上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在大鼠舌黏膜創(chuàng)口愈合中的作用

孔苗苗，孫應(yīng)明，張夢(mèng)潔，張亞軍，楊聰翀，劉來奎

0 引 言

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)即上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷徙能力的過程［1］。EMT 是胚胎發(fā)育的一個(gè)基本過程，同時(shí)在創(chuàng)傷愈合、慢性炎癥、癌癥轉(zhuǎn)移及多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用。大量的證據(jù)證明EMT 在多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和創(chuàng)傷愈合過程中發(fā)揮重要的作用［2］。然而在口腔黏膜創(chuàng)傷愈合過程中是否發(fā)生EMT 目前研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)我們對(duì)大鼠舌部黏膜創(chuàng)口愈合過程采用間接免疫熒光的方法同步檢測(cè)上皮細(xì)胞特異性蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)和間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白波形蛋白(Vimentin)及成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(fibroblast-specificprotein1，F(xiàn)SP1)的表達(dá)，以探討其在舌黏膜創(chuàng)口愈合EMT 過程中的發(fā)生及作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 選用健康清潔級(jí)8 周齡Wistar 大鼠48 只，體重(250±10)g，由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(蘇)2012-0004。所有大鼠飼養(yǎng)在南京醫(yī)科大學(xué)口腔研究所動(dòng)物房，自由攝食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

水合氯醛、即用型山羊血清封閉劑、3%過氧化氫液、鼠抗人單克隆Vimentin 抗體(Santa sc-32322)，兔抗人多克隆 E-cad 抗體(GenTex GTX100443)，兔抗人多克隆FSP1 抗體(Proteintech 16105-1-AP)，F(xiàn)ITC 標(biāo)記二抗和TRITC 標(biāo)記熒光二抗(美國(guó)santa cruz)，DAPI、防熒光淬滅劑、冰凍切片機(jī)、激光掃描共聚焦顯微鏡(型號(hào)710)。

1.2 方法

1.2.1 傷口模型及切片制備 以10%的水合氯醛，按照0.3 mL/100 mg 體重行大鼠腹腔注射麻醉后，75%乙醇、碘伏消毒，使用皮膚活檢打孔器于大鼠上舌前1/3 與舌中1/3 交界處中央環(huán)切一直徑3 mm 切口，深達(dá)黏膜下層，中間黏膜使用尖銳器械取下，暴露創(chuàng)面，壓迫止血［3］。實(shí)驗(yàn)開始后，分別于術(shù)后0、1、2、3、4 d 及創(chuàng)口完全愈合的第8 天以注射過量麻醉藥的方法處死大鼠(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8 只)，取舌部新鮮組織以O(shè)CT 包埋劑固定，冰凍切片機(jī)做5 μm連續(xù)切片，室溫下晾干30 min，置冷丙酮中固定30 min，60 ℃烘箱烘片20 min。

1.2.2 組織學(xué)觀察 HE 染色，光鏡觀察大鼠舌黏膜組織缺損傷口愈合情況。

1.2.3 間接免疫熒光檢測(cè) 將上述組織切片置于PBS 搖洗5 min×3 次。置于3%過氧化氫液中，37 ℃孵育10 min，消除組織內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS 搖洗5 min×3 次，滴加山羊血清封閉1 h，37 ℃。滴加E-cad(1 ∶1000)，Vimentin(1 ∶100)和FSP1(1∶500)，4 ℃過夜。次日從4 ℃取出，復(fù)溫1 h，PBS搖洗5 min×3 次，滴加熒光二抗，37 ℃孵育1 h，注意避光。PBS 搖洗5 min×3 次，滴加DAPI(1∶50)室溫2 min 襯染，最后滴加防熒光淬滅劑封固，并置于激光共聚焦顯微鏡觀察拍片。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 術(shù)后0 d 可見舌部創(chuàng)口處形成血痂。術(shù)后1 ～4 d 舌黏膜創(chuàng)口上覆蓋一層血清纖維素層，邊緣變得不規(guī)整，并向傷口中心緩慢遷移;術(shù)后8 d，創(chuàng)面基本為上皮層覆蓋，肉眼觀與鄰近組織無差異。

2.2 鏡下觀察 術(shù)后0 d，可見剛創(chuàng)建的傷口上皮層斷裂;在術(shù)后1 d，傷口處可見大量的細(xì)胞碎片，組織下方炎性細(xì)胞浸潤(rùn);術(shù)后2 ～4 d，成纖維細(xì)胞拉攏使創(chuàng)口面積縮小，創(chuàng)口邊緣區(qū)上皮細(xì)胞增殖開始向中央移行;術(shù)后8 d，上皮細(xì)胞增殖明顯，創(chuàng)面基本關(guān)閉，新生上皮層上皮釘突形態(tài)不顯著，角化層未完全形成。見圖1。

圖1 鏡下觀察大鼠造模后傷口愈合情況(HE ×50)Figure 1 Wound healing in rats under the microscope(HE ×50)

2.3 間接免疫熒光 術(shù)后0 d，缺損邊緣區(qū)舌黏膜上皮可見E-cad 呈網(wǎng)狀表達(dá)于上皮細(xì)胞包膜，Vimentin、FSP1 廣泛表達(dá)于黏膜下層，上皮釘突長(zhǎng)且密，上皮基底層細(xì)胞呈柵欄樣緊密排列。術(shù)后1 d 與0 d 相比E-cad、Vimentin、FSP1 表達(dá)未見顯著差異，但術(shù)后1 d 缺損邊緣區(qū)上皮釘突變短或稀疏。術(shù)后2 ～4 d，可見上皮基底層細(xì)胞E-cad 表達(dá)減少，Vimentin、FSP1 大量表達(dá)于基底層細(xì)胞，可觀測(cè)到個(gè)別細(xì)胞共同表達(dá)E-cad 和Vimentin。術(shù)后8 d 大鼠創(chuàng)口基本愈合，上皮基底層可見零星Vimentin 和FSP1 表達(dá)。

圖2 鏡下觀察大鼠舌黏膜創(chuàng)口邊緣區(qū)E-cad 和Vimentin的表達(dá)(×400)Figure 2 E-cad and Vimentin expressions at the edge of lingual mucosa wound in rats under the microscope(×400)

圖3 鏡下觀察大鼠舌黏膜創(chuàng)口邊緣區(qū)Vimentin 和FSP1的表達(dá)(×400)Figure 3 Vimentin and FSP1 expressions at the edge of lingual mucosa wound in rats under the microscope(×400)

3 討 論

越來越多的研究證明EMT 與癌癥轉(zhuǎn)移、組織器官纖維化及皮膚創(chuàng)傷愈合密切相關(guān)，但在口腔黏膜創(chuàng)傷愈合放面卻依然缺乏足夠的佐證。高璐等［4］研究證明分化抑制因子1 通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲性。研究證明EMT 在肺部和腎纖維化過程中發(fā)揮了重要作用，但無證據(jù)證明其是否與皮膚創(chuàng)傷愈合及纖維化相關(guān)［5－6］。對(duì)肺細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)顯示劃痕區(qū)上皮細(xì)胞呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型，并且劃痕愈合后間質(zhì)細(xì)胞表型消失［7］。Savagner 等［8］研究發(fā)現(xiàn)皮膚外植體在體外培養(yǎng)5 d 后從外植體邊緣有角質(zhì)形成細(xì)胞爬出，表明此時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞具有了間質(zhì)細(xì)胞的移動(dòng)性。上述體外實(shí)驗(yàn)證明創(chuàng)口愈合過程中確實(shí)發(fā)生了EMT 現(xiàn)象。另有研究證明在不同部位的皮膚創(chuàng)傷中EMT細(xì)胞數(shù)目不同，在小鼠耳部皮膚創(chuàng)口中EMT 的數(shù)目明顯低于小鼠腹部創(chuàng)口［9］。

本實(shí)驗(yàn)通過間接免疫熒光法檢測(cè)EMT 相關(guān)蛋白E-cad、Vimentin、FSP1 在大鼠舌黏膜缺損區(qū)表達(dá)的變化來觀察EMT 在創(chuàng)傷愈合過程中的發(fā)生和發(fā)展。E-cad 是細(xì)胞黏附分子鈣黏蛋白家族中的一員，表達(dá)于上皮細(xì)胞胞膜，細(xì)胞質(zhì)少見，它在維持細(xì)胞極性、細(xì)胞間黏附性和細(xì)胞間信息傳遞方面具有重要作用［10］。E-cad 表達(dá)降低是EMT 發(fā)生的重要指標(biāo)［11－12］。Vimentin 是中間絲蛋白家族的重要成員，幾乎表達(dá)于所有正常的間質(zhì)細(xì)胞中，對(duì)維持細(xì)胞完整性和抵御外界應(yīng)急的損傷起重要作用［13］。FSP1是一種鈣離子結(jié)合蛋白，文獻(xiàn)報(bào)道其與細(xì)胞支架、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞黏附及細(xì)胞自身運(yùn)動(dòng)等密切相關(guān)［14－15］。Vimentin和FSP1 如今也是公認(rèn)的觀測(cè) EMT 的標(biāo)志物［12，16－17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在舌黏膜創(chuàng)傷愈合初期第1 天組織中E-cad、Vimentin 的表達(dá)與實(shí)驗(yàn)組0 d 未見明顯差異，但在實(shí)驗(yàn)2 ～4 d 上皮釘突處基底層組織E-cad 表達(dá)減少，Vimentin 表達(dá)增加，并在3 d 達(dá)到高峰。另一組對(duì)FSP1 的觀察結(jié)果與Vimentin 的表達(dá)變化趨勢(shì)一致。提示EMT 發(fā)生于大鼠舌黏膜創(chuàng)口形成1 d 后，并在第3 天達(dá)到峰值，最后隨著創(chuàng)口愈合時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生EMT 的細(xì)胞數(shù)量減少直至愈合。但是本研究未能對(duì)EMT 的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討。國(guó)外學(xué)者研究報(bào)道人類皮膚創(chuàng)傷愈合過程與腫瘤壞死因子-α 通過成骨蛋白-2 介導(dǎo)的EMT 相關(guān)［18］。Savagner 等［8］通過原位雜交技術(shù)分析了Snail2 在傷口愈合過程中的表達(dá)，在小鼠體內(nèi)毗鄰創(chuàng)口區(qū)皮膚的角化細(xì)胞中、在體外培養(yǎng)的從小鼠皮膚組織獲取的上皮外植體中及體外培養(yǎng)的小鼠創(chuàng)口邊緣區(qū)角化細(xì)胞中其表達(dá)都升高。Snail2 缺陷小鼠的皮膚外植體培養(yǎng)得到上皮細(xì)胞明顯少于正常鼠。此外，Snail2高表達(dá)的角質(zhì)細(xì)胞其細(xì)胞擴(kuò)散和橋粒破壞現(xiàn)象明顯，提示其在EMT 和傷口愈合過程中發(fā)揮了重要作用［19］。在N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶Ⅴ轉(zhuǎn)基因小鼠中其皮膚創(chuàng)口愈合過程中EMT 現(xiàn)象增加，創(chuàng)口愈合速度加快，提示N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶Ⅴ與EMT介導(dǎo)的皮膚創(chuàng)口愈合有關(guān)［20］。

創(chuàng)傷修復(fù)是個(gè)復(fù)雜的過程，它與表皮細(xì)胞、真皮層及免疫系統(tǒng)密切相關(guān)［21］。創(chuàng)口愈合過程可分為2個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞機(jī)制:①角化細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的再上皮化過程，通過減少角化細(xì)胞間的胞件連接促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)到創(chuàng)傷部位。②通過成纖維細(xì)胞收縮拉攏縮小創(chuàng)傷面積［22］。EMT 過程與角化細(xì)胞驅(qū)動(dòng)再上皮化密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證明在大鼠舌黏膜創(chuàng)口形成1 d 后發(fā)生EMT 現(xiàn)象，因此我們認(rèn)為促進(jìn)EMT 早期的發(fā)生和發(fā)展有利于黏膜創(chuàng)傷的愈合。有研究證明Snail2 mRNA表達(dá)水平增加可以加快創(chuàng)口愈合速度［23］。目前常用的促潰瘍愈合藥物主要由外源性生長(zhǎng)因子構(gòu)成，其機(jī)制較為單一主要是促進(jìn)創(chuàng)口區(qū)新生血管，加速愈合［24］。于是已經(jīng)有學(xué)者試圖通過EMT 過程的研究以尋求采用外源性生長(zhǎng)因子以外發(fā)的方式來促進(jìn)或者協(xié)同外源性生長(zhǎng)因子促進(jìn)黏膜創(chuàng)傷的修復(fù)。

口腔潰瘍是口腔科常見疾病，最新流行病學(xué)研究調(diào)查了1192 名平均年齡55.6 歲的上海居民，其復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患病率為1.48%，創(chuàng)傷性潰瘍患病率高達(dá)1.13%［25］。本實(shí)驗(yàn)初步嘗試通過觀察大鼠舌黏膜創(chuàng)口愈合過程中的EMT 現(xiàn)象為尋找促進(jìn)黏膜潰瘍愈合提供新的思路，但實(shí)驗(yàn)未對(duì)EMT 在創(chuàng)口愈合過程中的發(fā)生機(jī)制及其影響因素進(jìn)行研究，這將是我們下一步研究的主要方向。

［1］ Kalluri R，Neilson EG.Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis［J］.J Clin Invest，2003，112(12):1776-1784.

［2］ 黃曉丹，季國(guó)忠.上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中作用的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23(3):319-322.

［3］ 苗明三，徐玉茵，劉會(huì)麗.口腔潰瘍動(dòng)物模型研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24(9):1636-1637.

［4］ 高 璐，呂 剛，孫 凱，等.分化抑制因子1 通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌HepG2 細(xì)胞的侵襲性［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(12):1254-1257.

［5］ Willis BC，Borok Z.TGF-beta-induced EMT:mechanisms and impli-cations for fibrotic lung disease［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293:L525-L534.

［6］ Yang J，Liu Y.Dissection of key events in tubular epithelial to myofi-broblast transition and its implications in renal interstitial fibrosis［J］.Am J Pathol，2001，159:1465-1475.

［7］ Borthwick LA，McIlroy EI，Gorowiec MR，et al.Inflammation and epithelial to mesenchymal transition in lung transplant recipients:role in dysregulated epithelial wound repair［J］.Am J Transplant，2010，10(3):498-509.

［8］ Savagner P，Kusewitt DF，Carver EA，et al.Developmental transcription factor slug is required for effective re-epithelialization by adult keratinocytes［J］.J Cell Physiol，2005，202(3):858-866.

［9］ Yin SY，Peng AP，Huang LT，et al.The phytochemical shikonin stimulates epithelial-mesenchymal transition (EMT)in skin wound healing［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013:262796.

［10］ Schmaltlofcr O，Brabletz S，Brabletz T.E-cadherin，beta-catenin，and ZEBl in malignant progression ofcancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2009，28:151-166.

［11］ Zavadil J，Bottinger EP.TGF-beta and epithelial-to-mesenchy mal transitions［J］.Oncogene，2005，24(37):5764-5774.

［12］ Kong W，Li S，Liu C.Epithelial-mesenchymal transition occurs after epidermal development in mouse skin.［J］.Exp Cell Res，2006，15，312(19):3959-3968.

［13］ Satelli A，Li S.Vimemitin in cancer and its potential as a molecular target for cancer therapy［J］.Cell Mol Life Sci，2011，68:3033-3046.

［14］ Taylor S，Herdngtoa S，Prim W，et al.S100A4(p9Ka)proteinin coIon carcinoma and liver metastasis:association with carcinoma cells and T-lymphocytes［J］.Br J Cancer，2002，86:409-416.

［15］ Sherbet GV，Lakshmi MS.S100A4(MTSI)calcium binding protein in cancer growth［J］.Inva Metas，1998，18(4A):2415-2421.

［16］ Le M，Hir I，Hegyi D，et al.Kaissling，Characte rization of renal interstitial fibroblast-s pecific protein 1/S100A4-positi ve cells in healthy and inflamed rodent kidneys［J］.Histochem Cell Biol，2005，123(4-5):335-346.

［17］ Iwano M，Plieth D，Danoff TM.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis［J］.J Clin Invest，2002，110(3):341-350.

［18］ Yan C，Grimm WA，Garner WL，et al.Epithelial to mesenchymal transition in human skin wound healing is induced by tumor necrosis factor-alpha through bone morphogenic protein-2［J］.Am J Pathol，2010，176(5):2247-2258.

［19］ Savagner P，Kusewitt DF，Carver EA，et al.Developmental transcription factor Slug is required for effective re-epitheli-alization by adult keratinocytes［J］.J Cell Physiol，2005，202:858-866.

［20］ Terao M，Ishikawa A，Nakahara S，et al.Enhanced epithelialmesenchymal transition-like phenotype in N-acetylglucosaminyltransferase V transgenic mouse skin promotes wound healing［J］.J Biol Chem，2011，286(32):28303-28311.

［21］ 柯 俊，戚榮豐，盧光明.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙腦結(jié)構(gòu)磁共振成像研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(11):1219-1222.

［22］ Coulombe PA.Wound epithelialization:accelerating the pace of discovery［J］.J Invest Dermatol，2003，121(2):219-230.

［23］ Arnoux V，Nassour M，L'Helgoualc'h A，et al.Erk5 controls Slug expression and keratinocyte activation during wound healing［J］.Mol Biol Cell，2008，19(11):4738-4749.

［24］ 屈紀(jì)富，郝 利，孫 薇，等.細(xì)胞因子在創(chuàng)傷愈合過程中的變化及其意義的研究進(jìn)展［J］.創(chuàng)傷外科雜志，2003，5(1):74-76.

［25］ Feng J，Zhou Z，Shen X，et al.Prevalence and distribution of oral mucosal lesions:a cross-sectional study in Shanghai，China［J］.J Oral Pathol Med，2014，22:12264.