L-精氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的初步研究

陳進(jìn)聰,陳雪嵐,張　斌,熊勇華,*

(1.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047;2.江西省南昌市江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330022)

L-精氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的初步研究

陳進(jìn)聰1,陳雪嵐2,張斌2,熊勇華1,*

(1.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047;2.江西省南昌市江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330022)

本文以鈍齒棒桿菌誘變菌為實(shí)驗(yàn)菌株,采用搖瓶發(fā)酵的方式,研究了培養(yǎng)基組分(碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源及無機(jī)鹽離子)與發(fā)酵培養(yǎng)條件(溫度、接種量、初始pH及發(fā)酵液體積)對菌種產(chǎn)L-精氨酸的產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明,該菌產(chǎn)L-精氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分為:葡萄糖12%、硫酸銨4.5%、玉米漿2.5%、KH2PO40.005%、MgSO4·7H2O 0.01%、FeCl3·6H2O 0.01%、MnSO4·H2O 0.05%及碳酸鈣3%;最佳發(fā)酵條件是:培養(yǎng)溫度為30℃、接種量為10%、初始pH為7.0及裝液量為15mL/250mL。該菌以最優(yōu)結(jié)果發(fā)酵,L-精氨酸的產(chǎn)量較基本培養(yǎng)基提高27.7%,達(dá)到了11.23g/L。

C.crenatumNAGK M4,L-精氨酸,發(fā)酵,優(yōu)化

L-精氨酸(L-Arginine,簡稱L-Arg)是含有胍基的堿性氨基酸,其化學(xué)名為α-氨基-δ-胍基戊酸,它是合成細(xì)胞漿蛋白、核蛋白和肌酸的重要原料,是人體和動(dòng)物體內(nèi)的半必需氨基酸,在醫(yī)藥和食品工業(yè)上具有廣泛用途。L-Arg是天門冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸和聚胺(腐胺、精胺及精瞇)等轉(zhuǎn)化為高能磷酸化合物-磷酸肌酸的中間體,在肝臟內(nèi)與尿素的形成有關(guān)[1-2],臨床上可作為復(fù)方氨基酸輸液的主要組分之一,除此之外,L-Arg及其鹽類也被廣泛地用作氨中毒的解毒劑。另外,以精氨酸為原料制備的陽離子表面活性劑具有抗菌性強(qiáng)、毒性低等特點(diǎn),是食品、化妝品等的優(yōu)良防腐劑[3]。

目前,全世界L-Arg年需求量在15000t以上,而實(shí)際年產(chǎn)量卻不到8000t,生產(chǎn)商主要集中在日本、美國和歐洲等國家和地區(qū),其中日本在這方面的研究處于領(lǐng)先水平[4-5]。我國目前L-Arg實(shí)際年產(chǎn)量不到1200t,而其需求量每年以15%的速度遞增,因此L-Arg在我國主要還依賴進(jìn)口,每年在進(jìn)口精氨酸這一個(gè)產(chǎn)品上的費(fèi)用需40到50億元人民幣。因此目前國內(nèi)外許多學(xué)者都致力于精氨酸生產(chǎn)菌的選育、工程菌的構(gòu)建以及生產(chǎn)工藝等方面的研究[6-12],以期提高L-Arg的產(chǎn)量。

鈍齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum)NAGK M4是C.crenatumAS1.542原始菌株經(jīng)過多次誘變篩選到的一株生物素缺陷株高產(chǎn)L-Arg的菌株,其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的產(chǎn)量為8.78g/L。本文主要采用搖瓶發(fā)酵的方法,通過單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵組分的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化,初步確定了C.crenatumNAGK M4的最佳發(fā)酵條件,為分子育種提高精氨酸產(chǎn)量做必要的準(zhǔn)備。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

C.crenatumNAGK M4為實(shí)驗(yàn)室改造后保藏的菌株;搖瓶種子培養(yǎng)基:葡萄糖3.5%,玉米漿2.5%,硫酸銨4.5%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.1%,尿素1.5%;初始培養(yǎng)基:葡萄糖12%,玉米漿2.5%,硫酸銨4.5%,碳酸鈣3%;基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖12%,玉米漿2.5%,硫酸銨4.5%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.1%,碳酸鈣3%;其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-L5上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;紫外可見分光光度計(jì)752W上海精密科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C酸度計(jì)川制00000411成都世紀(jì)方舟有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器2HWY-2102C上海智械分析儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1種子培養(yǎng)基對數(shù)生長期的確定取10%菌液接種于種子培養(yǎng)基,250r/min,30℃搖床培養(yǎng)24h,每6h取樣200μL。測定OD562,監(jiān)測生長曲線,確定對數(shù)生長期。每次做三個(gè)平行,做三個(gè)重復(fù)。

1.2.2單因素篩選培養(yǎng)基組分碳源篩選:初始培養(yǎng)基中分別加入不同的碳源(葡萄糖20%、蔗糖10%、乳糖10%);氮源篩選:初始培養(yǎng)基中分別加入5%不同的無機(jī)碳源(硫酸銨、硝酸鈉、尿素)、2%有機(jī)氮源(蛋白胨、酵母浸出膏、玉米漿);無機(jī)鹽離子篩選:初始培養(yǎng)基中分別加入0.1%的不同的無機(jī)鹽(KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeCl3·6H2O),30℃,250r/min發(fā)酵96h。取樣測定精氨酸的含量。每組做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3單因素優(yōu)化培養(yǎng)基組分根據(jù)單因素篩選的較優(yōu)結(jié)果,分別對葡萄糖、硫酸銨、玉米漿,KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O進(jìn)行發(fā)酵濃度梯度的優(yōu)化。其中葡萄糖(9.0%、12%、15%、18%)、硫酸銨(1.5%、30%、4.5%、60%)、玉米漿(1.5%、2.5%、3.5%、4.5%)、KH2PO4(0.0%、0.005%、0.01%、0.05%)、MgSO4·7H2O(0.005%、0.01%、0.05%)、FeCl3·6H2O(0.005%、0.01%、0.05%)、MnSO4·H2O(0.05%、0.1%、0.2%),進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照。每組做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4發(fā)酵條件的優(yōu)化初始pH對產(chǎn)L-Arg的影響:以篩選出的最佳培養(yǎng)基組合為發(fā)酵培養(yǎng)基,分別將培養(yǎng)基初始pH調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,按10%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃,250r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)96h后取樣測定精氨酸含量;裝液量對產(chǎn)L-Arg的影響:以篩選出的最佳培養(yǎng)基組合為發(fā)酵培養(yǎng)基,在250mL廣口三角瓶中分別裝入10、15、20、25mL的培養(yǎng)液,30℃,250r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)96h后取樣測定L-Arg含量;接種量對產(chǎn)L-Arg的影響:以篩選出的最佳培養(yǎng)基組合為發(fā)酵培養(yǎng)基,分別以8%、10%、12%和14%的接種量接種到pH7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃,250r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)96h后取樣測定L-Arg含量;發(fā)酵溫度對產(chǎn)L-Arg的影響:以篩選出的最佳培養(yǎng)基組合為發(fā)酵培養(yǎng)基,按10%的接種量接種到pH7.0的培養(yǎng)基中,分別在28、30、32、34℃,250r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)96h后取樣測定L-Arg含量。

1.2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將活化的菌株以10%的接種量,接種至葡萄糖12%、硫酸銨4.5%、玉米漿 2.5%,KH2PO40.005%、MgSO4·7H2O 0.01%、FeCl3·6H2O 0.01%、MnSO4·H2O 0.05%以及碳酸鈣3%所組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中,其中pH為7.0,裝液量為15mL/250mL。在30℃,250r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)96h后取樣測定L-Arg含量。

1.3測定方法

改良的坂口試劑法測定L-Arg含量制備1mg/mLL-Arg標(biāo)準(zhǔn)液,用標(biāo)準(zhǔn)液配制0.00、0.01、0.03、0.05、0.07和0.09mg/mL濃度的L-Arg各500μL,依次加入2mL 0.375mol/L NaOH及0.5mL顯色液,30℃水浴反應(yīng)20min,測OD520吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量的發(fā)酵液加ddH2O稀釋至500μL,依次加入2mL 0.375mol/L NaOH及0.5mL顯色液,30℃水浴反應(yīng)20min,測OD520后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)計(jì)算發(fā)酵液中L-Arg的濃度。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件中的單因素方差分析進(jìn)形數(shù)據(jù)顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1種子培養(yǎng)基對數(shù)生長中期的確定

對數(shù)生長期是菌體活力最強(qiáng)時(shí)期,所以對數(shù)生長期是最合適的接種時(shí)期;pH可影響菌體對基質(zhì)的利用速度和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)狀態(tài),從而影響菌體生長速度和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此,本實(shí)驗(yàn)研究了種子培養(yǎng)基中不同初始pH下的菌體生長,圖1結(jié)果表明,種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至12～16h進(jìn)入對數(shù)生長中期;初始pH在6.8～7.4之間對菌體的生長影響不顯著,然而pH7.4菌體生長略有優(yōu)勢。因此,確定菌種在pH7.4的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h為最佳的接種時(shí)間。

表3　不同有機(jī)氮源對L-Arg產(chǎn)量的影響

表4　無機(jī)鹽離子對L-Arg產(chǎn)量的影響

圖1　不同初始pH下的生長曲線Fig.1　The growth curves of different initial pH

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基組分的篩選

葡萄糖、蔗糖和乳糖都可以作為生物體的碳源。菌株利用這三種碳源的能力見表1,結(jié)果顯示葡萄糖作為碳源產(chǎn)酸要高于蔗糖,乳糖基本不被利用。

表1　不同碳源對L-Arg產(chǎn)量的影響

氮源是構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的材料,是菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸所必需的。菌體對不同氮源的利用率不同,實(shí)驗(yàn)考察了不同無機(jī)氮源和有機(jī)氮源對菌體發(fā)酵產(chǎn)L-Arg量的影響。

表2　不同無機(jī)氮源對L-Arg產(chǎn)量的影響

注:ND檢測不到數(shù)值。

2.3精氨酸高產(chǎn)菌株單因素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)發(fā)酵組分篩選的結(jié)果,確定最優(yōu)碳源為葡萄糖;無機(jī)氮源為硫酸銨;有機(jī)氮源是玉米漿;KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O及MnSO4·H2O為必需的無機(jī)鹽離子源。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及前期實(shí)驗(yàn)[13-15],進(jìn)行各組分的濃度梯度的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因素及水平見表5,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2　發(fā)酵培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化結(jié)果Fig.2　Single factor optimal results of fermentation media components

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在葡萄糖12%、硫酸銨4.5%、玉米漿2.5%、KH2PO40.005%、MnSO4·H2O 0.05%、FeCl3·6H2O 0.010%、MgSO4·7H2O 0.010%的培養(yǎng)條件下,C.crenatumNAGK M4菌株的產(chǎn)L-Arg效果最優(yōu),且由統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS分析得葡萄糖、硫酸銨,玉米漿,FeCl3.6H2O,MgSO4·7H2O各梯度間存在顯著差異,而KH2PO4,MnSO4·H2O不存在顯著差異。

表5　發(fā)酵培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化水平表

2.4搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1初始pH對發(fā)酵產(chǎn)L-Arg的影響微生物的生長及代謝的進(jìn)行必須依靠多種酶的催化反應(yīng),而pH作為重要的環(huán)境影響因素,其變化會(huì)引起各種酶活力的改變,對菌體形態(tài)和代謝途徑影響都很大。本實(shí)驗(yàn)考察了初始pH對發(fā)酵產(chǎn)L-Arg的影響,結(jié)果表明(見圖3),發(fā)酵培養(yǎng)基在pH7.0時(shí),產(chǎn)L-Arg量最高,各組間無顯著性差異。

圖3　初始pH對L-Arg發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.3　The effect of initial pH on L-Arg production

2.4.2裝液量對發(fā)酵產(chǎn)L-Arg的影響L-Arg發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵,因此必須保證一定的溶氧來滿足菌體的需求。本實(shí)驗(yàn)采用搖瓶發(fā)酵,當(dāng)在搖床轉(zhuǎn)速一定時(shí),相同的250mL凹底三角瓶中,裝液量越少,溶解氧含量越高;但若裝液量過少,由于培養(yǎng)時(shí)間需要達(dá)到96h,水分蒸發(fā)顯著,可能對細(xì)胞的生長不利而導(dǎo)致產(chǎn)精氨酸量降低。本實(shí)驗(yàn)考察了不同裝液量對發(fā)酵產(chǎn)L-Arg的影響,結(jié)果如圖4所示,裝液量在15mL/250mL時(shí),產(chǎn)L-Arg量最高,各組間無顯著性差異。

圖4　裝液量對L-Arg發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.4　The effect of loading volume on L-Arg production

2.4.3接種量對發(fā)酵產(chǎn)L-Arg的影響一般情況下,接種量大,發(fā)酵時(shí)間縮短,可減少染菌幾率,從而提高發(fā)酵效率;但若接種量過大,可能使菌體生長過快,培養(yǎng)液黏度增加,導(dǎo)致溶氧不足,影響產(chǎn)物的合成;若接種量過小,發(fā)酵周期明顯增長,同時(shí)產(chǎn)L-Arg量也有所下降。為此對不同的接種量進(jìn)行了研究,結(jié)果見圖5所示,接種量在10%時(shí),產(chǎn)L-Arg量最高,各組間無顯著性差異。

圖5　接種量對L-Arg發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.5　The effect of inoculum concentration on L-Arg production

2.4.4溫度對發(fā)酵產(chǎn)L-Arg的影響溫度對產(chǎn)L-Arg的影響是多方面的,從酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)來看,溫度升高,反應(yīng)速度加快,生長速度快,產(chǎn)物生成提前;但是,酶受熱也容易失活,溫度越高,失活越快,菌體也越容易衰老。溫度還可以通過影響發(fā)酵液的性質(zhì)(如基質(zhì)和氧的溶解)間接影響發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)研究了不同溫度對產(chǎn)L-Arg的影響,結(jié)果如圖6所示,溫度在30℃產(chǎn)L-Arg量最高,各組間無顯著性差異。

圖6溫度對L-Arg發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.6　The effect of temperature on L-Arg production

2.4.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基組分:葡萄糖12%、硫酸銨4.5%、玉米漿2.5%、KH2PO40.005%、MgSO4·7H2O 0.010%、FeCl3·6H2O 0.010%、MnSO4·H2O 0.05%及碳酸鈣3%,在最優(yōu)培養(yǎng)條件下培養(yǎng):培養(yǎng)溫度為30℃、接種量為10%、初始pH為7.0、裝液量為15mL/250mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測得L-Arg產(chǎn)量達(dá)到了11.23g/L,較基本培養(yǎng)基(葡萄糖12%、硫酸銨4.5%、玉米漿2.5%、KH2PO40.005%、MgSO4·7H2O 0.01%及碳酸鈣3%)在相同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)酸量8.78g/L,提高了27.7%。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以C.crenatumNAGK M4為實(shí)驗(yàn)菌株,采用搖瓶發(fā)酵的方式,運(yùn)用單因素篩選的方法研究培養(yǎng)基組分(碳源、有機(jī)氮氮源、無機(jī)氮源、金屬離子及生長因子)與發(fā)酵培養(yǎng)條件(培養(yǎng)溫度、接種量、初始pH及發(fā)酵液體積)對菌種產(chǎn)L-Arg的產(chǎn)量的影響。研究結(jié)果表明,該菌產(chǎn)L-Arg的最佳組分為:葡萄糖12%、硫酸銨4.5%、玉米漿2.5%、KH2PO40.005%、MgSO4·7H2O 0.01%、FeCl3·6H2O 0.01%、MnSO4·H2O 0.05%及碳酸鈣 3%;發(fā)酵最優(yōu)條件是:培養(yǎng)溫度為30℃、接種量為10%、初始pH為7.0、裝液量為15mL/250mL。采用以上優(yōu)化條件,對C.crenatumNAGK M4發(fā)酵后L-Arg產(chǎn)量較基本培養(yǎng)基提高了27.7%,達(dá)到了11.23g/L。

[1]張志芳,李全民.糖尿病內(nèi)皮功能障礙的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)工程,2011,19(4):160-161.

[2]蔣明玉,蔡德培.口服精氨酸促進(jìn)長骨線性生長的作用及神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制[J].神經(jīng)科學(xué)通報(bào),2011,27(3):156-162.

[3]許虹. 鈍齒棒桿菌產(chǎn)L-精氨酸供氧策略優(yōu)化的初步研究[D].無錫:江南大學(xué),2008:7-12.

[4]熊筱晶,竇文芳,許正宏,等.L-精氨酸高產(chǎn)菌的誘變育種及其搖瓶產(chǎn)酸條件[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(2):10-13.

[5]Nakayama T,Soda K. Production of amino acids[J]. Nutr req commerc import microorg,1998,7(4):202-235

[6]周棟,唐志如,馮澤猛,等.L-精氨酸產(chǎn)生菌誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究,2010,31(6):733-737 .

[7]Kisumi M,Kato J,Sugiura M,et al. Production ofL-arginine by arginine hydroxamate-resistant mutants of Bacillus subtilis[J].Applied and environment microbiology,1971,22(6):987-998.

[8]Kisumi M,Takagi T,Chibata I. Construction of anL-arginine-producing mutant in Serratia marcescens[J]. Journal of Biochemistry,1978,84(4):881-890.

[9]Dou W,Xu M,Cai D,et al. Improvement ofL-arginine production by overexpression of a bifunctional ornithine acetyltransferase in Corynebacterium crenatum[J]. Applied biochemistry and biotechnology,2011,165(3-4):845-855.

[10]Xu M,Rao Z,Yang J,et al. Heterologous and homologous expression of the arginine biosynthetic argC～H cluster from Corynebacterium crenatum for improvement of l-arginine production[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2012,39(3):495-502.

[11]Xu M,Rao Z,Xu H,et al. Enhanced production of L-arginine by expression of Vitreoscilla hemoglobin using a novel expression system in Corynebacterium crenatum[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2011,163(6):707-719.

[12]Xu M,Rao Z,Yang J,et al. The Effect of a LYSE Exporter Overexpression on l-Arginine Production in Corynebacterium crenatum[J]. Current Microbiology,2013,67(3):271-278.

[13]龔建華,丁久元,路志強(qiáng),等.L-精氨酸發(fā)酵條件的研究[J].微生物學(xué)報(bào),1988,28(3):257-264.

[14]張義萍.L-精氨酸產(chǎn)生菌的選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化[D].無錫:江南大學(xué),2006:14-38.

[15]朱進(jìn)偉.微生物法發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的研究[D].無錫:江南大學(xué),2008:34-46.

Optimization of fermentation medium and fermentation conditions ofL-arginine producing strain

CHEN Jin-cong1,CHEN Xue-lan2,ZHANG Bin2,XIONG Yong-hua1,*

(1.Sino-German Joint Research Institute of Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.College of Life Science,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China)

In this paper,usingCorynebacteriumcrenatummutagenesis as tester strain,the effects of medium components(carbon,organic nitrogen,inorganic nitrogen,inrotrogen ions)and the fermentation conditions(incubation temperature,inoculum size,initial pH,the volume of fermentation broth)on arginine production were investigated through shake flask. The results indicated that the optimalL-arginine-producing medium was composed of 12% Glucose,4.5% ammonium sulfate,2.5% corn steep liquor,0.005% potassium dihydrogen phosphate,0.01% seven water magnesium sulfate,0.01% six water ferric chloride,0.05% Manganese sulfate monohydrate and 3% calcium carbonate. The optimal fermentation conditions were 30℃ of culture temperature,10% of inoculum concentration,7.0 of initial pH and 15mL/250mL of loading volume. On the base of the optimal fermentation medium and fermentation conditions,the production of arginine increased by 27.7% and reached 11.23g/L.

C.crenatumNAGK M4;L-arginine;fermentation;optimization

2014-06-12

陳進(jìn)聰(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：基因表達(dá)與調(diào)控。

*通訊作者:熊勇華(1970-)，男，博士，研究員，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(31360219，30960012)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.027