根皮苷對血吸蟲病小鼠肝纖維化的作用*

毛志江，張 碩，2△，王慶林，2

(1.湖南省瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 長沙 410000；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410153)

根皮苷對血吸蟲病小鼠肝纖維化的作用*

毛志江1，張 碩1，2△，王慶林1，2

(1.湖南省瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 長沙 410000；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410153)

方法 雄性昆明小鼠200只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，余20只做正常組，其余以腹部貼片法以血吸蟲尾蚴感染小鼠，每只小鼠感染日本血吸蟲尾蚴(30±1)條，建立血吸蟲病肝纖維化小鼠動物模型。室溫正常飼養(yǎng)6w后隨機分：①模型組(n=20)：7w末開始給以生理鹽水灌胃，共15 w；②單純吡喹酮殺蟲組(n=20)：以吡喹酮殺蟲，劑量500 mg/kg，分兩天給藥，殺蟲1 w后：予以生理鹽水灌胃，每天一次，共15 w；③吡喹酮殺蟲+IFN-γ(500 iu/kg/d)組(n=20)：7 w末開始頸背部皮下注射用藥，共15 w；④吡喹酮殺蟲+根皮苷低、中、高劑量組(10 mg/kg/d、20 mg/kg/d、40 mg/kg/d)：每組20只，7 w末開始灌胃用藥，共15 w。正常組(n=20)：不以尾蚴感染及吡喹酮殺蟲，自尾蚴感染后第7 w開始給以生理鹽水灌胃，共15 w。各組小鼠于末次給藥12 h后眼球取血，斷頸處死，留取血清、肝脾組織分別行：(1)生化檢測：測定小鼠血清的Hyp、HA、PⅢNT、LN含量及TGF-β1和PDGF-BB含量；(2)肝組織病理學(xué)檢查：應(yīng)用HE染色觀測蟲卵結(jié)節(jié)大小，反映根皮苷各劑量組對血吸蟲病肝纖維化的作用及機制。結(jié)果 Hyp、HA、PⅢNT、LN含量及TGF-β1和PDGF-BB含量在用藥第4 w到第8 w呈降低趨勢，且高劑量根皮苷的各項指標最接近空白組，抑制血吸蟲病肝纖維化作用明顯。HE染色顯示高劑量根皮苷組肝臟變性壞死減輕明顯，小葉結(jié)構(gòu)完整。根皮苷各劑量組和IFN-γ組計分較模型組顯著降低(P<0.01)，根皮苷低、中量組與IFN-γ組有顯著性差異(P<0.05)，根皮苷各劑量組之間有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果表明，根皮苷劑量呈量效增強關(guān)系。結(jié)論 ① 單純吡喹酮殺蟲后血吸蟲肝纖維化仍能進展；② 在殺蟲的基礎(chǔ)上，聯(lián)合根皮苷治療可降低促纖維化因子TGF-β1、PDGF-BB，減輕小鼠肝組織炎癥反應(yīng)，保護肝細胞；減少膠原纖維表達，從而抑制血吸蟲病性肝纖維化進程；根皮苷3個劑量組呈量效增強關(guān)系，以根皮苷(40 mg/kg/d)效果最好。

血吸蟲；根皮苷；纖維化

血吸蟲病最主要的病理改變是蟲卵肉芽腫和肝纖維化，肝纖維化是肉芽腫的間接延伸，是影響患者生活質(zhì)量與導(dǎo)致死亡的主要原因。肝星狀細胞是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，為正常肝臟或者纖維化肝臟細胞外基質(zhì)主要產(chǎn)生的細胞[1]。肝星狀細胞活化、增殖以及合成各種細胞外基質(zhì)成分受到多種因素影響，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生長因子(PDGF)，特別是TGF-β1與相應(yīng)受體結(jié)合后能促進肝星狀細胞大量增殖和膠原的表達和過度合成[2-3]，導(dǎo)致肝纖維化的特征是肝膠原和其它基質(zhì)蛋白的增高，使肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝功能下降[4]。目前尚無理想的抗肝纖維化的藥物。根皮苷(Phlorizin，AP)是一種低毒和無誘變性的黃酮類物質(zhì)。根皮苷對CCl4致小鼠肝纖維化具有作用[5]，但未見其對血吸蟲病肝纖維化的作用進行研究。本研究通過觀察根皮苷對日本血吸蟲病肝纖維化小鼠肝臟羥脯氨酸(Hyp)、透明質(zhì)酸(HA)、血清Ⅲ型膠原(PCⅢ)、層連蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)及血小板衍生生長因子(PDGF)表達的影響，觀察肝組織病理變化，為探討根皮苷抗日本血吸蟲病肝纖維化的作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實驗藥物 根皮苷為99% 純度的原料藥購自南京澤朗生物醫(yī)藥公司；吡喹酮粉末由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室提供。

1.2 小鼠血吸蟲病肝纖維化模型建立及動物分組 健康昆明小鼠140只，雌雄各半，體重(20±2)g，鼠齡6～8 周，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(湘)2009-0004。實驗對照組(A組)每只小鼠均不感染日本血吸蟲尾蚴，其它小鼠每只感染血吸蟲尾蚴(30±2)條，第56日用吡喹酮(500mg/kg，諾華制藥)灌胃治療2 d。治療后小鼠隨機分為單純吡喹酮殺蟲組(B 組)、根皮苷低(C組)、中(D組)、高(E組)劑量組、γ干擾素(F組)。B組每日灌胃生理鹽水0.2 mL/20 g；C組每鼠每日灌胃根皮苷10 mg/kg/d；D 組每鼠每日灌胃根皮苷20 mg/kg/d；E組每鼠每日灌胃根皮苷40 mg/kg/d；F 組每鼠每日灌胃γ干擾素150 mg/kg/d。第4周和第6周每組各處死3只小鼠用于各項指標測定，第八周則處死各組除自然死亡后剩余小鼠用于各項指標測定。

1.3 檢測項目和方法

1.3.1 肝纖維化指標檢測 取右葉肝組織勻漿，離心，取上清，按照南京建成生物工程研究所提供的測試盒說明書測定肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量。透明質(zhì)酸(HA)、血清Ⅲ型膠原(PCⅢ)、層連蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β)1和血小板衍生生長因子(PDGF)使用美國R&D公司的試劑盒測定含量。

1.3.2 病理學(xué)檢查 小鼠肝組織石蠟切片經(jīng)HE染色后作病理檢查。

2 結(jié) 果

2.1 對血清因子及肝組織羥脯氨酸影響 小鼠的肝臟或者血液的Hyp、HA、PⅢNT和LN含量見間接反映根皮苷對血吸蟲病肝纖維化的影響(見表1)。Hyp、HA、PⅢNT和LN含量第11周到第15周呈降低趨勢，顯示根皮苷對早期肝纖維化作用明顯。Hyp、HA、LN水平組高于A 組，低于B、C、E 組(P<0.01，P<0.05)；PⅢNT水平D 組高于A 組，低于B、C組(P<0.05)。吡喹酮組的肝纖維化指標顯著高于空白對照組(P<0.05)，發(fā)生肝腫脹現(xiàn)象，而給藥組大幅降低。給藥組中低劑量根皮苷組與吡喹酮組相比部分指標，但統(tǒng)計學(xué)分析未見顯著性差異。中高劑量根皮苷的各項指標最接近空白組，抑制血吸蟲病肝纖維化作用明顯。結(jié)果表明，根皮苷劑量水平，呈量效增強關(guān)系，其中高劑量組40mg/kg 綜合效果較佳。

2.2 對肝臟組織病理學(xué)影響 小鼠予相應(yīng)藥物治療15w后，單純吡喹酮殺蟲組：肝臟蟲卵肉芽腫、纖維增生、炎細胞浸潤及小葉結(jié)構(gòu)紊亂等病變較模型組輕，但大多數(shù)肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，門管區(qū)纖維組織增生明顯，纖維間隔多而粗大、致密。殺蟲+根皮苷(10 mg/kg/d)組：蟲卵肉芽腫大小范圍和密集程度略少于單純吡喹酮殺蟲組，蟲卵周圍膠原纖維及炎癥細胞浸潤減少。殺蟲+根皮苷(20 mg/kg/d、40 mg/kg/d)及殺蟲+IFN-γ組：與單純吡喹酮殺蟲組相比，肉芽腫面積縮和纖維組織明顯減少，其中殺蟲+根皮苷(40 mg/kg/d)組尤其明顯(見圖1)。

表1 根皮苷影響小鼠血吸蟲病肝纖維化Hyp、HA、PⅢNT和LN含量

注：a.與空白組比較，在P<0.05時差異顯著；b.與吡喹酮比較，在P<0.05時差異顯著。A：正常組；B：單純吡喹酮殺蟲組；C：殺蟲+根皮苷(10mg/kg/d)組；D：殺蟲+根皮苷(20mg/kg/d)組；E：殺蟲+根皮苷(40mg/kg/d)組；F：殺蟲+IFN-γ組。

HE染色肉芽腫少卵結(jié)節(jié)大小結(jié)果(見表2)：單純毗哇酮殺蟲組和各給藥組較正常對照組明顯升高(P<0.01)；殺蟲+根皮苷各劑量組和殺蟲+IFN-γ組較模型組顯著降低(P<0.01)；殺蟲+根皮苷各劑量組比單純吡喹酮殺蟲組顯著性小(P<0.05)，殺蟲+根皮苷各劑量組之間相互比較無顯著差異(P>0.05)，殺蟲+根皮苷各劑量組與IFN-γ組比較無顯著差異(P>0.05)；殺蟲+IFN-γ組比單純吡喹酮殺蟲組顯著縮小(P<0.05)。

表2 根皮苷對各組小鼠肝組織蟲卵結(jié)節(jié)的影響(×104 um2)

備注：aP>0.05；bP<0.05。A：正常組；B：單純吡喹酮殺蟲組；C：殺蟲+根皮苷(10mg/kg/d)組；D：殺蟲+根皮苷(20mg/kg/d)組；E：殺蟲+根皮苷(40mg/kg/d)組；F：殺蟲+IFN-γ組。

圖1 各組小鼠肝臟蟲卵結(jié)節(jié)HE染色

2.3 對TGF-β1、PDGF-BB的表達的影響 TGF-β1、PDGF-BB在正常組微量表達，單純吡喹酮殺蟲組在殺蟲后血清中TGF-β1、PDGF-BB仍在增加，根皮苷各劑量組和IFN-γ組相對單純吡喹酮殺蟲組TGF-β1、PDGF-BB血清含量均有下降，根皮苷中、高劑量組對TGF-β1、PDGF-BB影響較顯著，其中根皮苷高劑量組對TGF-β1、PDGF-BB影響接近IFN-γ組(見表3)。

表3 根皮苷對各組小鼠TGF-β1和PDGF-BB含量的影響

A：正常組；B：單純吡喹酮殺蟲組；C：殺蟲+IFN-γ組；D：殺蟲+根皮苷(10mg/kg/d)組；E：殺蟲+根皮苷(20mg/kg/d)組；F：殺蟲+根皮苷(40mg/kg/d)組。a：與單純吡喹酮殺蟲組比較差異顯著P<0.05；b：與殺蟲+IFN-γ組比較差異顯著P<0.05。

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湖南省教育廳科研基金重點項目(NO：10A073)

毛志江(1981～)，女，研究方向：主要從事醫(yī)學(xué)檢驗與微生物研究.

△通信作者：張碩，碩士，E-mail：fullhouse66@163.com.

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