反油酸和反異油酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

文曉東,劉本欣,鄧澤元,范亞葦,李 靜

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330057)

反油酸和反異油酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

文曉東,劉本欣,鄧澤元,范亞葦,李 靜*

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330057)

比較反油酸(9t18∶1)和反異油酸(11t18∶1)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。用不同濃度的反油酸(9t18∶1)和反異油酸(11t18∶1)作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),觀(guān)察其對(duì)細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、氧化酶活(SOD、MDA)、LDH滲出率、一氧化氮量和NOS活力的影響。結(jié)果表明9t18∶1和11t18∶1均能降低細(xì)胞存活率,在100 μmol/L時(shí),9t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活率的抑制作用顯著強(qiáng)于11t18∶1;兩種反式脂肪酸均導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)胞由正常的梭形變?yōu)閳A形,而且邊緣呈粗糙狀態(tài);9t18∶1和11t18∶1均能夠造成內(nèi)皮細(xì)胞LDH滲出率和胞內(nèi)MDA含量的顯著升高,但11t18∶1組明顯低于同濃度9t18∶1組;兩種反式脂肪酸均能夠降低HUVEC 細(xì)胞NO分泌量和NOS、SOD活力,且11t18∶1的降低作用低于同濃度9t18∶1組。此外,9t18∶1和11t18∶1均可提高ICAM、VCAM、IL-6 mRNA表達(dá)量,且前者顯著高于后者?？偟膩?lái)說(shuō),這兩種反式脂肪酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞都有一定致炎癥作用,但9t18∶1強(qiáng)于11t18∶1。

反油酸,反異油酸,內(nèi)皮細(xì)胞損傷

血管疾病在中國(guó)成為導(dǎo)致死亡的首要誘因,研究表明通過(guò)膳食調(diào)節(jié)特別是膳食脂肪調(diào)節(jié)可以降低血管疾病的發(fā)病率。流行病學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn),反式脂肪酸(Trans fatty acids,TFAs)的攝入與血管疾病的發(fā)病率呈正相關(guān)性,TFA能改變?nèi)梭w的血脂組成、干擾人體正常的脂質(zhì)代謝,并且TFA能夠刺激系統(tǒng)炎癥反應(yīng)從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡[1],TFA能增加內(nèi)皮功能障礙過(guò)程中的循環(huán)生物標(biāo)記物[2],同時(shí)降低動(dòng)脈擴(kuò)張依賴(lài)物一氧化氮的分泌[3],進(jìn)一步促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生。

反式脂肪酸是一類(lèi)含有一個(gè)或多個(gè)非共軛反式雙鍵的脂肪酸,主要分為工業(yè)反式脂肪酸(Industrial trans fatty acids,I-TFA,主要的反式異構(gòu)體是9t18∶1)和反芻動(dòng)物反式脂肪酸(Ruminant trans fatty acids,R-TFA,主要的反式異構(gòu)體是11t18∶1)[4]。流行病學(xué)和臨床研究表明R-TFA和I-TFA對(duì)健康的影響存在差異,R-TFA與血管疾病呈正相關(guān)或者無(wú)相關(guān)性,而I-TFA則與血管疾病呈負(fù)相關(guān)[5-7]。但是它們對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能影響的差異研究甚少。因此,本課題擬通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能研究了解R-TFA(11t18∶1)和I-TFA(9t18∶1)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的差異,通過(guò)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞存活率,形態(tài)變化,乳酸脫氫酶(LDH)溶出率,一氧化氮合酶(NOS)活力,一氧化氮(NO)分泌量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活,丙二醛(MDA)含量,細(xì)胞炎癥因子ICAM-1、VCAM-1、IL-6的變化,探討兩種TFA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能影響的差異,完善對(duì)TFA安全性的認(rèn)識(shí),對(duì)調(diào)整我國(guó)居民膳食結(jié)構(gòu),提高健康水平具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 南昌大學(xué)高等研究院;反油酸、反異油酸標(biāo)品 美國(guó)Sigma公司;新生牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM完全培養(yǎng)基 美國(guó)Gbico 公司;谷氨酰胺、青霉素鏈霉素混合液、胰蛋白酶、噻唑蘭(MTT) 北京Solarbio公司;磷酸緩沖鹽(PBS)粉劑(pH7.2～7.4) 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;鬼筆環(huán)肽-FITC染液、DAPI染液、免疫染色洗滌液、免疫染色通透液、抗熒光猝滅封片液、免疫染色固定液 碧云天生物技術(shù)研究所;一氧化氮(NO)測(cè)定試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;熒光定量PCR試劑盒 Takara公司;RNAiso Takara公司。

CPST 200型CO2恒濕恒溫培養(yǎng)箱 長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司;BHC-1300IIA/B3型生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;37XC(XDS-1A)倒置顯微鏡 上海蔡康光學(xué)儀器公司;BD-86L低溫冰箱 香港力康公司;Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 力康發(fā)展有限公司;Multiskan MK3型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾(上海儀器有限公司;激光共聚焦顯微鏡 卡爾蔡司公司;DSX-280 B不銹鋼手提式滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);JY-86-2-50L-80 ℃冰箱 香港力康公司;溫度梯度PCR儀 芬蘭Thermo公司;7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HUVEC的培養(yǎng) 細(xì)胞鋪滿(mǎn)后,棄去原來(lái)培養(yǎng)液,用PBS緩沖液5 mL分兩次洗滌細(xì)胞,加入1 mL胰蛋白酶(含EDTA)消化液于培養(yǎng)箱中消化1 min,取出后加入5 mL10% FBS培養(yǎng)液,用吸管將細(xì)胞輕輕吹下制成單細(xì)胞懸液,分裝于新的培養(yǎng)瓶中,置于5% CO2,37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液,隔2 d傳一代。

1.2.2 MTT法測(cè)定9t18∶1和11t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響 兩種反式脂肪酸分別用0.5 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉在60 ℃水浴促溶,用PBS緩沖液稀釋至1000 μmol/L,過(guò)膜-20 ℃保存。取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,胰蛋白酶消化后以 1×105/mL 接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁后吸去培養(yǎng)液,每組加含5%血清的 DMEM培養(yǎng)液 180 μL和各濃度9t18∶1和11t18∶1 20 μL,9t18∶1和11t18∶1最終濃度分別為 5、25、50、100 μmol/L;設(shè)置陰性對(duì)照組和PBS溶劑對(duì)照組每組5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液,每孔用150 μL PBS清洗換180 μL新培養(yǎng)液并加 20 μL MTT。37 ℃避光孵育4 h,小心吸棄上清液,每孔加 150 μL 二甲基亞砜(DMSO),微量振蕩器上振蕩10 min使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解,用酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定OD值。計(jì)算TFA對(duì)細(xì)胞活力的影響。

細(xì)胞存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD對(duì)照組)/OD對(duì)照組×100

1.2.3 鬼筆環(huán)肽-FITC和DAPI雙染觀(guān)察9t18∶1和11t18∶1作用細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化 經(jīng)100 μmol/L9t18∶1和11t18∶1作用24 h后,內(nèi)皮細(xì)胞消化稀釋成1×105/mL單細(xì)胞懸液,取200 μL平鋪至蓋玻片上,置于六孔板中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,至細(xì)胞完全貼壁伸展。鬼筆環(huán)肽-FITC染液按1∶200比例稀釋后4 ℃避光保存。用PBS洗一次六孔板中細(xì)胞,4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞10 min,PBS洗細(xì)胞30 s,再用細(xì)胞通透液室溫作用5 min。PBS洗一次細(xì)胞,每孔加200 μL鬼筆環(huán)肽-FITC,室溫避光作用30 min。PBS洗細(xì)胞3次,每孔加200 μL DAPI染色1 min。PBS沖洗蓋玻片2次,室溫避光晾干,反扣至滴有一滴抗熒光猝滅封片液的載玻片上,指甲油固封四角。置于4 ℃,避光,激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察結(jié)果。

1.2.4 細(xì)胞NO分泌量和NOS活力的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化吹散制成單細(xì)胞懸液,稀釋至細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種于6孔板,每孔2 mL,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞完全貼壁后,分別加入反油酸和反異油酸(終濃度分別為25、50、100 μmol/L)并作用24 h,取上層培養(yǎng)液采用比色法測(cè)定NO 分泌量,具體操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。PBS清洗2次,用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,離心收集細(xì)胞,每孔加入細(xì)胞裂解液300 μL裂解30 min,離心取上清,采用比色法測(cè)定總的NOS活性。具體操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 細(xì)胞LDH滲出率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化吹散制成單細(xì)胞懸液,稀釋至細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種于6 孔板,每孔2 mL,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞完全貼壁后,分別加入反油酸和反異油酸,使其終濃度為25、50、100 μmol/L并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,取上清液測(cè)定細(xì)胞外LDH含量。每孔PBS清洗2次,用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,離心收集細(xì)胞,每孔加入細(xì)胞裂解液300 μL裂解30 min,離心取上清,采用比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)LDH含量,具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

LDH滲出率(%)=細(xì)胞外LDH含量/(細(xì)胞內(nèi)LDH含量+細(xì)胞外LDH含量)×100

1.2.6 細(xì)胞SOD酶、MDA含量的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化吹散制成單細(xì)胞懸液,稀釋至細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種于6 孔板,每孔2 mL,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞完全貼壁后,分別加入反油酸和反異油酸,使其終濃度為25、50、100 μmol/L作用24 h,移除培養(yǎng)液,每孔用PBS 清洗 2 次,用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,離心收集細(xì)胞,每孔加入細(xì)胞裂解液300 μL 4 ℃裂解30 min,離心取上清,按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定SOD活力和MDA含量。

表1 反轉(zhuǎn)錄cDNA反應(yīng)體系

表2 引物序列

表3 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.2.7 細(xì)胞炎癥因子的測(cè)定 總RNA的提取:細(xì)胞接種于直徑為5 cm平皿,待貼壁后分別加入反油酸和反異油酸(終濃度為25、50、100 μmol/L)并作用24 h。處理結(jié)束后,用冷的PBS清一次,加入1 mL RNAiso裂解細(xì)胞5 min,吹打后移入1.5 mL離心管(DEPC水處理)中,再加入200 μL氯仿,劇烈震蕩15 s,室溫放置5 min;12000 r/min 4 ℃離心15 min,此時(shí)管內(nèi)液體分三層,上層為RNA溶液,中層為DNA白色絮狀沉淀,下層為蛋白質(zhì)溶液,輕輕吸取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入500 μL異丙醇混勻,靜止30 min,12000 r/min 4 ℃離心10 min,出現(xiàn)白色RNA沉淀。吸取上清液,加入1 mL 75%乙醇(DEPC水配置),8000 r/min離心5 min,除去上清液,超凈臺(tái)內(nèi)室溫晾干,加入50 μL DEPC水溶解后放入-80 ℃冰箱保存。紫外分光光度法檢測(cè)RNA純度,樣品在260 nm和280 nm出吸光度比值要求在1.8～2.0之間。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,p<0.05 表示有顯著性差異。

鉤藤根腐病可用3億CFU/克哈茨木霉菌20～50倍，或10億個(gè)/克枯草芽孢桿菌800～1 000倍，或1%申嗪霉素懸浮劑800～1 000倍，或8%井岡霉素A水劑100～125倍灌根或噴淋。

2 結(jié)果與討論

2.1 9t18∶1和11t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活力影響對(duì)比

如圖1所示,與培養(yǎng)液對(duì)照組和溶劑對(duì)照組(PBS)相比,11t18∶1組和9t18∶1組對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。其中5 μmol/L和25 μmol/L的兩種TFA對(duì)細(xì)胞活力的影響相對(duì)較小且兩種TFA之間沒(méi)有顯著性差異(p<0.05)。兩種TFA在50～100 μmol/L劑量范圍內(nèi)對(duì)HUVEC增殖具有明顯的抑制作用。100 μmol/L 9t18∶1在100 μmol/L的對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的抑制作用顯著強(qiáng)于100 μmol/L 11t18∶1(p<0.05)。

圖1 9t18∶1和11t18∶1對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on survival rates of HUVEC cells注：標(biāo)注不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)，圖3～圖6同。

2.2 9t18∶1和11t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)影響對(duì)比

從上述MTT實(shí)驗(yàn)中得出,100 μmol/L的9t18∶1和11t18∶1作用內(nèi)皮細(xì)胞時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞存活率有明顯的下降,且兩者之間具有顯著性差異,因此選用100 μmol/L濃度來(lái)觀(guān)察兩種反式脂肪酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響。

圖2 9t18∶1和11t18∶1對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.2 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on HUVEC morphology

如圖2所示,正常的內(nèi)皮細(xì)胞呈梭狀,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,細(xì)胞核呈橢圓形且輪廓清晰。100 μmol/L 9t18∶1和11t18∶1作用24 h后細(xì)胞形態(tài)均有明顯的變化,細(xì)胞由正常的梭形變?yōu)閳A形,而且邊緣呈粗糙狀態(tài)。細(xì)胞質(zhì)分布散亂,細(xì)胞核破損嚴(yán)重。該結(jié)果提示兩種反式脂肪酸作用后內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重變形,細(xì)胞功能損傷明顯。

如圖3所示,9t18∶1和11t18∶1作用細(xì)胞后,LDH有滲出現(xiàn)象且LDH滲出率與濃度呈正相關(guān)關(guān)系。9t18∶1在100 μmol/LLDH滲出率最高,相比于25、50 μmol/L具有顯著性差異。11t18∶1 100 μmol/L和25 μmol/L組間具有顯著性差異。相同濃度9t18∶1和11t18∶1組間均有顯著性差異,11t18∶1作用細(xì)胞后的LDH滲出率明顯低于同濃度9t18∶1。

圖3 9t18∶1和11t18∶1對(duì)HUVEC LDH滲出率的影響Fig.3 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on LDH leakage

2.4 9t18∶1和11t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NOS活力、NO分泌量的影響

由圖4 可知,隨著反式脂肪酸濃度的升高,細(xì)胞NOS活力降低且與濃度呈正相關(guān)關(guān)系。11t18∶1各濃度組間沒(méi)有明顯差異,而9t18∶1在100 μmol/L比25 μmol/L的NOS活力低,且有顯著性差異。9t18∶1組NOS酶活性較11t18∶1組低?？梢?jiàn)9t18∶1對(duì)NOS抑制作用較11t18∶1強(qiáng)。與對(duì)照組相比,9t18∶1和11t18∶1作用后內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌量均明顯下降(p<0.05)。隨著兩種反式脂肪酸濃度的升高,內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌量下降。相同濃度的9t18∶1組NO分泌量比11t18∶1組低。

圖4 9t18∶1和11t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NOS活力和NO分泌量的影響Fig.4 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on NOS activity and NO secretion

2.5 9t18∶1和11t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞SOD酶活、MDA含量的影響

超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)都是評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)氧化水平的重要指標(biāo)。由圖5可知9t18∶1和11t18∶1作用后,細(xì)胞SOD活力有顯著下降的趨勢(shì),在50、100 μmol/L時(shí)9t18∶1組SOD明顯低于11t18∶1組且有顯著性差異。9t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷強(qiáng)于11t18∶1。9t18∶1和11t18∶1作用后,細(xì)胞MDA含量均有上升,但9t18∶1組比11t18∶1組上升更為明顯(50、100 μmol/L)?？梢?jiàn)9t18∶1和11t18∶1均會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平失衡,且9t18∶1比11t18∶1更為明顯。

圖5 9t18∶1和11t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞SOD酶活和MDA含量的影響Fig.5 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on SOD activity and MDA contents

2.6 9t18∶1和11t18∶1對(duì)ICAM-1、VCAM-1、IL-6(白細(xì)胞介素6)mRNA表達(dá)量的影響

ICAM-1、VCAM-1和IL-6都是評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo),其mRNA表達(dá)量的變化反映了細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的激烈程度。由圖6可以看出,9t18∶1和11t18∶1作用內(nèi)皮細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)ICAM-1 VCAM-1 IL-6mRNA表達(dá)量都有明顯提高,特別是100 μmol/L時(shí)。同濃度組間對(duì)比9t18∶1高于11t18∶1,且在50、100 μmol/L時(shí)有顯著性差異。

圖6 9t18∶1和11t18∶1對(duì)HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、IL-6mRNA表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on the mRNA expression levels of ICAM 1,VCAM 1,IL-6 mRNA in HUVEC cells

3 結(jié)論與討論

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一類(lèi)調(diào)節(jié)生物體循環(huán)系統(tǒng)功能的非常重要的氣體信號(hào)分子,在正常生理狀態(tài)下,內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)可產(chǎn)生低濃度的NO,發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞源性舒張因子作用而舒張血管。NO分泌量的變化是檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞是否受損的一個(gè)重要指標(biāo)。NO不僅能調(diào)節(jié)血管張力,還被認(rèn)為是一種抗炎分子[8],其抗炎作用主要是通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)活性,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。Kitamot 等[9]運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)以大鼠為載體證實(shí)在內(nèi)皮細(xì)胞處NO可通過(guò)NF-κB 途徑抑制單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)的表達(dá),從而減少單核細(xì)胞的遷移,發(fā)揮抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。目前公認(rèn)的NOS被分為兩個(gè)亞型,一種是結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS),包括eNOS和nNOS,另一種是誘導(dǎo)型NOS(iNOS)[10]。有研究表明隨著eNOS水平的降低,會(huì)導(dǎo)致NO的分泌量相應(yīng)減少,最終造成動(dòng)脈血管的舒張功能受損和炎癥的發(fā)生。邱斌[10]等報(bào)道不同飽和度反式脂肪酸可抑制eNOS活性減少NO的分泌?？梢?jiàn),TFA引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是通過(guò)NOS-NO系統(tǒng)誘導(dǎo)。9t18∶1和11t18∶1作用后細(xì)胞內(nèi)NOs活力呈現(xiàn)出下降,導(dǎo)致NO分泌量也相應(yīng)的減少。而9t18∶1抑制NOS強(qiáng)度高于11t18∶1,NO分泌量也低于11t18∶1,所以9t18∶1對(duì)NOS-NO系統(tǒng)的影響要強(qiáng)于11t18∶1。

LDH存在于人體所有細(xì)胞中,是人體能量代謝中十分重要的酶。LDH的變化會(huì)直接或間接影響機(jī)體的能量代謝,當(dāng)機(jī)體各組織器官發(fā)生病變時(shí),其組織器官本身的LDH含量 要發(fā)生改變從而引起血液中LDH的改變。LDH滲出率是細(xì)胞氧化應(yīng)激的指示因子之一,細(xì)胞LDH 滲出率提高表明細(xì)胞功能受損或者死亡,細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化,導(dǎo)致細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能改變[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)9t18∶1和11t18∶1誘導(dǎo)細(xì)胞LDH 滲出率增加,且9t18∶1比11t18∶1作用更強(qiáng)。所以9t18∶1引起的LDH滲出導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙比11t18∶1要強(qiáng)。

SOD和MDA都是評(píng)估體內(nèi)氧化程度的重要指標(biāo)。SOD是一種蛋白酶,在體內(nèi)能夠清除氧自由基,保護(hù)生物體免受氧自由基的攻擊,其活力的高低反應(yīng)了機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的能力強(qiáng)弱。MDA作為生物膜中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,通過(guò)MDA 含量可以反映細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱。9t18∶1和11t18∶1作用后,SOD酶活明顯下降,而MDA含量上升,說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡遭到破壞,氧化應(yīng)激水平上升。而總體看來(lái)9t18∶1作用后SOD下降及MDA上升的量都要高于11t18∶1,可見(jiàn)9t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成的氧化損傷明顯高于11t18∶1。

炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的起始階段。當(dāng)系統(tǒng)炎癥出現(xiàn)時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向感染部位和損傷的組織聚集,同時(shí)并釋放相關(guān)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,再與白細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)交流。TFA作為一種外源性刺激物可引起體內(nèi)一系列炎性反應(yīng)。9t18∶1和11t18∶1刺激產(chǎn)生的細(xì)胞間粘附因子(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)、白細(xì)胞介素(IL-6)等細(xì)胞炎癥因子不僅會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞之間的相互作用,還會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞的活力,誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性表型的內(nèi)皮細(xì)胞[12]。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果總體顯示出相同濃度的11t18∶1對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞造成的損傷明顯低于9t18∶1。有研究指出11t18∶1在人類(lèi)和反芻動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)過(guò)乙酰輔酶A脫飽和酶1催化可生成9c11t-CLA,9c11t-CLA有一定的抗炎作用[13-15],它能顯著降低ICAM、VCAM、TNF-а、IL-1、IL-6的mRNA表達(dá)水平,抑制NF-кB通路的激活[16-18]。是否由于9c11tCLA的抗炎作用減少了11t18∶1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷呢？這有待進(jìn)一步研究。

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Exploration of elaidic acid and trans-vaccenic acid on inflammation of human umbilical vein endothelial cells

WEN Xiao-dong,LIU Ben-xin,DENG Ze-yuan,FAN Ya-wei,LI Jing*

(Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The aim of the present study was to compare the effects of the elaidic acid(9t18∶1)and the trans-Vaccenic acid(11t18∶1)on endothelial cells injury. After adding different concentrations of 9t18∶1 11t18∶1,the cell viability,cell morphology,oxidase activity(SOD and MDA),LDH leakage rates,effects of NO content and NOs activity were obserred. The results showed that 9t18∶1 and 11t18∶1 reduced the cell survival rate,and the inhibitory effect of 9t18∶1 on proliferation of endothelial cells were stronger than 11t18∶1 in 100 μ mol/L.Both of trans fatty acids lead to changes in endothelial cell morphology,cells from normal spindle to round and edge became rough. 9t18∶1 and 11t18∶1 increased LDH leakage rate and MDA in endothelial cell,but the 11t18∶1-treated group was reduced than 9t18∶1 in the same concentration. NO secretion,NOS and SOD activity was reduced by 9t18∶1 and 11t18∶1,but 11t18∶1 group was significantly higher in the same concentration of 9t18∶1. Both of 9t18∶1 and 11t18∶1 could increase the mRNA expression levels of ICAM,VCAM,and IL-6,the former was obviously higher than the latter. In summary,the HUVEC cells injury induced by 11t18∶1 was significantly weaker than that of 9t18∶1.

elaidic acid;trans-vaccenic acid;Endothelial cells injury

2014-12-24

文曉東(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食品科學(xué),E-mail:goodwenxiaodong@163.com。

*通訊作者:李靜(1982-),女,博士,副教授,研究方向:營(yíng)養(yǎng)學(xué),E-mail:lijing66@ncu.edu.cn。

教育部新教師基金(20113601120004);江西省科技廳自然基金(20114BAB214016);國(guó)家自然基金(31401485)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)23-0352-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.065