酶解扁杏仁粕制備抗氧化肽工藝

趙換霞,張海生,楊淑芳

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

酶解扁杏仁粕制備抗氧化肽工藝

趙換霞,張海生*,楊淑芳

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

為優(yōu)化酶解扁杏仁粕制備抗氧化肽的工藝條件,采用響應(yīng)面分析法,研究了加酶、底物濃度、溫度和pH對(duì)酶解扁杏仁粕的影響。以還原力為響應(yīng)值,優(yōu)化參數(shù)加酶量6725U/g,底物濃度3%、溫度60℃和pH8.28。酶解液的還原力為0.743,與模型預(yù)測(cè)具有較好的擬合性。此工藝制備的扁杏仁抗氧化肽具有較強(qiáng)的體外抗氧化性,且其含有較高的抗氧化氨基酸。

杏仁粕,抗氧化肽,氨基酸

大扁杏仁是一種甜杏仁,富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,其中蛋白質(zhì)含量約26%左右[1-2],是一種具有很高經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值的植物蛋白[3]。營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作用后并不是完全以游離氨基酸的形式被吸收,而是主要以肽的形式被吸收[4]。生物活性肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì),是具有氨基酸序列的多肽,并在腸道消化過(guò)程中充當(dāng)新陳代謝潛在生理效應(yīng)物[5]。近年來(lái)大量研究表明,蛋白質(zhì)經(jīng)合適的蛋白酶水解制成的多肽產(chǎn)品具有一定的抗氧化活性[6],國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從多種食物蛋白酶解液中分離出具有抗氧化活性的肽片段,包括大豆抗氧化肽[7-8]、花生抗氧化肽[9]、玉米抗氧化肽[10-11]。黃昆[12]以風(fēng)味蛋白酶酶解脫脂山杏仁,制備了對(duì)DPPH·清除能力較強(qiáng)的杏仁抗氧化肽。而人類許多慢性疾病及衰老現(xiàn)象均和人體內(nèi)的自由基水平失衡有關(guān),過(guò)量的自由基對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化性損傷,當(dāng)這種損傷不能及時(shí)修復(fù)并且積累到一定程度會(huì)導(dǎo)致心腦血管疾病、糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)生[13-15],因此,對(duì)于抗氧化肽的開(kāi)發(fā)具有重要意義。目前,對(duì)于大扁杏仁的研究主要集中在對(duì)杏仁油的研究,而榨油后蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上的杏仁粕,被用作動(dòng)物飼料或者制作飲料,其利用價(jià)值低。

本實(shí)驗(yàn)就堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解扁杏仁粕制備抗氧化活性肽的最佳酶解條件進(jìn)行了研究,并對(duì)所制得的扁杏仁抗氧化肽進(jìn)行了全面的體外抗氧化評(píng)價(jià),同時(shí)對(duì)扁杏仁抗氧化肽中的氨基酸進(jìn)行了評(píng)價(jià),從而為開(kāi)發(fā)具有高附加值的扁杏仁抗氧化活性肽提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),也有利于扁杏仁粕的資源深度開(kāi)發(fā)利用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

扁杏仁陜西省榆林市榆陽(yáng)區(qū)旺達(dá)扁杏仁加工廠提供；堿性蛋白酶BRITISH DRUG HOUSE公司(BDH);風(fēng)味蛋白酶、BDH、DPPH Sigma公司；鐵氰化鉀天津盛奧、TCA天津天力、磷酸氫二鈉天津天力、磷酸二氫鈉天津天力、氯化鐵天津盛奧、硫酸亞鐵天津盛奧、水楊酸天津恒興、無(wú)水乙醇天津富宇、雙氧水天津富宇,抗壞血酸等都為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為去離子蒸餾水。

HH-S4A型電熱恒溫震蕩水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司;AL204型電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司;LGJ-10C型冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;PHSJ-3F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;低速臺(tái)式大容量離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;L3可見(jiàn)分光光度計(jì):上海儀電分析儀器有限公司;氨基酸自動(dòng)分析儀:日本HITACHI公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1扁杏仁短肽的制備將扁杏仁粉碎,在室溫下用石油醚(沸程30～60℃)脫脂3次,置通風(fēng)櫥中24h以揮發(fā)有機(jī)溶劑,得脫脂扁杏仁粉,過(guò)60目篩。取脫脂扁杏仁粉若干,按比例加入蒸餾水,放入恒溫震蕩水浴鍋中,待溫度恒定后,調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H,按一定的酶底物比加入堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶開(kāi)始水解,水解一定時(shí)間后,終止反應(yīng),沸水浴滅酶15min。冷卻后以4000r/min離心20min,取上清液過(guò)濾即得酶解液。

1.2.2扁杏仁抗氧化肽制備的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以固定酶解時(shí)間為2.5h,堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶活比為3∶2;基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以酶用量、底物濃度、溫度和pH為自變量,以還原力為響應(yīng)值,根據(jù)BOX-Benhnken設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

式中:A0為空白對(duì)照溶液的吸光度;A1為加入樣品液后的吸光度;A2為不加水楊酸溶液酶解液的吸光值。

1.2.4還原力的測(cè)定將2mL的扁杏仁粕酶解液與2mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)和2mL 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻后在50℃反應(yīng)20min,然后加入2mL 10%的TCA溶液,3000r/min離心10min。吸取2mL上清液于試管中,并加入2mL蒸餾水和0.4mL 0.1% FeCl3溶液,反應(yīng)10min后在700nm處測(cè)定其吸光度[17]。吸光度值越大則樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.2.5DPPH自由基清除率的測(cè)定取2mL不同濃度的樣品溶液于10mL試管中,加入2mL 0.1mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液,混合均勻,于室溫下避光反應(yīng)30min后,在517nm測(cè)定其吸光度[18]。每個(gè)樣品3組重復(fù)。

式中:Ai為DPPH溶液+樣品溶液的吸光度;Ai0為無(wú)水乙醇+樣品溶液的吸光度;A0為DPPH溶液+去離子水的吸光度。

1.2.6酶解產(chǎn)物氨基酸組成的分析稱取0.05g冷凍干燥后的杏仁粕酶解物,用6mol/L鹽酸于110℃水解24h,脫酸后,用水定容至5mL,氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定[19]。

1.3數(shù)據(jù)分析及處理

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析采用Design-expert(7.0)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS數(shù)學(xué)分析軟件進(jìn)行分析及處理。

2　結(jié)果與討論

2.1響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果分析

2.1.1模型的建立與顯著性分析表2為響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合,獲得響應(yīng)值(Y)與酶用量(X1)、底物濃度(X2)、溫度(X3)和pH(X4)的二次回歸方程,如下:

Y=+0.75+0.012X1+0.026X2+6.667×10-3X3+0.046X4+0.012X1X2-0.027X1X3-0.074X1X4+0.015X2X3-0.047X2X4-0.011X3X4-0.053X12-0.076X22-0.041X32-0.061X42

2.1.2響應(yīng)面分析圖1為根據(jù)多元回歸模型做出的響應(yīng)面圖。由圖1結(jié)合表3中各因素的p值可以看出,模型的一次項(xiàng)X4,交互項(xiàng)X1X4,二次項(xiàng)X12、X22、X32和X42對(duì)還原力的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.0001),一次項(xiàng)X2,交互項(xiàng)X2X4對(duì)還原力的影響達(dá)到了高度顯著性水平(p<0.01);一次項(xiàng)X1,交互項(xiàng)X1X3對(duì)還原力的影響達(dá)到顯著水平(p<0.05)。表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大的影響。比較響應(yīng)面模型二次多項(xiàng)式方程中一次項(xiàng)的方差的大小,可以判斷影響因素的主次順序。各因素對(duì)還原力影響程度大小為X4>X2>X1>X3,即pH>底物濃度>加酶量>溫度。

表2　響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　還原力的方差分析表

2.1.3最優(yōu)工藝條件的確定及驗(yàn)證對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析,通過(guò)響應(yīng)面軟件分析,獲得堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解扁杏仁粕制備杏仁抗氧化肽的最優(yōu)條件為:酶用量6725.65U/g、底物濃度2.98%、溫度60.54℃、pH8.28,還原能力理論值為0.759;為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法的可行性,并綜合考慮實(shí)際操作的便利性,將工藝參數(shù)修正為:酶用量6725U/g、底物濃度3%、溫度60℃、pH8.28,經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,得到還原力的平均值為0.743,與理論值相差2.22%。說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合較好,驗(yàn)證了所預(yù)測(cè)模型的正確性。因此,響應(yīng)面法對(duì)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解制備扁杏仁抗氧化肽工藝的條件的參數(shù)優(yōu)化是可行的,得到的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.2扁杏仁抗氧化肽體外活性測(cè)定

利用響應(yīng)面軟件分析得到最優(yōu)酶解條件,制備扁杏仁抗氧化肽酶解液,將其冷凍干燥后,測(cè)定其對(duì)羥基自由基的清除率、DPPH·的清除率以及還原能力,并與同濃度的VC的抗氧化能力進(jìn)行比較,結(jié)果如圖2～圖4所示。

圖1　還原力的響應(yīng)面Fig.1　Response surface plots for reducing power

圖2　不同質(zhì)量濃度扁杏仁抗氧化肽對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.2　The hydroxyl radical scavenging potential of apricot kernel anti-oxidation activity polypeptides at various concentrations

圖3　不同質(zhì)量濃度扁杏仁抗氧化肽的還原力Fig.3　The reducing power of apricot kernel anti-oxidation activity polypeptides at various concentrations

圖4　不同質(zhì)量濃度扁杏仁抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.4　The DPPH free radical scavenging potential of apricot kernel anti-oxidation activity polypeptides at various concentrations

羥自由基是毒性最強(qiáng)的一種自由基,它會(huì)和機(jī)體細(xì)胞的糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸等生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng),從而對(duì)細(xì)胞和機(jī)體造成損傷[21-22]。由圖2可以看出,隨著扁杏仁抗氧化肽濃度的增加,羥基自由基的清除能力也隨之增加,當(dāng)濃度達(dá)到12mg/mL時(shí),羥基自由基的清除率達(dá)到82.27%,接近于同濃度VC的能力,是同濃度VC能力的90.64%;抗氧化劑的總還原力與其抗氧化性之間存在聯(lián)系,總還原力越強(qiáng),抗氧化能力就越強(qiáng)[23],由圖3可以看出,扁杏仁抗氧化肽的還原能力隨著酶解產(chǎn)物濃度的增加而升高,酶解產(chǎn)物的濃度在12mg/mL的濃度下,其還原能力的吸光度值為1.36,是同濃度VC能力的95.67%。由圖4可以看出,DPPH·的清除率同樣隨酶解產(chǎn)物濃度的升高而升高,在較低濃度下也具有良好的清除能力,當(dāng)扁杏仁抗氧化肽的濃度為6mg/mL時(shí),其清除率為57.58%。

2.3酶解產(chǎn)物氨基酸組成分析

由表4可知,杏仁抗氧化肽含有15種氨基酸,LiB等人在文獻(xiàn)[24]中報(bào)道:蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸是四種有自由基清除效果的關(guān)鍵氨基酸。也有研究指出[25],半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸,苯丙氨酸以及它們的衍生物具有抗氧化性。由表4可知,在扁杏仁抗氧化肽中,所有這些具有抗氧化活性的氨基酸占氨基酸總量的50.77%。此外,總疏水基氨基酸的含量高達(dá)39.45%,而具有抗氧化活性物質(zhì)多與堿性氨基酸和疏水性氨基酸有關(guān)[26];同時(shí),肽的抗氧化活性強(qiáng)弱與其氨基酸組成及序列等化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量大小密切相關(guān)[27]。扁杏仁肽中具有抗氧化活性的氨基酸含量較高,這可能是扁杏仁肽具有抗氧化作用的原因之一。因此,氨基酸的組成表明利用此生產(chǎn)工藝制備扁杏仁肽具有良好的抗氧化能力。

表4　扁杏仁抗氧化肽中氨基酸的含量

注:*為疏水性氨基酸;n.d 表示沒(méi)有測(cè)定。

3　結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得出扁杏仁抗氧化肽的最佳酶解工藝為:酶用量6725U/g、底物濃度3%、溫度60℃、pH8.28,在該條件下制備的扁杏仁抗氧化活性的還原力為0.743。對(duì)扁杏仁抗氧化肽的羥基自由基的清除率、DPPH·的清除能力和還原力進(jìn)行了全面的研究,并對(duì)其氨基酸組分進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,扁杏仁抗氧化肽具有較強(qiáng)的清除自由基的能力和還原能力,其抗氧化氨基酸含量較高,可能是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗氧化劑。

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Technology for production of antioxidant peptides from apricot kernel meal by enzymolysis

ZHAO Huan-xia,ZHANG Hai-sheng*,YANG Shu-fang

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shannxi Normal University,Xi’an 710062,China)

In order to optimize enzymolysis conditions for production of antioxidant peptides from apricot kernel meal,the effect of operating conditions,such as enzyme dosage,substrate concentration,temperature and pH value,were analyzed by response surface methodology. Reducing power was chosen as the response value and optimum conditions were as follows:enzyme dosage 6725U/g,substrate concentration 3%,temperature 60℃ and pH8.28. Under such conditions,reducing power of enzymatic hydrolysates was 0.743,which was well matched with the predicted yield. Apricot kernel meal antioxidant peptide prepared with these enzymatic hydrolysis technological parameters presented strong antioxidant activity and it contained higher antioxidant amino acids.

apricot kernel meal;antioxidant peptide;amino acids

2014-07-10

趙換霞(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及功能食品。

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2011CB236000017)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)07-0232-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.041

*通訊作者:張海生(1965-)，博士，副教授，研究方向：動(dòng)植物資源開(kāi)發(fā)利用及功能食品研究。