棘腹蛙Japonicin-pb抗菌肽的分離及表達(dá)譜分析

姜玉松 陳德碧 鄒 勇 周繼萍 樊汶樵 徐敬明

(1.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶402160;2.重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心，重慶402168)

抗菌肽不僅具有廣譜的抗細(xì)菌能力，還有抗真菌、抗寄生蟲、抗病毒等功能，是先天性免疫系統(tǒng)的重要成員之一。目前，已從植物、微生物、軟體動物、昆蟲、魚類、兩棲動物、鳥類、哺乳動物等多種生物體內(nèi)分離得到超過2 000種抗菌肽［1］，其中大多數(shù)抗菌肽具有α－螺旋或者β－折疊結(jié)構(gòu)，有些同時包含這2種結(jié)構(gòu)［2］。Japonicin是一類多功能抗菌肽，最先從日本林蛙的皮膚中分離［3］，根據(jù)氨基酸序列的組成及結(jié)構(gòu)特征，Japonicin抗菌肽可以分為Japonicin-1和Japonicin-2兩大類。其中，Japonicin-1含2個半胱氨酸構(gòu)成的7個殘基的環(huán)，而Japonicin-2含2個半胱氨酸組成的8個殘基的環(huán)。在抑菌活性方面，Japonicin-1對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑制活性，最小抑菌濃度分別為12和20μmol/L，而 Japonicin-2只對大腸桿菌有活性，最小抑菌濃度為 20 μmol/L［4］。此外，Lu等［5］發(fā)現(xiàn)云南倭蛙來源的 Japonicin-1npb除對對金色葡萄球菌有顯著的抑制效果外，還能有效清除因紫外線照射、環(huán)境污染、氧化應(yīng)激等產(chǎn)生的自由基。

Japonicin抗菌肽對細(xì)菌、腫瘤等靶向細(xì)胞具有較高的選擇性和穩(wěn)定性，且特定種類的兩棲動物分泌的Japonicin又具有種屬間的特異性［6］，這在一定程度上豐富了抗菌肽資源庫。棘腹蛙(Paa boulengeri)屬兩棲綱無尾目蛙科［7］，是我國特有的大型蛙類。棘腹蛙喜歡生活在潮濕的環(huán)境，環(huán)境中微生物的種類和數(shù)量都非常豐富，為了保護免遭外源病原微生物的侵害，棘腹蛙已經(jīng)進化出了多種機制來對抗這些有害因素，如背部遍布能夠分泌活性物質(zhì)的窄長疣等。但是目前關(guān)于棘腹蛙皮膚抗菌肽，尤其是Japonicin抗菌肽的研究尚未見報道。本研究基于棘腹蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從皮膚組織中擴增了棘腹蛙來源的3種Japonicin-pb前體序列，通過信號肽預(yù)測和結(jié)構(gòu)域分析確定了Japonicin-pb的成熟肽，并研究了其在不同生長環(huán)境、組織中的表達(dá)譜，旨在為棘腹蛙養(yǎng)殖過程中的疾病防控以及棘腹蛙來源Japonicin-pb抗菌肽的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物材料

棘腹蛙(酉陽)生長在本實驗室的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，挑選健康的2齡成蛙，分別轉(zhuǎn)移至15、18、21、24、27和30℃的恒溫箱中(n=10)，適應(yīng)生長30 d后采用雙毀髓法處死并取其各組織，液氮保存。

1.2 總RNA提取

參照Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)說明書進行。分別取50 mg液氮冷凍的棘腹蛙血液、肌肉、肝臟和皮膚組織，于預(yù)冷的研缽中迅速研磨至粉末，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管。加入1 mL Trizol試劑，室溫靜置5 min，加入200μL氯仿，渦旋混勻，室溫放置3～5 min，待其分層，4℃，12 000 ×g離心15 min，收集水相。加入等體積預(yù)冷的異丙醇，室溫放置15 min，4 ℃，12 000×g離心10 min，收集沉淀。75%的乙醇洗滌，室溫晾干，加入30～50μL ddH2O溶解RNA。RNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA濃度用紫外分光光度計(Amersham，美國)測定。

1.3 第1鏈cDNA的合成

cDNA合成根據(jù)Roche第1鏈cDNA合成試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche，德國)說明書進行。在0.5 mL RNase free EP管中加入 3μL total RNA，1μL Oligo(dT)Primer(50 μmol/L)，9 μL RNase free ddH2O。將混合物65℃ 10 min，冰上冷卻2 min，離心，加入4 μL 5 × First-strand Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor(40 U/μL)， 2 μL Deoxynucleotide Mix(10 mmol/L)，0.5 μL Transcriptor Reverse Transcriptase(20 U/μL)?；旌衔镱嵉够靹?，25 ℃10 min，50℃ 60 min。85℃ 5 min，終止反應(yīng)。所得第1鏈cDNA產(chǎn)物可稀釋后或直接用于PCR反應(yīng)。

1.4 Japonicin-pb的克隆

從 GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中下載已公布的其他物種來源Japonicin氨基酸序列，利用DNASTAR軟件分析尋找其保守區(qū)域，以保守區(qū)域搜索本實驗室構(gòu)建的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組本地Blast數(shù)據(jù)庫，從而找出編碼棘腹蛙Japonicin-pb的轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)搜索到的轉(zhuǎn)錄本設(shè)計特異性引物進行PCR擴增。PCR擴增采用25μL體系。在0.2 mL的EP管中按下列組分配成 PCR 反應(yīng)體系:2.5 μL 10 × PCR Buffer，1.5 μL 鎂離子(Mg2+)(25 mmol/L)，2.5 μL dNTP mixture(2 mmol/L)，0.5 μL PrimerF(10 μmol/L)，0.5 μL PrimerR(10 μmol/L)，0.5 μL KODPlus-Neo(1 U/μL)(KOD-Plus-Neo，TOYOBO，日本)，1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，16μL ddH2O，混勻后瞬離。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min;98℃10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，32 個循環(huán);68 ℃ 后延伸1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN，美國)進行回收。

PCR產(chǎn)物回收后連接T載體PMD-19(TARAKA，日本)轉(zhuǎn)化DH5α菌株，過夜培養(yǎng)后挑選單克隆送交測序公司(GENEWIZ，北京)進行序列測定。

1.5 3種Japonicin-pb在不同生長溫度下的差異表達(dá)

根據(jù)3種Japonicin-pb的核苷酸序列差異，設(shè)計分別擴增 Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb和 Japonicin-3pb 的特異性引物。以 15、18、21、24、27和30℃環(huán)境下適應(yīng)生長30 d的棘腹蛙皮膚組織cDNA為模版，利用 Real-time PCR(LightCycler Nano System，Roche，德國)分別擴增 Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb及 Japonicin-3pb的 ORF序列。根據(jù)熒光定量試劑盒(Faststar essential DNA Green Master，Roche，德國)說明書配制 20 μL 的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 10 s，52 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。擴增 Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb和 Japonicin-3pb和內(nèi)參基因β－肌動蛋白(β-actin)的引物(表1)。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used for the experiments

1.6 3種Japonicin-pb在不同組織的差異表達(dá)

以在21℃環(huán)境下適應(yīng)生長30 d的棘腹蛙組織(血液、肌肉、肝臟和皮膚)cDNA為模版，利用Real-time PCR檢測Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb及Japonicin-3pb在各組織中的表達(dá)量。

1.7 生物信息學(xué)分析

用 DNASTAR軟件進行ORF分析;在 Gen-Bank中下載其他物種來源的Japonicin的氨基酸序列，經(jīng)DNASTAR軟件比對確定其保守區(qū)域。用MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 棘腹蛙Japonicin-pb的克隆

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載已公布的其他物種來源的Japonicin序列，利用DNASTAR軟件分析并找出其保守區(qū)域，然后以保守區(qū)域MFTLKKSL和LLFFLGMISLSLCK來搜索棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組本地Blast數(shù)據(jù)庫(e值設(shè)為0.01)，成功搜索到3條編碼Japonicin的 Contig轉(zhuǎn)錄本，分別為 Contig_59031、Contig_41711和 Contig_54325。這 3條Contig轉(zhuǎn)錄本含有相同的135 bp的3’－UTR、完整的 ORF序列及分別為146、446和236 bp的5’－UTR。這3條 Contig轉(zhuǎn)錄本所編碼的 ORF長度不同，分別為231、219及195 bp。

為了進一步驗證這3條Contig轉(zhuǎn)錄本試驗所編碼的ORF確實存在于棘腹蛙皮膚組織中，分別設(shè)計了特異性引物(表1)進行PCR克隆及測序，測序結(jié)果表明這3條ORF均存在與棘腹蛙皮膚組織中，長度分別為231、219和195 bp(圖1)，分別編碼76、73和65個氨基酸殘基，與轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果一致。比對三者的氨基酸序列，表明N端前50個氨基酸殘基高度一致，C端序列高度異質(zhì)(圖2)，因此確定為棘腹蛙來源的3種不同Japonicin。Contig_59031、Contig_41711的成熟肽中含有2個半胱氨酸，因此二者屬于Japonicin-1類抗菌肽，分別 命 名 為 Japonicin-1apb和 Japonicin-1bpb。Contig_54325成熟肽中不存在半胱氨酸，明顯區(qū)別與Japonicin-1和Japonicin-2，可能是一種未見報道的新型抗菌肽，命名為Japonicin-3pb。

圖1 Japonicin-pb基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Japonicin-pb gene

2.2 3種Japonicin-pb的差異表達(dá)

為了解 Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb及 Japonicin-3pb抗菌肽對不同生長溫度的響應(yīng)規(guī)律，利用相對定量PCR進行分析，結(jié)果顯示溫度的變化對Japonicin-1apb的表達(dá)影響較大，其表達(dá)量與生長溫度呈現(xiàn)相關(guān)性，而溫度的變化對Japonicin-1bpb和Japonicin-3pb的表達(dá)影響較小(圖3)。從15到30℃時，在 mRNA水平上，Japonicin-1bpb的表達(dá)量增加了4.32倍(P ＜0.05)，Japonicin-3pb的表達(dá)量僅增加了1.73倍(P ＜0.05)，Japonicin-1bpb的表達(dá)量一直維持在一個較低的水平，基本沒有變化(P ＞0.05)。

圖2 Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb和Japonicin-3pb氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence alignment among Japonicin-1apb，Japonicin-1bpb and Japonicin-3pb

圖3 不同生長溫度下Japonicin-pb的差異表達(dá)Fig.3 Differential expression of Japonicin-pb in different growth temperatures

了解 Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb及 Japonicin-3pb抗菌肽在不同組織的分布規(guī)律，能夠為棘腹蛙免疫功能和免疫機制的研究提供基礎(chǔ)。利用相對定量PCR的方法分別檢測了Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb及 Japonicin-3pb在血液、肌肉、肝臟、皮膚組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示Japonicin-1apb主要在皮膚組織表達(dá)，Japonicin-3pb在肝臟中的表達(dá)較高，而Japonicin-1bp在各組織中的表達(dá)差異變化不大(圖4)。

圖4 不同組織中3種Japonicin-pb的差異表達(dá)Fig.4 Differential expression of Japonicin-pb among different tissues

2.3 Japonicin-pb 的進化

利用 MEGA 5.0軟件的鄰接法(neighbor-Joining method，NJ)構(gòu)建了棘腹蛙源3種 Japonicin-pb與其他物種的Japonicins氨基酸序列之間的進化關(guān)系(圖5)。從圖5中可以看到，棘腹蛙源的3種Japonicins聚成一簇而與其他物種的進化關(guān)系較遠(yuǎn)。在 3種 Japonicin-pb中，相比 Japonicin-1apb、Japonicin-3pb和 Japonicin-1bpb具有更相似 的序列。

圖5 Japonicin-pb氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of Japonicin-pb amino acid sequence

3 討論

作為抵御病原微生物入侵的第1道屏障，雖然從哺乳動物到低等的微生物中今均分離到了抗菌肽，但從種類和數(shù)量上來說，源于兩棲動物的抗菌肽遠(yuǎn)多于其他物種［8－9］。目前，已經(jīng)從600余種兩棲動物皮膚中分離到了968種抗菌肽，例如蛙肽、瓜蛙肽等。根據(jù)氨基酸組成及結(jié)構(gòu)的相似性，可以將兩棲動物抗菌肽分成brevinins-1、brevinins-2、ranatuerins-1、ranatuerins-2、esculentins-2、Japonicin-1、Japonicin-2、nigrocin-2、esculenins-1、palustrin、rnanlexin、gaegurins、rugosins和 temporins等家族［6，10］。雖然不同抗菌肽家族的氨基酸序列差異較大，但是其結(jié)構(gòu)上卻存在顯著的共性，例如序列中堿性氨基酸的含量比較高，帶正電荷［11－12］，以前體的形式分泌［3］等，使得在不同物種中分離抗菌肽甚至鑒定新型抗菌肽成為了可能。

日本林蛙來源的Japonicin是具有α－螺旋結(jié)構(gòu)的陽離子型抗菌肽，其氨基酸序列為FGLPMLSILPKALCILLKRKC，共21個氨基酸殘基，屬于Japonicin-1家族。Japonicin-1抗菌肽成熟肽一般含2個半胱氨酸，能夠形成含7個氨基酸殘基的環(huán)形結(jié)構(gòu)［3］。本研究中克隆到的3種棘腹蛙來源的Japonicin-pb前體序列，其結(jié)構(gòu)均符合抗菌肽結(jié)構(gòu)的一般特征，經(jīng)過序列比對表明，三者都屬于Japonicin家族。其中 Japonicin-1apb和 Japonicin-1bpb的成熟抗菌肽序列相似性較高，且含有2個形成7肽環(huán)的半胱氨酸殘基(Cys68，74，Cys65，71)，這與 Isaacson 等［3］分離的 Japonicin-1 的結(jié)構(gòu)特征一致，隸屬于Japonicin-1類。雖然Japonicin-3pb前體的信號肽和中間連接區(qū)域與Japonicin-1apb和Japonicin-1bpb有較高的相似性，但是成熟肽序列明顯有別。為了防止Japonicin-3pb序列是因克隆測序錯誤而致，我們比對了這3種抗菌肽的3’UTR區(qū)域，結(jié)果顯示 Japonicin-1apb和Japonicin-1bpb的3’UTR 完全一致，Japonicin-3pb的3’UTR序列和前兩者幾乎沒有同源性。Japonicin抗菌肽家族除了 Japonicin-1外，Michael等［13］從昭覺林蛙(Rana chaochiaoensis)皮膚組織上分離到序列為FVLPLLGILPKELCIVLKKNC的Japonicin-2抗菌肽，含能形成8肽環(huán)的2個半胱氨酸殘基，但是與本研究中的Japonicin-3pb也沒相似性，因此Japonicin-3pb也不屬于Japonicin-2家族。這些結(jié)果說明Japonicin-3pb不同于Japonicin-1和 Japonicin-2。

Japonicin-1bpb抗菌肽的表達(dá)在血液、肌肉、肝臟、皮膚組織中沒有顯著差異，且對溫度變化的響應(yīng)也不敏感，推測在棘腹蛙中Japonicin-1bpb可能是組成型表達(dá)，其穩(wěn)定的表達(dá)是維持其正常免疫活動的基礎(chǔ)。研究表明，抗菌肽除組成型表達(dá)外，還可以通過外界刺激或是病原微生物感染而誘導(dǎo)產(chǎn)生［14－16］。結(jié)合在棘腹蛙養(yǎng)殖過程中，當(dāng)溫度逐漸升高時，棘腹蛙皮膚組織Japonicin-1apb的表達(dá)也隨之增加，表明Japonicin-1apb的表達(dá)可能受溫度調(diào)控。因棘腹蛙長期生活在潮濕、富含有機質(zhì)的環(huán)境中，當(dāng)生長溫度逐漸提高時，環(huán)境中微生物的數(shù)量也必然會隨之增加，Japonicin-1apb的表達(dá)也可能會受微生物的誘導(dǎo)調(diào)控。雖然同一種抗菌肽分子在同一動物體中的不同組織中發(fā)現(xiàn)，但其表達(dá)量卻有顯著的差異。例如大多研究中分離到的抗菌肽在皮膚中的表達(dá)量明顯高于其他組織［17－18］。由于兩棲動物的皮膚中存在豐富的腺體，包括黏液腺和顆粒腺等，這些腺體是是分泌抵御病原體入侵活性物質(zhì)的主要部位［19］，這是生物體、環(huán)境長期的進化的結(jié)果。Japonicin-3pb主要在肝臟組織中檢出，且當(dāng)溫度超過最適生長溫度(21℃)后表達(dá)量逐漸增加，對溫度的響應(yīng)低于Japonicin-1apb。由于肝臟所處的微環(huán)境較皮膚穩(wěn)定，且接觸到的病原種類及數(shù)量明顯少于皮膚 ，因此在長期的進化過程中形成了Japonicin-1apb的抗菌響應(yīng)特征。鑒于兩棲類復(fù)雜的生存環(huán)境，Japonicin-1apb在宿主復(fù)雜的免疫機制中不僅作為抗微生物感染作用的第1道防線，而且還可能發(fā)揮了其他重要功能，如抗氧化以保護兩棲類裸露的皮膚等［20－22］，但是具體作用機制還需進一步闡明。

4 結(jié)論

①本研究克隆到了棘腹蛙來源的Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb和 Japonicin-3pb抗菌肽前體核苷酸序列，并確定了三者的成熟肽序列。

②Japonicin-1apb主要在皮膚組織中表達(dá)，且其表達(dá)量在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高而增加，Japonicin-3pb主要分布在肝臟中，其表達(dá)量在不同的生長溫度下基本維持穩(wěn)定，而Japonicin-1bpb在血液、肌肉、肝臟及皮膚組織中都有相似的表達(dá)水平，且不隨生長溫度的變化而變化。

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