)染色體的缺失將抑制細(xì)胞本身具有的蛋白質(zhì)分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這可能下調(diào)抑癌基因的表達(dá)或高表達(dá)一些癌基因［24－27］。目前，國內(nèi)外研究的細(xì)胞基本上是二倍體核型，但是隨著細(xì)胞的傳代次數(shù)越來越多，細(xì)胞的一些重要生物學(xué)功能將喪失，染色體核型變?yōu)槎啾扼w或單倍體。如果一旦出現(xiàn)這樣問題，下游的細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)試驗(yàn)就很難模擬體內(nèi)豬小腸上皮細(xì)胞吸收模式。本試驗(yàn)研究表明，傳至第10代的豬小腸上皮細(xì)胞仍然保持著二倍體的核型，具有穩(wěn)定的生物學(xué)功能，可為仔豬的腸道營養(yǎng)吸收和腸道疾病免疫治療提供重要的細(xì)胞素材。

4　結(jié) 論

本試驗(yàn)利用組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法成功培養(yǎng)了豬小腸上皮細(xì)胞系且細(xì)胞活力較強(qiáng)并能夠穩(wěn)定傳11代。傳至第12代的豬小腸上皮細(xì)胞開始衰老，傳至第15代的豬小腸上皮細(xì)胞停止生長并從瓶底脫落。原代豬小腸上皮細(xì)胞成功培養(yǎng)并進(jìn)行功能性驗(yàn)證，可為豬小腸上皮細(xì)胞的營養(yǎng)吸收、腸道免疫調(diào)控機(jī)制的研究和建立永生化豬小腸上皮細(xì)胞系提供理想試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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（責(zé)任編輯 菅景穎）

Isolation Culture and Identification of Porcine Intestinal Epithelial Cells

ZHAN Kang ZUO Xiaoxin CHEN Yingying GONG Xiaoxiao ZHAN Jinshun ZHAO Guoqi?
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract:This experiment was designed to establish a functional immortalized porcine intestinal epithelial cells line and study porcine intestinal nutrient absorption，immune regulation and the pathogenesis of the neonatal porcine intestinal disease，which provided the cell model.Tissue culture method was used in this experiment to separate and purify the porcine epithelial cells.And the methods of cytokeratine 18 immunofluorescence，cell proliferation curve and karyotype analysis were used to identify the porcine intestinal epithelial cells.The results showed that the porcine intestinal epithelial cells could be successfully cultured and passed 11 generations stably by tissue culture method.2）The porcine intestinal epithelial cells showed positive reaction against cytokeratine 18 antigen，and the karyotype was diploid.3）The 11th generation cells still have characteristics of epithelial cells，showing“cobblestone?shape”and epithelial?like morphological features.However，the porcine intestinal epithelial cells were out of shape and went to the procedure of apoptosis after 11 generations.Most of them went to death in 15th generation and seldom were adherent to the dishes anymore.In summary，the experiment succeed to obtain a porcine intestinal epithelial cells line with stable biological functions by tissue culture meth?od，and they pass 11 generations stably，which provided the experimental materials for immortalized cells.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（5）:1477?1484］

Key words:porcine intestinal epithelial cell；function；intestinal nutrition and immunity；immortalize

Corresponding author?，professor，E?mail:jszhaoguoqi＠hotmail.com

通信作者:?趙國琦，教授，博士生導(dǎo)師，E?mail:jszhaoguoqi＠hotmail.com

作者簡介:詹 康（1988—），男，江蘇南京人，碩士研究生，從事動物分子營養(yǎng)研究。E?mail:zhankang0305＠163.com

基金項(xiàng)目:江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；江蘇省科技支撐項(xiàng)目（BE2013387）

收稿日期:2014－12－15

doi:10.3969/j.issn.1006?267x.2015.05.018

中圖分類號:Q813.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1006?267X（2015）05?1477?08