干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基的優(yōu)化

魏晉梅,周玉春,張 麗,王 莉,包高良,羅玉柱,*,李保青

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基的優(yōu)化

魏晉梅1,2,周玉春3,張 麗3,王 莉3,包高良3,羅玉柱1,2,*,李保青3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

為了提高乳酸菌素的產(chǎn)量,本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化了干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)基。根據(jù)單因素實驗,篩選出對細菌素抑菌性能影響較大的培養(yǎng)基組分,利用中心復(fù)合實驗設(shè)計(Central Composite Design,CCD)原理,采用響應(yīng)面分析法,建立了二次多項式回歸方程的預(yù)測模型,確定了最有利于干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)基:乳糖1.86%,胰蛋白胨1%,檸檬酸三銨3.02%。此條件下抑菌圈理論預(yù)測直徑可達18.20mm,驗證實驗結(jié)果達到17.85mm,與預(yù)測結(jié)果一致,較優(yōu)化前抑菌性能顯著提高。

響應(yīng)面,細菌素,培養(yǎng)基,優(yōu)化

乳酸菌素(nisin)是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有活性的肽或前體肽[1],是目前公認的一種安全、廣譜、高效的天然防腐劑[2],具有專一性,完全不產(chǎn)生抗藥性及毒性,可有效抑制食品中腐敗菌和病原菌的生長,其特殊功能近年來引起了科技產(chǎn)業(yè)界的極大關(guān)注。干酪乳桿菌產(chǎn)生的細菌素對人體有營養(yǎng)保健作用,具有抑菌范圍廣,抑菌效果好,安全可靠等優(yōu)點[3]。

除乳酸菌本身的遺傳特性決定細菌素的產(chǎn)量外,培養(yǎng)基成分對細菌素的產(chǎn)量也有很大的影響。Mn2+對nisin的產(chǎn)生有促進作用,Mg2+可增加片球菌素pediocin AcH的產(chǎn)量[4];Tween 80對乳酸鏈球菌SM526產(chǎn)nisin有一定的刺激作用[5]。本研究對干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)基條件進行優(yōu)化,在不同碳源、氮源、無機鹽條件下培養(yǎng)干酪乳桿菌,使其進行發(fā)酵,通過測量抑菌圈的直徑大小評價得到的細菌素的活性,運用響應(yīng)面優(yōu)化最佳發(fā)酵條件[6],篩選出一種最優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基,從而對干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素的工業(yè)化生產(chǎn)進行初探,以提高細菌素產(chǎn)量,并為同類抑菌物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品實驗室提供。

培養(yǎng)基:脫脂乳培養(yǎng)基[7],MRS肉湯培養(yǎng)基[8](乳酸菌選擇培養(yǎng)基),MRS固體培養(yǎng)基[9],牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[9],營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[9]。

葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等 購自上海信裕生物科技有限公司;酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨等 購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;Tween 80 購自上海西唐生物科技有限公司;K2HPO4·7H2O、CH3COONa·3H2O、檸檬酸三銨、七水硫酸鎂、四水硫酸錳等 購自上海研生生化試劑有限公司,以上試劑均為分析純。

VD-650-U潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;THZ-82N臺式恒溫振蕩器 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海申賢恒溫設(shè)備廠;TGL-16M高速臺式冷凍離心機 上海趙迪生物科技有限公司;牛津杯 外徑8mm;培養(yǎng)皿 90mm。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗

1.2.1.1 碳源篩選 將干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基組分氮源固定為2%酵母膏;碳源分別選擇葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖,糖濃度取1%、2%、3%、4%、5%。接種后在37℃培養(yǎng)24h。將干酪乳桿菌的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃,8000r/min離心10min,棄去沉淀,獲發(fā)酵上清液,測定抑菌圈直徑。

1.2.1.2 氮源的篩選 將干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基組分碳源固定為2%葡萄糖;氮源分別選擇酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨,氮源濃度分別取0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%。接種后在37℃培養(yǎng)24h,將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃,8000r/min離心10min,棄去沉淀,獲發(fā)酵上清液,測定抑菌圈直徑。

1.2.1.3 無機鹽濃度篩選 檸檬酸三銨:將干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基中分別添加1%、2%、3%、4%、5%、6%的檸檬酸三銨,接種后在37℃培養(yǎng)24h,將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃,8000r/min離心10min,棄去沉淀,獲發(fā)酵上清液,測定抑菌圈直徑。

醋酸鈉:將干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基中分別添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的醋酸鈉,接種后在37℃培養(yǎng)24h,將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃,8000r/min離心10min,棄去沉淀,獲發(fā)酵上清液,測定抑菌圈直徑。

硫酸鎂:將干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基中分別添加0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的硫酸鎂,接種后在37℃培養(yǎng)24h,將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃,8000r/min離心10min,棄去沉淀,獲發(fā)酵上清液,測定抑菌圈直徑。

磷酸氫二鉀:將干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基中分別添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸鎂,接種后在37℃培養(yǎng)24h,將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃,8000r/min離心10min,棄去沉淀,獲發(fā)酵上清液,測定抑菌圈直徑。

1.2.1.4 生長因子濃度篩選 將干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基中分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的吐溫80,接種后在37℃培養(yǎng)24h,將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃,8000r/min離心10min,棄去沉淀,獲發(fā)酵上清液,測定抑菌圈直徑。

1.2.2 響應(yīng)面設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,采用響應(yīng)面設(shè)計實驗[6],運用中心復(fù)合實驗設(shè)計(Central Composite Design,CCD)分析對干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件顯著影響的因素,進行3因素3水平的響應(yīng)面實驗[10-13]。實驗設(shè)計見表1,每組實驗重復(fù)3次。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計

1.2.3 乳酸菌素活性測定-瓊脂擴散法 參照張剛[14]和高丹丹等[15]的方法,制備檢測平板和指示菌(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)菌懸液。吸取100μL待測樣品,以無菌操作加入到檢測平板圓孔內(nèi),37℃培養(yǎng)15h,觀察并測定抑菌直徑(mm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 碳源篩選 由圖1可知,保持其他物質(zhì)及濃度不變的條件下干酪乳桿菌對乳糖的利用最有效,乳糖作為碳源時發(fā)酵上清液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制最明顯。隨著乳糖濃度的增大,發(fā)酵上清液對指示菌的抑制作用越明顯,當乳糖濃度在2%時,對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達到最大值(15.20mm和14.53mm),隨后開始下降。因此選擇2%的乳糖作為干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基的碳源。

圖1 碳源單因素實驗Fig.1 The single factor test of carbon source

2.1.2 氮源篩選 保持其他物質(zhì)及濃度不變的條件下,干酪乳桿菌可有效利用各種氮源,其中胰蛋白胨的效果較好,當胰蛋白胨作為氮源時發(fā)酵上清液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制最明顯。隨著胰蛋白胨濃度的增大,發(fā)酵上清液對指示菌的抑制作用越明顯,當胰蛋白胨濃度為1%時,對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達到最大值(14.93mm和20.92mm),隨后開始下降,所以1%的胰蛋白胨適合作為干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基中的氮源(見圖2)。

圖2 氮源單因素實驗Fig.2 The single factor test of nitrogen source

2.1.3 無機鹽篩選 醋酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀的發(fā)酵上清液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制沒有太大的影響,抑菌圈直徑變化不明顯。檸檬酸三銨的發(fā)酵上清液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制最明顯,其濃度在1%～6%范圍內(nèi)變化時,抑菌圈的直徑先呈現(xiàn)增大趨勢,然后出現(xiàn)縮小趨勢,當檸檬酸三銨濃度為3%時,對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達到最大值(15.95mm和15.22mm)(圖3),因此檸檬酸三銨適合做干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基中的無機鹽。

圖3 無機鹽單因素實驗Fig.3 The single factor test of inorganic salt

2.1.4 生長因子 生長因子Tween 80對干酪乳桿菌抑菌效果的影響如圖4所示。Tween 80含量從0.05%增加到0.1%時,抑菌圈的直徑有所增大;當其含量從0.1%增大到0.25%時,大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑均呈現(xiàn)縮小趨勢,但不同濃度下Tween 80的發(fā)酵上清液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑并沒有顯著差異(p=0.62>0.05)?？梢?Tween 80作為一種表面活性劑,在培養(yǎng)基中的含量為0.05%～0.25%時對細菌素的產(chǎn)生沒有關(guān)鍵影響,因此,實驗中不再作為響應(yīng)面設(shè)計的優(yōu)化因子。本實驗選擇Tween 80的含量為0.05%。

圖4 Tween 80單因素實驗Fig.4 The single factor test of Tween 80

2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計分析

以單因素實驗為基礎(chǔ),選取對細菌素抑菌圈直徑影響較顯著的培養(yǎng)基(乳糖2%,胰蛋白胨1%,檸檬酸三銨3%),設(shè)計三因素三水平19個實驗點5個中心點的響應(yīng)面優(yōu)化實驗,CCD實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基的響應(yīng)面實驗分析:實驗根據(jù)CCD設(shè)計進行了19組實驗,利用 Design Expert 6.0.5 軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素發(fā)酵條件的回歸方程:Y=-131.68173+12.12469A+176.70709B+33.43144C-1.40338A2-70.08508B2-3.50342C2-3.37500AB-1.17500AC-10.12500BC。

從該模型的方差分析表(表3)可見,所選用的二次多項模型具有顯著性(p<0.05)。失擬項在α=0.05水平上不顯著(p=0.3479>0.05),其相關(guān)系數(shù)為0.8120,說明該模型能解釋81.20%響應(yīng)值的變化,僅有總變異的18.80%不能用此模型來解釋,說明該模擬合程度良好,用該模型對干酪乳桿菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化是合適的。模型回歸系數(shù)如表4所示。二次函數(shù)回歸模型(Quadratic Model)不同類型系數(shù)代表了不同含義,一次項系數(shù)顯著性代表了模型圖像在該變量坐標軸方向上呈現(xiàn)出線性斜面的可能性,二次項系數(shù)顯著性則代表了呈現(xiàn)出“拋物面”的可能性,而交互項則代表呈現(xiàn)出“馬鞍面”的可能性,其中拋物面可能性同時也是二次模型曲面存在極值的可能性。由表4可知,3類系數(shù)中,二次項系數(shù)顯著性總體高于一次項系數(shù)和交互項系數(shù),這說明該二次回歸模型呈現(xiàn)出拋物面的可能最高。3個因素A(乳糖)、B(胰蛋白胨)、C(檸檬酸三銨)的二次項系數(shù)p值分別為0.1498、0.0117、0.0034,則說明對于這3個變量而言,存在極值的可能性分別為85%、99%、99.7%。對該模型的F值進行比較可以得到各因素的影響主次順序為:A>B>C,即乳糖>胰蛋白胨>檸檬酸三銨。

表2 CCD 實驗設(shè)計及結(jié)果

注:空間校正參數(shù)δ取1.414。

表3 二次多項式模型方差分析表

通過上述二次多項回歸方程所做的響應(yīng)曲面見圖5～圖7。從圖5可知,當胰蛋白胨取一定值,乳糖含量在1.5%～2%范圍內(nèi)增大時,曲線較陡,在2%左右達到最大值,隨后開始下降。乳糖取一定值,檸檬酸三銨從2.5%增加到3%左右時,曲線較陡,變化明顯,在3%左右達到最大值,隨后開始平緩下降,說明檸檬酸三銨含量在較低濃度時對干酪乳桿菌抑菌性能的影響大于較高含量下的影響(圖6)。由圖7可見,檸檬酸三銨含量一定,胰蛋白胨從0.9%增大到1.1%時,曲線先呈現(xiàn)較陡的上升趨勢,在1.0%左右達到極大值,然后呈現(xiàn)下降平緩的趨勢,即胰蛋白胨含量較低時對干酪乳桿菌抑菌性能的影響較大。

表4 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗

注:“*”差異顯著,“**”差異極顯著。

圖5 乳糖和胰蛋白胨的交互作用Fig.5 The interaction of lactose and tryptone

圖6 乳糖和檸檬酸三銨的交互作用Fig.6 The interaction of lactose and ammonium citrate

圖7 胰蛋白胨和檸檬酸三銨的交互作用Fig.7 The interaction of tryptone and ammonium citrate

2.3 驗證實驗

為了驗證二次多項回歸方程所得預(yù)測結(jié)果的準確性,根據(jù)其最佳培養(yǎng)基配方:乳糖為1.86%、胰蛋白胨為1%、檸檬酸三銨為3.02%(固定因子Tween 80為0.05%),進行了3次干酪乳桿菌抑菌實驗,所得平均抑菌圈直徑為17.85mm,與預(yù)測值(18.20mm)很接近,相對誤差未超過5%,說明模型方程可信度較高,能夠很好地預(yù)測實驗結(jié)果。

3 結(jié)論

本實驗通過單因素實驗對碳源、氮源、無機鹽、生長因子進行篩選,確定了影響干酪乳桿菌生長繁殖的主要因素;通過CCD實驗設(shè)計原理,建立了二次多項式回歸方程的預(yù)測模型,確定了最有利于干酪乳桿菌產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)基:乳糖1.86%,胰蛋白胨1%,檸檬酸三銨3.02%,此條件下預(yù)測抑菌圈直徑可達18.20mm。驗證實驗結(jié)果達到17.85mm,與預(yù)測結(jié)果非常接近,比優(yōu)化前抑菌性能得到明顯提高。

[1]Anastasiadou S,Papagianni M,Filiousis G,et al. Pediocin SA-1,an antimicrobial peptide from Pediococcus acidilactici NRRLB5627;conditions,purification and characterization[J]. Bioresource Technology,2008,99(13):5384-5390.

[2]張秀云,余有本,唐應(yīng)芳. 天然防腐劑綜述[J]. 飲料工業(yè),2001,4(4):1-5.

[3]雷宏,李秀涼,莊海雯,等. 副干酪乳桿菌HD1.7長生抗菌物質(zhì)的初步研究[J]. 工業(yè)微生物,2005,26(1):140-142.

[4]陳秀珠,何松,龍力紅. 乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株ALZ的發(fā)酵條件的研究[J]. 微生物學(xué)通報,1995,22(4):215-217.

[5]莊緒亮,張洪勛,馬桂榮. 不同發(fā)酵條件下Tween80對乳酸鏈球菌SM526產(chǎn)nisin的影響[J]. 化工冶金,2000,21(2):145-148.

[6]曹小紅,蔡萍,李凡,等. 利用響應(yīng)面法優(yōu)化BacillusnattoTK-1產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 中國生物工程雜志,2007,27(4):59-65.

[7]Patricia Burns,Gabriel Vinderola,Fernando Molinari,et al. Suitability of whey and buttermilk for the growth and frozen storage of probiotic lactobacilli[J]. International Journal of Dairy Technology,2008,61(2):156-164.

[8]李鵬,葉淑紅,王際輝,等.一株嗜酸乳桿菌產(chǎn)共軛亞油酸條件的優(yōu)化[J]. 中國釀造,2009,213(12):56-58.

[9]凌代文,東秀珠.乳酸細菌分離鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999.

[10]李秀涼,雷虹,孟博,等. 肽類抑菌物質(zhì)效價的測定[J]. 食品科技,2006,22(3):113-115.

[11]張建飛,李巧賢. 細菌素的研究與應(yīng)用[J]. 飼料工業(yè),2008,29(4):7-8.

[12]謝繼輝,陳曉林,張明. 有關(guān)細菌素分離純化方法的評價[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報,2008,14(15):60-61.

[13]李秀涼,陳建偉,張玉娟,等. 利用RSM法優(yōu)化副干酪乳桿菌HD117產(chǎn)細菌素發(fā)酵培養(yǎng)基[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報,2008,5(5):621-624.

[14]張剛. 乳酸細菌-基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007.

[15]高丹丹,常通,曹郁生,等. 響應(yīng)面優(yōu)化中性蛋白酶水解棉籽蛋白工藝[J]. 食品科學(xué),2009,30(16):153-157.

Optimization on fermentation medium for bacteriocin produced by lactobacillus casei

WEI Jin-mei1,2,ZHOU Yu-chun3,ZHANG Li3,WANG Li3,BAO Gao-liang3,LUO Yu-zhu1,2,*,LI Bao-qing3

(1.Instrumental Research and Analysis Center,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology,Lanzhou 730070,China;3. College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

The components of fermentation medium were optimized by response surface methodology to improve the production of bacteriocin of lactobacillus casei. Based on confirming significant factors through single factor experiment,the central composite design(CCD)principle and the response surface analysis were used to establish the quadratic polynomial regression equation prediction model to determine the suitable fermentation medium for the production of bacteriocin of lactobacillus casei. The optimized fermentation medium was composed(%)of 1.86 lactose,1.0 tryptone,3.02 ammonium citrate. Under this condition,the verifying test result of the bacteriostatic ring was 17.85mm which was consistent with the theoretical value(18.20mm)of the bacteriostatic ring. The performance of the bacteriostasis was improved significantly than that before optimization.

response surface;bacteriocins;medium;optimize

2014-06-24

魏晉梅(1973-),女,碩士,副研究員,研究方向:食品科學(xué)。

*通訊作者:羅玉柱(1962)，男，博士，教授，研究方向：動物生物技術(shù)。

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW-2012-18)資助。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.029