DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的實驗教學改進

鮑思元

(湖北科技學院 基礎醫(yī)學院, 湖北 咸寧 437100)

DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的實驗教學改進

鮑思元

(湖北科技學院 基礎醫(yī)學院, 湖北 咸寧 437100)

DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在現代生物技術中的地位十分重要，但在實驗中，聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作難度比較大，影響因素比較多，耗時比較長。為了使DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳適合于實驗教學，對聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術相關操作流程進行了研究和探索，對實驗進行了改進和優(yōu)化。改進和優(yōu)化后的實驗操作簡易、詳細，試劑配方更合理，成功率得到提高，學生能在4學時內完成，為進行實驗教學提供了基本條件。

聚丙烯酰胺凝膠；電泳；改進；優(yōu)化；實驗教學

DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種比較普遍的電泳技術，采用聚丙烯酰胺作為電泳介質，是聚合酶鏈反應、單鏈構象多態(tài)(PCR-SSCP)分析中不可缺少的技術，多用于單鏈堿基易位、插入或缺失等基因變異情況的篩查，還可以廣泛用于遺傳育種、基因定位、種子活力測定等方面【1】。

與瓊脂糖凝膠電泳相比，聚丙烯酰胺凝膠電泳操作復雜，價格高，但其分辨率高，能分辨相差幾個堿基的核酸小片段，結果可永久保存。從該膠中回收的DNA純度極高，可適用于分子生物學中較高要求的實驗【2-3】。但是，在實驗過程中，常會出現一些問題，如膠破裂、背景太深、無DNA帶或帶紋不清晰、影響實驗結果的因素等。為了使DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在實驗教學中能順利進行，我們對聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術相關操作流程進行了研究和探索，簡化了實驗操作步驟，優(yōu)化了操作流程，使優(yōu)化后的DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術更適合于實驗教學。

1 實驗原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acr)單體和少量交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在化學催化劑過硫酸銨(AP)和加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的作用下形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網狀結構，具有分子篩效應。凝膠孔徑的大小可通過控制單體和交聯劑的比例來調節(jié)，從而滿足不同分子量物質的分離要求，如表1所示[4]。聚丙烯酰胺凝膠包括非變性聚丙稀酰胺凝膠和變性聚丙烯酰胺凝膠，前者用于分離和純化雙鏈DNA片段，后者用于分離和純化單鏈DNA片段。

2 實驗試劑及配制

表1 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍

注：1)N，N′-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/30。；2)列出的數字是遷移率與染料相同的雙鏈DNA的粗略大小(核苷酸對)。

2)變性劑。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺95 mL，溴酚藍0.05 g，二甲苯青0.05 g，加雙蒸水定容至100 mL。

3)固定液。100 mL冰醋酸溶于雙蒸水定容至1 000 mL。

3 DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作流程

3)電泳。安裝電泳裝置，在電泳槽中加入1×TBE緩沖液，使緩沖液覆蓋樣品孔。拔出樣品梳，用移液器吸取適量緩沖液沖洗樣品孔。打開變壓器，恒定功率60 W預電泳15～30 min。預電泳結束后，用移液器將DNA樣品小心注入樣品孔中(加樣量為3～5 μL)，電泳直至帶型分開。

4)固定。關閉電源，卸下玻璃板，剝離玻璃板，將膠板置于固定液中固定30 min, 直到指示劑顏色褪去。

5)漂洗。將膠板轉移到雙蒸水中漂洗三遍，每次2～3 min。

6)染色。轉移膠板至染色液中，在搖床上搖動染色30～40 min。

7)顯影。將膠板在雙蒸水中漂洗5～10 s后立即放入預冷為4 ℃～10 ℃的顯影液中，搖動顯影直到帶型完全出現。

8)定影。將出現帶型的膠板放入固定液中定影2～3 min，再用雙蒸水漂洗兩次(每次2 min)。

9)干膠。膠板置于室溫自然干燥。

10)帶型統計。

4 實驗操作的注意事項

1)準備玻板時，反硅化劑一定要涂勻，否則揭膠時會撕破膠塊。

2)配好的丙烯酰胺單體凝膠貯存液用棕色瓶盛裝，置冰箱內保存(可放1～2個月)；如有不溶物應過濾。

4)制膠時對過硫酸銨的量要適當把握，防止出現膠不凝固或凝固過快而來不及灌膠的現象。

5)膠制備完成后立即灌膠。因為加入TEMED和過硫酸銨后，膠即刻反應，若不及時灌膠則會導致凝膠凝固不均勻，電泳后得到的條帶形狀不規(guī)則。灌膠完畢后要立即插入樣品梳，否則凝膠凝固再插樣品梳則會毀膠。拔樣品梳時應垂直向上，均勻用力，緩慢拔出，否則會導致樣品槽損毀?？傊?，若凝膠制備出現問題則直接導致電泳條帶不清晰、變形、拖尾等，直接影響實驗結果。

6)制凝膠時，應避免產生氣泡。因為氣泡會影響電泳分離效果。

7)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經毒性并容易吸附于皮膚，操作時應避免沾在臉、手等皮膚上，最好戴一次性塑料手套操作。凝膠倒完以后剩余的膠液一定要等待其凝固后，才能挑出來丟棄，避免對環(huán)境造成污染。因為凝膠充分交聯以后沒有毒性。

8)顯影時在水里漂洗時間為5～10 s，時間過長會使帶型的信號微弱。顯影液溫度不要過高，否則會使背景變深。

5 實驗操作的調控與優(yōu)化

5.1 滲樣的問題

在點樣時，常常出現一個點樣孔的樣品滲透到鄰近的點樣孔里，這樣跑出的帶型就不能正確反應該點樣孔里的信息，造成實驗的失敗。文中從三個方面探討如何避免滲樣的問題：(1)在制膠時，插完樣品梳后，用夾子夾住常出現滲樣的一端，減少玻板之間的距離；(2)在點樣時，用小夾子夾住常出現滲樣的一端，使梳子與玻板貼近；(3)當點的樣品較多而點樣速度又慢時，可以分段點樣，即點完若干樣品后，讓其先跑5～10 min，再點另一段樣。

5.2 電泳時間

在跑膠時，電泳時間至關重要。比如,在做水稻SSR分析時，有些SSR等位基因之間的差別較大，只要跑1 h的時間就足以看出多態(tài)性。電泳時間長了，帶型反而變弱，影響讀膠。而有些SSR等位基因之間的差別較小，電泳時間短了，帶沒有跑出來，就需要增長電泳時間，直到樣品的遺傳信息充分反應出來。

5.3 點樣道數

同一對引物組合在親本間等位基因差異較小且非特異擴增帶較少時，可使用多次點樣技術提高實驗的成功率，即在同一塊膠上點樣2～4次，由此可以適當降低成本，提高效率。

6 討論

聚丙烯酰胺凝膠電泳屬于凝膠電泳的一種。聚丙烯酰胺凝膠電泳實用性最強，凝膠機械性能好、有彈性、透明、化學性質相對穩(wěn)定、對pH和溫度變化不敏感、為非離子型、沒有吸附和電滲作用等，尤為突出的是實驗中所需樣品量小(1～100 μg)，而分辨率又高。因此廣泛應用于許多學科中，在樣品的分離、純度鑒定、多態(tài)性分析、分子量測定中，是一個很有價值、有時甚至是不可缺少的技術。但在實驗操作中，聚丙烯酰胺凝膠電泳操作難度比較大，影響因素比較多，經過本研究的改進和優(yōu)化，實驗操作趨于簡易、詳細，試劑配方更合理，成功率得到提高，學生能在4學時內完成，為進行實驗教學提供了基本條件。

聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗的耗時相當長，在實驗教學環(huán)節(jié)上要靈活安排時間。在實驗課前，要求學生對實驗指導進行預習，對實驗操作的各個步驟要充分熟悉。學生進入實驗室后，教師要對實驗課的時間進行統籌安排，首先，將實驗的操作流程講解給學生，要注意每一個細節(jié)，教師最好要親手示范關鍵步驟；然后，學生按照要求進行實驗，教師在關鍵步驟要進行提醒和指導。在耗時較長的電泳過程中，教師再進一步仔細講解聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和相關知識，也可以介紹一些科研方面的研究成果，便于學生對知識的理解和掌握，激發(fā)學生的學習興趣。只有這樣，才能培養(yǎng)學生的實踐能力、科研能力、創(chuàng)新能力。

在現代生物技術中，很多前沿科研都涉及聚丙烯酰胺凝膠電泳，如基因定位、基因克隆、轉基因等。我們可以嘗試將科研實驗和教學實驗緊密結合和有機轉化，將科研成果快速轉化到實驗教學中，使學生能及時了解最新的科研動態(tài)和研究成果，拓寬學生的專業(yè)視野，構建全面、系統、前沿、創(chuàng)新的教學實驗平臺。

7 結束語

DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在分子生物學科研中是一種重要的實驗技術，許多前沿科研都涉及聚丙烯酰胺凝膠電泳。但在實驗中，聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作難度比較大，影響因素比較多，耗時比較長。對于實驗操作技能比較弱的大學生來說，很難開展此類實驗教學。為了使DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳適合于實驗教學，本研究對DNA變性聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術相關操作流程進行了改進和優(yōu)化，對學生操作注意點和教師講授注意點作了詳細的論述。改進和優(yōu)化后的實驗操作趨于簡易、詳細，學生能在4學時內完成。學生通過DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗可以接觸到科研前沿，可以培養(yǎng)動手能力、分析與解決問題的能力、創(chuàng)新能力。

[1]李其松，王金玉，沈華，等. DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染方法的探討[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006(10)：79-80.

[2]Promega.Protocols and applications guide[M].3rd.USA:Promega Corporation，1996:156.

[3]李宏業(yè)，范樹國，劉玉樂，等.改良聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測DNA[J].細胞生物學雜志，1999，21(4)：201-203.

[4]薩姆布魯克 J,拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南[M]．3版．黃培堂，譯．北京：科學出版社，2002：419.

Improvement of DNA Denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis in Experiment Teaching

BAO Siyuan

(College of Basic Medical, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China)

Status of DNA denaturing polyacrylamide gel electrophoresis is very important in modern biological technology, but polyacrylamide gel electrophoresis operation is difficult, affected by many factors, time-consuming. In order to make the DNA denaturing polyacrylamide gel electrophoresis adapt to experimental teaching, the vertical polyacrylamide electrophoresis technology related operation process is researched, and the experiment is improved and optimized. The improved and optimized experimental operation tends to be convenient, detailed, high success rate, less time-consuming, and reagent formula is more reasonable, which provide a basic condition for experimental teaching.

polyacrylamide gel; electrophoresis; improvement; optimization;experiment teaching

2014-07-07；修改日期: 2014-03-12

鮑思元(1976-)，男，碩士，講師，研究方向：植物分子遺傳學和生物技術。

G642.0；Q94-33

A

10.3969/j.issn.1672-4550.2015.02.040