不同波形電針對PCPA致失眠大鼠下丘腦5-HT和GLu、GABA含量的影響

蔣潔,趙百孝,哈略,趙華

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,烏魯木齊 830054;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

隨著社會的快速發(fā)展,睡眠障礙已相當(dāng)普遍,不同年齡段及社會經(jīng)濟地位的人群均可出現(xiàn)不同程度的睡眠問題。有統(tǒng)計顯示,全球慢性失眠的患病率約為10%[1]。失眠可獨立于其他任何疾患而存在,也可為其他病癥的表現(xiàn)之一。目前治療主要分為藥物和非藥物治療兩大類。電針療法由于操作簡便、可控性強在臨床治療中取得較滿意療效,但卻存在參數(shù)選擇隨意、量化標(biāo)準(zhǔn)不一等問題。本研究采用不同電針波形刺激對失眠模型大鼠進行干預(yù),觀察大鼠下丘腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glutamic acid, Glu)和γ-氨基丁酸(Aminobutyric acid, GABA)的變化,探討電針不同波形調(diào)節(jié)睡眠的差異及可能機制,為臨床電針治療失眠的規(guī)范化提供一定的實驗參考。

1 材料與方法

1.1 動物分組及造模

清潔級雌性SD大鼠50只,體重為(200±20) g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動物房提供[生產(chǎn)許可證號SCXK(新)2011-0004]。大鼠購進后采用隨機數(shù)字表法分為正常組10只、模型組10只和電針組30只。電針組再隨機分為電針1組、電針2組和電針3組,每組10只。實驗室溫度為20℃～25℃,相對濕度為50%～60%,動物自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1星期后,進行PCPA失眠大鼠模型制備[2-3],用弱堿性生理鹽水(pH值為7.0～8.0)將PCPA按照30 mg/100 g體質(zhì)量配置成混懸液,模型組及3組電針組大鼠每日以1 mL/100 g體積進行腹腔注射1次,連續(xù)2 d。模型組有1只大鼠于第2天注射PCPA后死亡,動物于注射30 h后出現(xiàn)完全失眠狀態(tài)。空白組大鼠連續(xù)2 d腹腔注射相同PCPA用量體積的弱堿性生理鹽水。

1.2 主要儀器與試劑

華佗牌SDZ-Ⅴ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);無菌針灸針(0.16 mm×7 mm,北京中研太和醫(yī)藥有限公司);大鼠固定器(自制,圓柱形,暴露四肢);對氯苯丙氨酸(D-4-Chlorophenylalanine, PCPA)(美國Sigma公司生產(chǎn));5-HT、Glu、GABA酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒(北京誠林生物科技有限公司提供);Multiskan 352型MS酶標(biāo)儀(芬蘭LABSYSTEM公司);TG16W型微量高速離心機(鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 電針治療及處理方法

3組電針組造模成功后,均采用電針治療。取神門、三陰交穴。穴位定位參照《實驗針灸學(xué)》[4],神門穴位于大鼠前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣,三陰交穴位于大鼠后肢內(nèi)踝尖直上10 mm。采用毫針分別垂直刺入神門、三陰交約2 mm和4 mm,連接電針治療儀,兩側(cè)肢體穴輪流交替使用。各電針組按照規(guī)定波形選取相應(yīng)參數(shù),電針1組采用連續(xù)波,頻率為10 Hz;電針2組采用連續(xù)波,頻率為50 Hz;電針3組采用疏密波,頻率為10/50 Hz(SDZ-Ⅴ型電針儀,疏密波波形的疏波、密波輸出頻率之比為1:5,選擇頻率為10/50 Hz)。電流強度以針柄顫動,但能使動物不掙扎嘶叫、保持安靜為度,同時應(yīng)用數(shù)字萬用電表檢測在體電流強度為0.1～0.2 mA,留針20 min。每日定時治療1次,連續(xù)治療6 d。

模型組大鼠每日按照電針組相同方法、相同時間段內(nèi)抓取固定,空白組不做處理。各組大鼠治療結(jié)束后,禁食、不禁水24 h后取材,并進行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.4 標(biāo)本采集與檢測

所有大鼠移出SPF實驗室,脫頸椎處死,在枕骨大孔處迅速剪斷延髓,去顱骨,完全暴露腦組織,然后取出腦組織,在冰平皿上分離出下丘腦后,在冰冷生理鹽水中洗去血液,組織稱重后,在冰浴條件下充分勻漿,離心(3000 r/min,10 min),取上清液。

下丘腦中5-HT、Glu、GABA的含量用ELISA法測定,具體步驟按照試劑盒要求進行操作,最后在酶標(biāo)儀450 nm處測得OD值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,各項指標(biāo)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差齊性檢驗,單因素方差分析,繼以LSD檢驗比較兩組之間的差異。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立大鼠失眠模型

PCPA所致失眠大鼠模型具有造模時間短、操作簡單、成功率高、可重復(fù)性強等優(yōu)點,是較為公認(rèn)的失眠模型。給予 PCPA 的大鼠出現(xiàn)明顯的失眠特征,活動頻繁,對外界的聲、光等刺激異常敏感,興奮性增高,攻擊性增強,晝夜節(jié)律紊亂,白天也活動不止,表明急性失眠模型復(fù)制成功;電針組干預(yù)后期,大鼠毛色相對潤澤,精神狀態(tài)相對較佳;空白組毛色光潔,呼吸平穩(wěn),反應(yīng)靈敏,飲食正常。

2.2 各組大鼠腦組織中5-HT含量影響

與空白組比較,模型組大鼠腦內(nèi)5-HT含量明顯減少(P＜0.01),提示使用5-HT抑制劑造模成功;與模型組比較,3組電針組大鼠腦內(nèi) 5-HT含量均顯著增加(P＜0.01),提示電針可以提高失眠大鼠腦內(nèi) 5-HT含量。電針2組和電針3組大鼠腦內(nèi)5-HT含量與電針1組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。電針3組大鼠腦內(nèi)5-HT含量與電針2組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織中5-HT含量比較 (±s,pg/mL)

表1 各組大鼠腦組織中5-HT含量比較 (±s,pg/mL)

注:與空白組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01;與電針1組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05;與電針2組比較5)P＜0.01

組別 n 5-HT空白組 10 338.86±3.56模型組 9 208.73±7.431)電針1組 10 272.09±6.581)2)電針2組 10 262.50±8.081)2)4)電針3組 10 249.34±4.451)2)3)5)

2.3 各組大鼠大腦皮質(zhì)Glu、GABA含量及其比值比較

與空白組比較,模型組大鼠大腦皮質(zhì)Glu、GABA含量均明顯增高(P＜0.01),Glu/GABA比值增大(P＜0.01);與模型組比較,3組電針組大鼠大腦皮質(zhì)Glu、GABA含量均顯著減少(P＜0.01),Glu/GABA比值減小(P＜0.01)。電針2組和電針3組大鼠大腦皮質(zhì)Glu、GABA含量與電針1組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。電針3組大鼠大腦皮質(zhì)Glu、GABA含量與電針2組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)Glu、GABA含量及其比值比較(±s,ng/mL)

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)Glu、GABA含量及其比值比較(±s,ng/mL)

注:與空白組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與模型組比較3)P＜0.01;與電針1組比較4)P＜0.01,5)P＜0.05;與電針2組比較6)P＜0.01

組別 n Glu GABA Glu/GABA空白組 10 20.41±0.69 12.52±0.58 1.63±0.09模型組 9 37.51±0.421) 21.71±0.451) 1.73±0.361)電針1組 10 24.27±0.591)3) 15.44±0.621)3) 1.57±0.793)電針2組 10 24.97±0.351)3)5) 16.25±0.571)3)4) 1.54±0.512)3)電針3組 10 26.41±0.531)3)4)6) 17.54±0.361)3)4)6) 1.51±0.481)3)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為失眠主要是由于心神失養(yǎng)或不安,陰陽氣血失調(diào)而引起經(jīng)常不能獲得正常睡眠為特征的一種病證,病位主要在心、腦,基本病機為陽盛陰衰,陰陽失交[5-8]。神門為手少陰心經(jīng)輸穴、原穴,心氣出入之門戶,主治神志病?！夺樉拇蟪伞酚小爸餍男园V呆,健忘”的記載,有宣通心氣、鎮(zhèn)靜安神、疏通氣血的作用,善走氣分。三陰交為足太陰脾經(jīng)穴,肝、脾、腎三經(jīng)交會穴,有健脾養(yǎng)肝強腎、清心醒腦、養(yǎng)血安神之功,善行血分。已有實驗[9-10]報道,電針和麥粒灸刺激神門、三陰交穴組的鎮(zhèn)靜催眠效果優(yōu)于申脈照海穴、百會神道心俞穴穴組。從調(diào)理臟腑、安腦鎮(zhèn)靜、協(xié)調(diào)陰陽3方面考慮,選取神門、三陰交兩穴配伍,共奏鎮(zhèn)靜安神之效。

睡眠與覺醒是一個主動的神經(jīng)調(diào)節(jié)過程,許多神經(jīng)遞質(zhì)參與其中。腦內(nèi)5-HT濃度的升高,會使機體產(chǎn)生疲勞感和睡意,是作用于睡眠-覺醒周期的重要單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。PCPA是色胺酸類抑制劑,快速色氨酸耗竭一方面通過減少色氨酸攝入,另一方面通過增加色氨酸轉(zhuǎn)運載體競爭性抑制作用,可使大腦中5-HT合成和釋放減少[11],最終導(dǎo)致由5-HT水平降低導(dǎo)致一系列與其功能相關(guān)行為學(xué)改變。5-羥色氨酸(5-HTP)可翻轉(zhuǎn)PCPA對睡眠的影響。連續(xù)注射PCPA 1星期后,可出現(xiàn)嚴(yán)重失眠,腦內(nèi)5-HT水平很低,此時應(yīng)用5-HTP后,REM和NREM可恢復(fù)到正常睡眠的70%左右。單獨使用5-HTP也可產(chǎn)生催眠作用,從而提示5-HT是一個促進睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)[12-15]。本實驗大鼠腹腔注射PCPA后造模后,大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失,睡眠-覺醒周期紊亂,對光感、聲響反應(yīng)敏感,模型組大鼠下丘腦內(nèi)5-HT含量顯著低于空白組,而電針治療后5-HT含量均顯著增多,直接反映了失眠的治療效果,提示電針可增強5-HT在腦內(nèi)的合成與代謝,改善睡眠周期,產(chǎn)生致眠作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明,失眠是一種神經(jīng)興奮/抑制功能失衡導(dǎo)致的疾病。Glu是腦內(nèi)主要的興奮性氨基酸類遞質(zhì),對大腦皮層、丘腦、海馬、小腦神經(jīng)元有很強的興奮作用,參與學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性、細(xì)胞凋亡、自主運動神經(jīng)活動。中樞神經(jīng)元之間的興奮性突觸傳遞主要由Glu受體所介導(dǎo),但過量的Glu對神經(jīng)元有顯著的損傷作用,具有神經(jīng)毒性作用等生理和病理功能[16-19]。GABA由Glu經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧而成,是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),對神經(jīng)元的活動及相互聯(lián)系抑制性調(diào)控,具有神經(jīng)保護作用,對哺乳動物具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮等功能。有研究表明,對貓側(cè)腦室注射GABA,發(fā)現(xiàn)GABA使貓的慢波睡眠H期和快動眼睡眠期延長,說明GABA參與睡眠-覺醒過程有關(guān)。嚙齒類動物(主要為大鼠和小鼠)和貓的睡眠主要有NREM和REM兩種,NREM睡眠占主要部分,NREM與REM保持一定的比例,比例失衡可能導(dǎo)致睡眠紊亂。Glu和GABA對于維持神經(jīng)細(xì)胞對興奮性和抑制性傳導(dǎo)的平衡起著關(guān)鍵作用,進而間接對睡眠產(chǎn)生影響[20],故Glu/GABA比值常用作研究和評價中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能興奮和抑制狀態(tài)的客觀指標(biāo),直接反映失眠的治療效果。

本實驗失眠模型大鼠腦組織中Glu和GABA含量均顯著增多,這與以往部分腹腔注射PCPA致失眠模型腦組織中GABA含量下降的報道似有不符[21-23],而與張舜波等[24]和Wei B等[25]對老年失眠大鼠及PCPA失眠大鼠腦中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的實驗結(jié)果相一致。盡管抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的含量顯著升高,但與正常組相比,模型組大鼠Glu/GABA比值仍是增大,提示腹腔注射PCPA可導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)Glu、GABA比例失衡,引起與睡眠相關(guān)的神經(jīng)元過度興奮,導(dǎo)致失眠。另有研究[26-29]報道,大鼠睡眠剝奪后,下丘腦GABA、GABAA受體表達(dá)較正常睡眠組顯著增多,恢復(fù)睡眠后,GABA表達(dá)及受體減少。發(fā)生這種變化的原因可能是由于睡眠剝奪過程中動物長時間維持清醒狀態(tài),神經(jīng)元持續(xù)興奮,反射性引起中樞抑制性氨基酸類遞質(zhì)的合成和釋放的增加,攝取的減少,以拮抗興奮性遞質(zhì)的神經(jīng)毒性作用對神經(jīng)元的損害[30],其相關(guān)機制尚不清楚。

電針是中醫(yī)學(xué)主要療法之一,應(yīng)用范圍十分廣泛,在睡眠障礙的臨床應(yīng)用中具有重要地位,是調(diào)節(jié)陰陽平衡的有效手段[31-33]。本實驗,不同波形電針治療后,電針組大鼠腦內(nèi)5-HT升高,Glu和GABA降低,Glu/GABA比值減小,各項指標(biāo)均有所改善,3組電針組中電針1組在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)方面優(yōu)于電針2組和電針3組,提示不同波形電針能夠下調(diào)PCPA致失眠模型大鼠下丘腦內(nèi)Glu和GABA兩種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量及比值,其機制可能是通過減輕腦內(nèi)興奮性神經(jīng)毒性,調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)平衡,實現(xiàn)增加睡眠,疏波低頻電針可能更好地降低神經(jīng)應(yīng)激功能,從而達(dá)到鎮(zhèn)靜安神及改善睡眠的治療作用,值得我們進一步研究。

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