桿菌肽高產菌株的誘變選育

謝 瑞,李 力,張明亮,黃建忠

(福建師范大學 工業(yè)微生物發(fā)酵技術國家地方聯合工程研究中心工業(yè)微生物教育部工程研究中心 生命科學學院,福建福州 350108)

桿菌肽高產菌株的誘變選育

謝 瑞,李 力,張明亮,黃建忠*

(福建師范大學 工業(yè)微生物發(fā)酵技術國家地方聯合工程研究中心工業(yè)微生物教育部工程研究中心 生命科學學院,福建福州 350108)

為了選擇有效的方法選育出高產桿菌肽的菌種。利用地衣芽孢桿菌FUN-BL為出發(fā)菌株,依次進行紫外線誘變和硫酸二乙酯誘變,再通過平板活性篩選法作為初篩和HPLC作為復篩,篩選出效價較高的菌株。出發(fā)菌株F0經過紫外線誘變(15W,照射距離30cm,照射時間120s)后,篩選得到高產菌株F167,效價提高了11.76%。菌株F167經過硫酸二乙酯誘變(處理濃度為2%,處理時間為90min)后,篩選得到高產菌株F2141效價提高了32.19%。將高產菌株F2141進行連續(xù)5代遺傳穩(wěn)定性實驗,效價依次是1003.23、989.34、976.35、960.32、949.72U/mL。通過紫外線誘變和硫酸二乙酯誘變能夠選育出具有遺傳穩(wěn)定性的高產桿菌肽的菌株。

地衣芽孢桿菌,桿菌肽,選育,誘變,HPLC

桿菌肽是一種由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslichnifarimis)產生的抗菌多肽,它能夠最有效的抑制革蘭氏陽性菌,卻不針對生產菌株本身。由于該物質是由桿菌產生的一種多肽,因此,中文譯名為“桿菌肽”[1]。其抗菌譜與青霉素基本相似,能夠有效抑制多種革蘭氏陽性菌以及部分革蘭氏陰性菌,如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、溶血性鏈球菌(Streptococcus),微型球菌(MicrococcusCohn)、藤黃八疊菌(Micrococcusluteus)、放線菌(Actinobacteria)等[2-4]。同時桿菌肽還可用于飼料添加劑[5],在國內外都被作為一種理想抗生素廣泛應用于飼料中。

桿菌肽在醫(yī)藥、水產養(yǎng)殖業(yè)以及畜禽業(yè)有非常廣闊的應用前景。例如,Lowrymiller研究桿菌肽作為新藥應用于化膿性感染的皮膚[6]。桿菌肽鋅在水產動物中也起到了良好的作用[7]。另外,桿菌肽與其他抗生素之間無交叉耐藥性,與青霉素、鏈霉素、新霉素、金霉素和黏菌素等還有協同抗菌作用。這使得桿菌肽成為一種應用廣泛、安全的畜禽專用抗生素[8]。在國際上也有相當多關于桿菌肽生產、提純、成分鑒定以及生物合成機制等方面的研究和報道。但是桿菌肽的來源較少,且工業(yè)生產還不能滿足市場的需求。因此,提高桿菌肽的產量非常具有理論和應用價值。本實驗以地衣芽孢桿菌FUN-BL為出發(fā)菌株,依次采用物理誘變(紫外線,UV)和化學誘變(硫酸二乙酯,DES)的方法對出發(fā)菌株進行誘變選育。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 產桿菌肽的地衣芽孢桿菌FUN-BL,藤黃微球菌,福建師范大學工業(yè)微生物教育部工程研究中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏 20.0,NaCl 5.0,瓊脂 20.0,pH7.5,121℃滅菌20min;種子培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏 20.0,NaCl 5.0,pH7.5,121℃滅菌20min;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):豆粕粉 100.0,玉米淀粉45.0,花生餅粉5.0,輕質碳酸鈣6.0,硫酸銨1.0,pH7.5,121℃滅菌20min;LB培養(yǎng)基(g/L):胰化蛋白凍10.0,酵母提取物5.0,NaCl 1.0,固體時,加入瓊脂15.0,121℃滅菌20min。

1.1.3 試劑與儀器 酵母浸膏、瓊脂、酵母提取粉 分析級,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;氯化鈉、硫酸銨 分析級,西隴化工股份有限公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 分析級,國藥集團化學試劑有限公司;胰化蛋白胨、桿菌肽鋅標準品 分析級,上海生工生物工程有限公司;硫酸二乙酯 分析級,阿拉丁試劑(上海)有限公司;豆粕粉、玉米淀粉、花生餅粉、輕質碳酸鈣 工業(yè)級,福建省麥丹生物集團有限公司;甲醇、乙腈 色譜級,國藥集團化學試劑有限公司。

恒溫培養(yǎng)振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺 上海智誠分析儀器有限公司;自動壓力滅菌器 致微(廈門)儀器有限公司;電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;PH計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;紫外分光光度計 Amersham Biosciences;臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司;多功能臺式高速離心機 美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 從-80℃冰箱中取出保存的菌種接種到新鮮的斜面培養(yǎng)基上,37℃,24h后,取斜面上的菌種一環(huán),接種于種子培養(yǎng)基中(裝液量為40mL/250mL三角瓶),在37℃,230r/min的轉速振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 菌體生長曲線的確定 將以上種液過夜培養(yǎng)后,再以2%種液的接種量分別轉入新鮮的液體種子培養(yǎng)基,37℃,230r/min培養(yǎng)。每隔2h,取一瓶種液測定吸光度,以未接種的液體種子培養(yǎng)基作為空白對照,繪制菌體的生長曲線。

1.2.3.1 紫外線(UV)誘變 收集對數期的菌液,6000r/min 4℃離心,棄上清,用生理鹽水洗滌3次,再適當稀釋,制成108CFU/mL的菌懸液。吸取5mL的菌懸液于7個滅過菌的6cm平皿中,同時放入無菌的回形針。依次將平皿按照時間序列(30、60、90、120、150、180s)置于磁力攪拌器上,距離紫外燈(15W)30cm進行照射。照射結束后,在紅燈下稀釋適當的倍數,取0.2mL涂板。避光,37℃,倒置培養(yǎng)24h。

對平板上的菌落進行計數并且計算致死率,以未經紫外照射的菌液為空白對照。挑選致死率在80%左右的單菌落于發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃,230r/min,3d。將發(fā)酵液12000r/min,4℃離心,收集上清,進行平板活性篩選,挑選水解圈較大的菌株進行HPLC復篩。

1.2.3.2 硫酸二乙酯(DES)誘變 將經UV照射后的高產菌株培養(yǎng)至對數生長期,制成108CFU/mL懸浮液。取菌懸液和配制好的DES于同一個EP管中,使得DES的處理濃度為2%。并依次在37℃,60r/min振蕩15、30、45、60、75、90、105、120min。結束后,分別在1mL的處理液中加入0.5mL,25%的Na2S2O3溶液,終止反應。將處理液稀釋適當的倍數,取0.2mL進行涂板,24h,37℃,倒置培養(yǎng)。將未經DES處理的菌液作為空白對照,對平板進行菌落計數和致死率的計算,接著進行初篩和HPLC復篩。

1.2.3.3 篩選方法 初篩-平板活性篩選法:按照10%的接種量接入活化后的藤黃微球菌冷卻至于45℃左右的LB固體培養(yǎng)基,混勻,倒平板并放入無菌的牛津杯。吸取20μL上清液于牛津杯中,37℃培養(yǎng)24h,測定抑菌圈的直徑。

復篩-HPLC法:流動相A:pH為6.0的磷酸鹽緩沖液(27.2g/L的磷酸二氫鉀溶液調節(jié)34.8g/L的磷酸氫二鉀溶液的pH至6.0,再將此緩沖液1∶3與純水混合均勻)，流動相B:520mL甲醇與40mL乙腈混合均勻。

色譜條件:A相∶B相=35∶65,波長254nm,柱子C185μm 4.6×250mm,進樣量20μL,流速1.0mL/min,柱溫。

標準曲線的繪制:將標準桿菌肽溶液分別稀釋為25、50、100、150、200、250、300、350U/mL,用0.22μm的有機微孔濾膜進行過濾除菌后,進行HPLC測定,并繪制標準曲線。

1.2.3.4 突變株遺傳穩(wěn)定性實驗 將復篩后效價較高的突變株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)進行5次傳代培養(yǎng),并且將每一代都接入發(fā)酵培養(yǎng)基,37℃,230r/min,72h。離心發(fā)酵液,取上清液進行HPLC測定。確定突變株是否具有遺傳穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 出發(fā)菌株的生長曲線

由生長曲線圖可以看出,地衣芽孢桿菌FUN-BL在培養(yǎng)到第16h,開始進入對數生長期,當菌株培養(yǎng)到26h時,結束了對數生長期,同時進入了生長穩(wěn)定期。在實際的育種過程中,一般誘變的濃度為108CFU/mL,且采用生長旺盛的對數生長期的菌體。因為,此時的細胞不但菌濃合適,生理狀態(tài)同步,而且此時的絕大多數細胞對理化因素敏感,有利于誘變的作用[9]。結合之前的分析,選擇22～24h的細胞供誘變使用。

2.2 紫外誘變的篩選結果

2.2.1 照射時間與死亡率的關系 對地衣芽孢桿菌FUN-BL進行紫外誘變得到紫外致死曲線如圖2所示。

圖1 FUN-BL菌株的生長曲線Fig.1 The growth curve of strain FUN-BL

圖2 紫外線照射時間與菌株致死率的關系曲線Fig.2 The relationship curve between strains death rate and UV radiation times

表1 菌株F0誘變突變株初篩抑菌圈直徑Table 1 The inhibition zoom of mutants from strains F0

由圖2可知,菌株的致死率隨著照射時間的增加而增加。當照射時間為120s時,致死率達到79.98%,當照射時間為180s時,致死率已達到93.32%。由于正突變率較多出現在偏低的劑量中,而負突變率則較多地出現在偏高的劑量中,所以劑量太低起不到誘變作用,而劑量太高不易產生正突變[10]。因此,本次紫外線誘變選取照射時間為120s。

2.2.2 初篩結果 從處理時間為120s的平板中挑選99個單菌落到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體培養(yǎng),37℃,230r/min,72h。將發(fā)酵液離心,12000r/min,4℃,10min,取上清液進行抑菌實驗。各菌株的抑菌直徑如表1所示,通過與出發(fā)菌株FUN-BL(F0)進行對比,分別挑選抑菌圈直徑較大的菌株進行進一步的HPLC復篩。挑選的菌株號為4、7、15、23、30、44、61、67、69、76、80、81、89、91、98。

2.2.3 復篩結果 進行HPLC測定以后,可以得到桿菌肽標準品色譜圖(圖3)和發(fā)酵液色譜圖(圖4)。由兩張圖可以看出,標準品和粗提液的各個組分吸收峰的出峰時間基本一致,因此可以利用該色譜條件進行其余樣品的HPLC測定。

圖3 桿菌肽標準品色譜圖Fig.3 The HPLC Chromatogram of the standard of bacitracin

圖4 桿菌肽發(fā)酵液色譜圖Fig.4 The HPLC Chromatogram of the fermentation broth of bacitracin

通過把桿菌肽標準品依次梯度稀釋,再進行HPLC測定,可以發(fā)現色譜圖中各組分吸收峰的峰面積和與桿菌肽標準品成線性關系。將所有的稀釋度測定后繪制桿菌肽的標準曲線,得到標準曲線的相關系數為R2=0.9955(圖5)。此標準曲線可以用于對樣品發(fā)酵液進行定量測定。

圖5 桿菌肽鋅標準曲線Fig.5 Standard curve of zinc bacitracin

根據HPLC復篩的結果(表2),可知F167(853.34U/mL)發(fā)酵產物的活性較高,較出發(fā)菌株F0(763.55U/mL)提高了11.76%。所以,選擇該株菌作為下一步硫酸二乙酯誘變的出發(fā)菌株。

表2 F0誘變突變株抑菌圈直徑Table 2 The inhibition zoom of mutants from strains F0

2.3 硫酸二乙酯(DES)誘變篩選結果

2.3.1 處理時間與死亡率的關系 對地衣芽孢桿菌FUN-BL進行硫酸二乙酯誘變,在處理濃度為2%的情況下,得到DES的致死曲線如圖6。

圖6 DES誘變時間與致死率的關系曲線Fig.6 The relationship between strains death rate and DES induced mutation times

由圖6可知,控制DES的處理濃度為2%,當處理時間為90min時,對菌株的致死率達到了80%左右,考慮到正突變率較多出現在偏低的劑量中,本實驗選擇DES的處理時間為90min。

2.3.2 初篩結果 從處理濃度為2%,處理時間為90min的平板上分別挑選近180個單菌落到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵,條件為37℃,230r/min,72h。將發(fā)酵液離心,12000r/min,4℃,10min,取上清液進行抑菌實驗。各菌株的抑菌直徑如表3所示,通過與菌株F167進行對比,分別挑選抑菌直徑較大菌株進行進一步的HPLC復篩。挑選的菌株號為10、25、28、41、47、49、52、72、77、78、88、94、100、111、120、133、141、156、170、177。

2.3.3 復篩結果 以上是復篩效價較出發(fā)菌株F0提高達20%以上的菌株。根據HPLC復篩的結果,可知F2141(1009.33U/mL)發(fā)酵產物的活性較高,較紫外誘變后的菌株F167(853.35U/mL)提高了18.28%,較出發(fā)菌株F0(763.55U/mL)則提高了32.19%。

表4 F1誘變突變株抑菌圈直徑Table 4 The inhibition zoom of mutants from strains F1

2.4 遺傳穩(wěn)定性

將復篩后效價較高的突變株F2141在斜面培養(yǎng)基上進行五次傳代培養(yǎng)。并且將每次傳代的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。37℃,230r/min,72h。其桿菌肽的效價如表5所示。

表3 菌株F167誘變突變株初篩抑菌圈直徑Table 3 The inhibition zoom of mutants from strains F167

表5 菌株F2141的傳代穩(wěn)定性Table 5 Study on the stability of F2141

由表5可以看出,突變株F2141具有良好的遺傳穩(wěn)定性,但經過5次連續(xù)的傳代培養(yǎng),其效價呈現了下降趨勢,可能是細胞在繁殖的過程中發(fā)生自發(fā)突變造成的。

3 討論

地衣芽孢桿菌廣泛分布在自然界中,是一種優(yōu)勢種群,其中不同的菌株能夠產生不同的抗菌素。本實驗中用到的FUN-BL產生的抗菌素為桿菌肽。桿菌肽能夠有效地抑制革蘭氏陽性菌,主要是影響細胞壁的合成,但是這種抗性卻不針對菌株本身。鑒于桿菌肽的一系列優(yōu)點,同時對比了國外關于桿菌肽的研究,提高桿菌肽的產量和質量具有一定的理論和實用價值。王筱虹等為了獲得高效價的紅霉素,利用UV照射紅色鏈霉菌的原生質體,獲得的突變株較對照菌株效價提高225.8%。許建平等利用DES處理了枯草桿菌B826,獲得了6個拮抗活性都有所提高的菌株,其中突變菌No.35具有高效的拮抗活性和遺傳穩(wěn)定性。李鳳梅等為了獲得1,3-丙二醇的高產突變株,以丁酸梭菌為出發(fā)菌株進行誘變處理,經過DES誘變,獲得l,3-PD高產菌株C.but2031和C.but2046,比誘變前分別提高了104%和113%[11]。由此可以看出,經紫外線照射和硫酸二乙酯處理后,確實能夠獲得高產的突變株,產量較出發(fā)菌株均有較大的提高。

對菌株F2141連續(xù)進行五次傳代培養(yǎng),效價出現了下降趨勢,原因可能是在細胞的繁殖過程中會發(fā)生自發(fā)突變,每傳代一次,退化細胞的優(yōu)勢會更加明顯,多次傳代后,就呈現出了效價降低的趨勢。因此,在實驗過程中,要盡量控制傳代的次數,并且要對菌種定期進行分純和復壯。

4 結論

本研究以地衣芽孢桿菌作為出發(fā)菌株,根據誘變育種的原理,依次對出發(fā)菌株進行了紫外誘變和硫酸二乙酯誘變。確定其誘變條件為:紫外照射(15W,照射距離30cm,照射時間120s),硫酸二乙酯誘變(處理濃度為2%,處理時間為90min)。在上述的條件下,通過紫外誘變篩選到一株桿菌肽效價較高的菌株F167,其產量提高了11.76%。菌株F167在硫酸二乙酯的作用后,通過平板活性篩選和HPLC篩選到一株效價高且穩(wěn)定性好的高產突變株F2141,其產量較出發(fā)菌株提高了32.19%。該突變株經過連續(xù)5次的遺傳穩(wěn)定性實驗后表明具有較高的遺傳穩(wěn)定性,效價無明顯降低,是一株性能優(yōu)異的桿菌肽生產菌株。

[1]胡尚勤.桿菌肽高產的代謝調控[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊,2004,15(4):160-162.

[2]蔡永峰,袁德軒.桿菌肽鋅在畜禽養(yǎng)殖中的應用及安全性[J].國外畜牧科技,2000,27(4):35-37.

[3]馬文山,廖富蘋,馮雪云,等.細菌抗菌肽的研究進展及其應用[J].生物技術通報,2008(3):39-43.

[4]Raussens V,Narayanaswan V,Goormaghtigh E,et al. Hydrogen/Deuterium exchange Kinetics of apolipophorin-III in lipid-free and phosPholipid-bund states[J].J Biol chem,1999,27(4):89-95.

[5]童應凱,韋東勝.固體發(fā)酵工藝生產桿菌肽的研究[J].中國飼料,2007(7):21-23.

[6]J Lowry Miller M D,Meyer HslatkinN,MD,Balbina A Johnson A B. Local Use of Bacitracin[J].The Journal of Investigative Dermatology,1948(10):179-188.

[7]張建剛,鄧波波,朱建平.桿菌肽鋅在動物生產中的應用[J].江西飼料,2011(6):31-33.

[8]薛志成.桿菌肽鋅在畜禽飼養(yǎng)中的應用[J].養(yǎng)殖與飼料,2006(1):23-24.

[9]諸葛健.工業(yè)微生物育種學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2006,85.

[10]施巧琴,吳松剛.工業(yè)微生物育種學(第二版)[M].北京:科學出版社,2003,73-74.

[11]林運萍.枯草芽孢桿菌B68發(fā)酵條件及誘變選育的研究[D].?？冢喝A南熱帶業(yè)大學,2006.

Mutation breeding of high-yield strain of bacitracin

XIE Rui,LI Li,ZHANG Ming-liang,HUANG Jian-zhong*

(Engineering Research Center of Industrial Microbiology,Ministry of Education,Industrial microbial fermentation technology and Area Joint National Engineering Research Center,College of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350108,China)

The purpose of this article was to select effective method to breed high-yield strains of bacitracin. UsingbacilluslicheniformisFUN-BL as an aboriginal strains,the positive mutants were screened by cup-plate method and HPLC after ultraviolet and diethyl sulfate. The aboriginal strains F0mutated through ultraviolet(15W,the irradiation distance of 30 cm and the irradiation time of 120 sec)were screened in repeat to obtain the high-yield strain of bacitracin F167 ,whose titer was improved by 11.76%. Then F167 mutated through diethyl sulfate(dealt with 2% diethyl sulfate for 90min)were screened in repeat to obtain the high-yield strain of bacitracin F2141 ,whose titer was improved by 32.19%. Making the high-yield strains F2141 do the genetic stability test for five successive generations,the titer followed 1003.23,989.34,976.35,960.32,949.72U/mL. High-yield strains of bacitracin can be bred by ultraviolet and diethyl sulfate.

Bacilluslicheniformis;bacitracin;breeding;mutation;HPLC

2014-09-17

謝瑞(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：桿菌肽高產菌株的選育。

*通訊作者:黃建忠(1965-)，男，博士，教授，研究方向：微生物功能基因和工業(yè)酶制劑的研發(fā)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0188-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.029