電針對功能性消化不良大鼠下丘腦和海馬胃促生長素及受體mRNA表達(dá)的影響

周利,程艷萍

(湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430060)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是指具有上腹痛、上腹脹、早飽、噯氣、食欲不振、惡心、嘔吐等不適癥狀[1],經(jīng)檢查排除引起這些癥狀的器質(zhì)性疾病的一組臨床綜合征。其癥狀可持續(xù)或反復(fù)發(fā)作,病程一般規(guī)定為超過1個月或在12個月中累計超過12星期。隨著研究的深入,越來越多的專家學(xué)者認(rèn)識到腦腸軸(brain-gut axis,BGA)在FD的發(fā)病中起著重要的作用,認(rèn)為FD是BGA失衡的表現(xiàn)[2-3],而腦腸肽如胃促生長素(Ghrelin)的分泌在 BGA失衡機制中起到了重要作用。Ghrelin是胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞分泌的一種肽類活性物質(zhì),部分存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。它直接與Ghrelin受體(GHS-R)結(jié)合,釋放和傳遞神經(jīng)遞質(zhì),通過迷走神經(jīng)介導(dǎo),在中樞及外周水平上對胃排空和胃運動進行調(diào)節(jié)[4-5],能改善FD的癥狀,促進疾病的恢復(fù)。本實驗對FD大鼠進行電針干預(yù),觀察電針對 FD大鼠下丘腦和海馬 Ghrelin蛋白及GHS-R mRNA表達(dá)的影響,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康SPF級SD大鼠80只,雌雄各半,體重(180±10)g,由武漢大學(xué)動物實驗中心提供[許可證號為SCXK-(鄂)-2008-0004]。隨機分成正常對照組、模型對照組、藥物治療組和電針治療組,每組20只。每籠5只飼養(yǎng)于飼養(yǎng)溫度21℃～24℃、濕度40%～60%、符合國家二級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的動物飼養(yǎng)室中,自然光照、自由攝取水及普通鼠維持顆粒飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期后,檢查無懷孕或不良反應(yīng)及飲食飲水正常后開始造模。

1.2 主要儀器與試劑

TGL-20臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司);WD-9403C紫外儀(北京市六一儀器廠);DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠);Real time-PCR儀(德國Roche公司);CBV-1500A型多功能無菌工作臺(上海瑞仰凈化裝備公司)。

大鼠Ghrelin受體抗體試劑(美國Abcam,型號為Ab85104);Trizol試劑(上海華舜公司);Real-time PCR試劑盒(日本ToYoBo公司);西沙必利片(浙江京新藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字 H20020345,批號1210291)。

1.3 模型復(fù)制方法

采用郭海軍的夾尾造模法[6]復(fù)制 FD大鼠。將每組 20只大鼠同籠,用大號止血鉗前端包裹紗布,夾模型對照組、藥物治療組和電針治療組大鼠尾巴遠(yuǎn)端1/3處,以不破皮為度,令其暴怒、尋釁,與其他大鼠廝打,激怒全籠大鼠。每次連續(xù)不斷地刺激30 min,每隔3 h刺激1次。每日3次,連續(xù)刺激7 d。

1.4 實驗方法

造模成功后第 3天,電針治療組和藥物治療組開始治療。

1.4.1 藥物治療組

將西沙必利片用蒸餾水稀釋的成0.02 g/mL西沙比利溶液按2 mL/100 g(含每日西沙必利0.09 g/kg)的劑量灌胃治療。每日1次,連續(xù)6次為1個療程,休息1 d后進入第2個療程,共治療2個療程。

1.4.2 電針治療組

參照華興邦的《大鼠穴位圖譜的研制》[7]定位大鼠的足三里和太沖穴。給大鼠穿上自制鼠衣固定后,采用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.35 mm×25 mm毫針針刺足三里穴0.3～0.5寸(直刺)和太沖穴0.1～0.2寸(斜刺),快速捻轉(zhuǎn)至針下沉澀感后,接韓式穴位神經(jīng)刺激儀(型號為 HANS-LH202H),選用疏密波,頻率為 2 Hz,強度為 1 mA,留針 30 min。每日針刺 1次,連續(xù)治療6 d為1個療程,休息1 d后進入第2個療程,共治療2個療程。實驗過程中僅電針治療組9號大鼠在第5日電針過程中由于掙扎致鼠衣堵住鼻口窒息死亡。

治療 2個療程后禁食不禁水 24 h,次日禁水 2 h后將各組大鼠斷頭處死,迅速開顱取腦,在冰下迅速分離海馬和下丘腦,放入液氮速凍后存于-80 ℃冰箱待測。

1.5 檢測觀察指標(biāo)

1.5.1 Western blot檢測

取保存于-80 ℃的下丘腦、海馬組織各 1塊(約100 mg),裂解后離心取上清(即組織蛋白)。將所有蛋白樣本調(diào)至等濃度,上樣后進行SDS-PAGE穩(wěn)壓電泳。卸下膠在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡,順序鋪膜封緊后放入電轉(zhuǎn)槽中。隨后將電轉(zhuǎn)槽放入冰水混合物中,將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜。將膜取出,漂洗后浸沒分別與將Ghrelin抗體(1:1000,Abcam,ab85104)和HRP標(biāo)記的二抗封閉液中緩慢搖蕩,最后覆于ECL化學(xué)發(fā)光液,置暗盒內(nèi)與X膠片曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘;顯影沖洗晾干,標(biāo)定 Maker。記錄每條蛋白電泳帶的灰度值, 進行相對定量分析。

1.5.2Real-time PCR檢測

將大鼠下丘腦、海馬組織(約 100 mg)研磨,分別加入 Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇后離心,棄上清留管底的白色沉淀(即 mRNA)。加入乙醇洗滌、離心,加入去離子水溶解 RNA。 將提取的 mRNA 與紫外分光光度計下行 RNA 定量以及 D(260)和 D(280)測定,計算出含量和純度。經(jīng)過合成cDNA的合成、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和Real-time PCR反應(yīng)體系后,采用2﹣ΔΔCT法進行分析計算每一樣本GHS-R mRNA與β-actin mRNA表達(dá)量的積分光密度比值(GHS-R /β-actin)。因內(nèi)參照β-actin mRNA恒定表達(dá),故GHS-R/β-actin值的高低相對反映了GHS-R mRNA表達(dá)量的多少。重復(fù)3次獨立試驗,求得均值。詳見表1。

表1 Ghrelin受體GHS-R引物序列及PCR反應(yīng)條件

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行處理。全部數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。滿足正態(tài)性時,采用單因素方差分析,組間比較若方差齊時采用方差分析 LSD檢驗,方差不齊時用方差分析Tamhane’s T2檢驗;不滿足正態(tài)性時選擇秩和檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模評價

本實驗采用郭海軍的夾尾造模法制作FD大鼠。造模過程中,夾尾激怒全籠大鼠引發(fā)廝打,讓大鼠始終保持暴怒狀態(tài)。在造模第3天,可嗅到籠內(nèi)有穢臭,繼而進食減少、毛發(fā)枯黃,伴有緊張、焦慮。取材時各組大鼠臟器均未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性改變,提示造摸成功。藥物治療組與電針治療組納入指標(biāo)檢測的樣本量分別為 20只和19只。

2.2 各組大鼠下丘腦和海馬Ghrelin蛋白表達(dá)比較

由表2及圖1、2可見,模型對照組下丘腦和海馬Ghrelin蛋白表達(dá)與正常對照組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05)。藥物治療組和電針治療組下丘腦 Ghrelin蛋白表達(dá)與模型對照組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。藥物治療組海馬Ghrelin蛋白表達(dá)與正常對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。電針治療組海馬Ghrelin蛋白表達(dá)與模型對照組和藥物治療組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05)。

圖1 各組大鼠下丘腦灰度值比較

圖2 各組大鼠海馬灰度值比較

表2 各組大鼠下丘腦和海馬Ghrelin蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組大鼠下丘腦和海馬Ghrelin蛋白表達(dá)水平比較(±s)

注:與正常對照組比較 1)P＜0.01,2)P＜0.05;與模型對照組比較 3)P＜0.01,4)P＜0.05;與藥物治療組比較5)P＜0.05

組別 n 下丘腦 海馬正常對照組 20 0.27±0.12 0.34±0.32模型對照組 20 0.14±0.081) 0.17±0.042)藥物治療組 20 0.25±0.174) 0.17±0.112)電針治療組 19 0.22±0.064) 0.25±0.113)5)

2.3 各組大鼠下丘腦和海馬GHS-R mRNA表達(dá)比較

由表 3可見,模型對照組下丘腦和海馬GHS-R mRNA表達(dá)與正常對照組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。藥物治療組和電針治療組下丘腦和海馬GHS-R mRNA表達(dá)與模型對照組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。電針治療組海馬 GHS-R mRNA表達(dá)與藥物治療組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 各組大鼠下丘腦和海馬GHS-R mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表3 各組大鼠下丘腦和海馬GHS-R mRNA表達(dá)水平比較(±s)

注:與正常對照組比較 1)P＜0.01;與模型對照組比較 2)P＜0.01;與藥物治療組比較3)P＜0.01

組別 n 下丘腦 海馬正常對照組 20 1.64±0.05 1.56±0.05模型對照組 20 1.42±0.011) 1.52±0.041)藥物治療組 20 1.53±0.292) 1.57±0.012)電針治療組 19 1.59±0.072) 1.59±0.022)3)

3 討論

2006年羅馬委員會將FD的診斷標(biāo)準(zhǔn)歸納為羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)[8],即必須符合①餐后飽脹不適、②早飽、③上腹痛、④上腹燒灼感的1項或1項以上和沒有可以解釋癥狀的器質(zhì)性疾病(包括上消化道內(nèi)鏡下)的證據(jù);診斷前癥狀出現(xiàn)至少6個月;近3個月癥狀符合以上標(biāo)準(zhǔn)。由于不同的性別、年齡、種族、經(jīng)濟狀況及文化背景等差異,不同國家和地區(qū)FD的患病率不盡相同。FD的病因及發(fā)病機制現(xiàn)階段仍不明確,療效亦不佳,嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量,耗費大量的醫(yī)療資源。隨著國內(nèi)外學(xué)者對“生理-心理-社會模式”的重視,越來越多的學(xué)者堅信腦腸軸在FD的發(fā)病、治療過程中起著重要作用。腸道神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)協(xié)同完成腸道的神經(jīng)支配調(diào)節(jié),它們和腦腸肽共同參與腦和胃腸之間的調(diào)控,共同調(diào)節(jié)食欲、進食、消化,形成BGA[9-10]。當(dāng)這些腦腸肽如Ghrelin分泌異常時,就可導(dǎo)致FD的發(fā)生。

Ghre1in主要由胃體X/A樣細(xì)胞分泌[11],存在于下丘腦和海馬等其他人體組織中。其初始結(jié)構(gòu)、氨基酸序列與胃動素相似,與胃動素表現(xiàn)出許多相同的作用,如控制食欲、刺激生長激素的釋放、促進胃排空、增強胃動力,故又被稱為胃動素相關(guān)肽[12]。Ghrelin在人體中以非?；王；问酱嬖赱13],酰基化Ghrelin結(jié)合Ghrelin受體(GHS-R)活化信號傳導(dǎo)通路對胃腸功能、內(nèi)分泌、免疫等功能產(chǎn)生影響[14];去?；疓hrelin可能通過非GHS-R依賴的途徑產(chǎn)生部分影響。研究證明,Ghrelin在胃腸道分泌后通過血液循環(huán)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng),激活肌間神經(jīng)叢神經(jīng)細(xì)胞上的GHS-R,從而加強胃腸運動,促進胃排空,維持胃腸平滑肌良好狀態(tài)、促進食物消化和營養(yǎng)吸收[15-18],同時Ghrelin 還能刺激胃酸和胰酶分泌,協(xié)同促進消化過程[19]。

研究發(fā)現(xiàn),Ghrelin廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng).以下丘腦室旁核(PVN)Ghrelin的含量最高,機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時變化最大。因此,PVN是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的連接點,是消化功能傳入傳出信息的重要轉(zhuǎn)換站[20-21]。Carlini VP等[22]發(fā)現(xiàn),海馬CA1區(qū)Ghrelin可明顯增強大鼠胃運動幅度,增強海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元放電頻率,抑制胃竇平滑肌細(xì)胞鈣依賴性鉀通道的開放。齊玉霞等[23]電刺激海馬CA1區(qū)可以興奮PVN的胃擴張反應(yīng)敏感神經(jīng)元,提示海馬CA1區(qū)可通過PVN及其下位中樞的相互作用參與調(diào)節(jié)胃運動。Diano S等[24]發(fā)現(xiàn)在海馬 CAl興奮性觸突上也有 GHS-R的表達(dá),GHS-R可激活增加興奮性突觸傳遞[25]。形態(tài)學(xué)研究表明,海馬與下丘腦等中樞腦區(qū)有著豐富的纖維聯(lián)系,多以突觸形式與下丘腦核團發(fā)生雙向聯(lián)系,由海馬發(fā)出的纖維,經(jīng)穹窿到達(dá)下丘腦,再經(jīng)由腦干、延髓、自主神經(jīng)等逐級下傳,對胃運動進行調(diào)節(jié)。因此,海馬參與胃運動調(diào)節(jié)可能是通過海馬-下丘腦-延髓-迷走神經(jīng)-胃通路實現(xiàn)的,這些神經(jīng)核團通過對內(nèi)臟傳入傳出信號的整合處理共同作用,調(diào)控消化系統(tǒng)的相關(guān)功能[26]。

本實驗通過夾尾刺激復(fù)制FD大鼠模型。造模過程中大鼠出現(xiàn)活動減少、煩躁易怒、毛發(fā)枯澤、大便時干時稀、體重增加緩慢、食量下降等消化不良的癥候,且解剖大鼠沒有發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變,符合 FD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[27]。

目前,FD的臨床治療尚無特效藥物與方法,以對癥的個體化治療為主,但愈后復(fù)發(fā)率較高,且大多藥物有一定的副反應(yīng)。而針灸治療FD歷史悠久,是中國傳統(tǒng)文化的瑰寶。歷代中醫(yī)針灸文獻均有對針灸治療胃腸疾病的記載?，F(xiàn)代對電針治療FD的臨床報道較多,常小榮等[28]電針足三里穴后大鼠胃電活動明顯高于對照組。胃竇內(nèi)腦腸肽物P物質(zhì)、胃動素、胃泌素含量均不同程度高于對照組?？梢?針灸尤其是電針療法是治療FD的安全有效措施之一。

研究結(jié)果表明,PVN、延髓是針刺調(diào)整胃運動的重要中樞[29]。針刺信號上傳到各級神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中樞(PVN、海馬、延髓等),最后到達(dá)大腦皮層內(nèi)臟神經(jīng)投影區(qū),經(jīng)過中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其核團分析整合后再由自主神經(jīng)(迷走神經(jīng))傳至胃腸發(fā)揮效應(yīng)[26]。鑒于此,本實驗側(cè)重于檢測 FD大鼠下丘腦和海馬 Ghrelin、GHS-R mRNA的表達(dá),探討電針FD的治療效應(yīng)。通過藥物和電針對比研究,FD大鼠下丘腦、海馬Ghrelin水平及 GHS-R mRNA 表達(dá)均上調(diào)(P＜0.05),且電針治療組海馬Ghrelin水平及GHS-R mRNA 表達(dá)較藥物治療組升高(P＜0.05)。表明電針可促進功能性消化不良大鼠下丘腦和海馬Ghrelin的含量,激活改變下丘腦PVN神經(jīng)元的興奮性,并將信號傳導(dǎo)至與之有神經(jīng)纖維聯(lián)系的海馬突觸上,最后通過迷走神經(jīng)作用于外周胃腸道,完成對攝食和胃運動的調(diào)控。本實驗結(jié)果顯示,藥物和電針均可誘發(fā)下丘腦的中樞效應(yīng),且電針治療療效更佳。

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