螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴(kuò)散激酶(CHUK)基因多態(tài)性影響缺血性中風(fēng)痰瘀阻證血脂代謝*

韋湫桂，吳艷麗，陳子文，周金英，謝娟娟，古 聯(lián)△

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

·實(shí)驗(yàn)研究·

螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴(kuò)散激酶(CHUK)基因多態(tài)性影響缺血性中風(fēng)痰瘀阻證血脂代謝*

韋湫桂1，吳艷麗1，陳子文1，周金英1，謝娟娟2，古 聯(lián)2△

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

目的 分析CHUK 基因多態(tài)性與缺血性中風(fēng)風(fēng)痰瘀阻證及氣虛血瘀證血脂水平的關(guān)聯(lián)。方法 共納入341例風(fēng)痰瘀阻證及284例氣虛血瘀證缺血性中風(fēng)病例。采用Sequenom MassARRAY iPLEX進(jìn)行CHUK 3個(gè)位點(diǎn)(rs3808917，rs2230804，rs3808916)基因分型，運(yùn)用HITACHI日立7600 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂水平。結(jié)果 在風(fēng)痰瘀阻證患者中，TG(TG：F=3.125，P=0.045)、LDL-C(LDL-C：F=3.58，P=0.029)水平在不同rs3808917基因型攜帶者之間的分布差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在氣虛血瘀證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同CHUK基因多態(tài)性基因型攜帶者之間、或在不同等位基因攜帶者之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)。結(jié)論 CHUK 基因遺傳多態(tài)性可能影響缺血性中風(fēng)痰瘀阻證的血脂代謝，但不影響氣虛血瘀證的血脂水平。

中風(fēng)證型；CHUK基因；遺傳多態(tài)性；血脂

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性腦卒中屬于“中風(fēng)”，全球每年約550 萬人死于中風(fēng)，且每年用于治療中風(fēng)的費(fèi)用高達(dá)38.6 億美元[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是中風(fēng)發(fā)生的主要病機(jī)之一，而血脂紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化形成有密切關(guān)系。螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴(kuò)散激酶(CHUK)基因編碼的蛋白質(zhì)是核因子NF-kappa-B復(fù)合物的抑制劑，其參與調(diào)控的NF-kappa-B通路可影響中風(fēng)的病理過程[2]。既往有研究表明CHUK基因rs11597086位點(diǎn)與血脂升高有關(guān)[3]，提示CHUK基因多態(tài)性可能影響血脂代謝。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為中醫(yī)證型具有一定分子遺傳基礎(chǔ)[4]，基因序列的多態(tài)性決定了個(gè)體的差異，在臨床則表現(xiàn)為不同的證候群[5]，并可能影響不同證候群相關(guān)生化基礎(chǔ)物質(zhì)。本研究旨在分析CHUK基因3個(gè)分別位于5’near端，外顯子，3’near端的多態(tài)性位點(diǎn)(rs3808917，rs2230804，rs3808916)與缺血性中風(fēng)風(fēng)痰瘀阻證、氣虛血瘀證血脂水平的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 納入625例于2009年7月—2014年6月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腦病科住院的缺血性中風(fēng)病例，包括341例風(fēng)痰瘀阻證，平均年齡(64.46±10.42)歲、284例氣虛血瘀證，平均年齡(66.99±10.45)歲。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《各類腦血管病診斷要點(diǎn)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均經(jīng)過至少兩名主治以上職稱的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師及影像學(xué)檢查(頭顱CT和、或MRI)確診。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及證候辨證分型標(biāo)準(zhǔn)：參照國(guó)家中醫(yī)藥管理局全國(guó)腦病急癥科研協(xié)作組制訂的《中風(fēng)病診斷療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行)》，每名缺血性中風(fēng)患者均經(jīng)2名經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)的主治以上職稱的中醫(yī)醫(yī)師進(jìn)行中醫(yī)證候分型。本研究納入符合中西醫(yī)診斷及證候辨證分型標(biāo)準(zhǔn)的2個(gè)證型(風(fēng)痰瘀阻、氣虛血瘀證)的中風(fēng)患者進(jìn)行研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腫瘤、心臟源性栓塞、腦外傷、短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)、腦血管畸形等其他原因引起的缺血性中風(fēng)；(2)合并系統(tǒng)性疾病。所有研究對(duì)象均為自我報(bào)告為廣西漢族人，相互之間均無親緣關(guān)系，且均知情同意。

2 標(biāo)本DNA提取 于研究對(duì)象入院后次日清晨空腹時(shí)抽取2ml靜脈血于抗凝管內(nèi)，混勻，4℃冰箱保存，并在7d內(nèi)完成DNA提取。采用北京天根科技有限公司生產(chǎn)的TIANamp Blood DNA Kit(離心柱形)血液基因組DNA提取試劑盒嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作步驟進(jìn)行血液基因組DNA提取，提取完成后分裝為3管，放置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 基因分型 采用Sequenom MassARRAY iPLEX實(shí)驗(yàn)平臺(tái)對(duì)CHUK基因3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。采用Sequenom Assay Designer 3.1software(Sequenom，San Diego，CA，USA)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列如表1所述。PCR反應(yīng)體系(總體積為5μl)構(gòu)建如下：10 ng/μl DNA 模板1 μL，10 x PCR Buffer0.5 μL，25 mM MgCl20.4 μL，25 mM dNTP Mix0.1 μL，0.5 uM Primer Mix1μL，5 U/μL HotStar Taq0.2 μL，和H2O 1.8 μL。

表1 候選SNPs 的引物序列信息

1.4 血脂水平測(cè)定 抽取研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，置于非抗凝管內(nèi)，并直接送往醫(yī)院檢驗(yàn)科采用HITACHI日立7600 全自動(dòng)生化分析儀按照標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)程序檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平。

2 結(jié)果

2.1 不同rs3808917基因型、或等位基因攜帶者之間的血脂水平比較 在風(fēng)痰瘀阻證患者中，Tg，LDL-C水平在不同rs3808917基因型攜帶者之間的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TG：F=3.125，P=0.045；LDL-C：F=3.58，P=0.029)。在氣虛血瘀證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在rs3808917位點(diǎn)不同基因型攜帶者之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)，且A等位基因和C等位基因攜帶者之間的TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)。見表2、表3。

表2 風(fēng)痰瘀阻證患者中不同rs3808917 基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

表3 氣虛血瘀證患者中不同rs3808917 基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

2.2 不同rs2230804基因型、或等位基因攜帶者之間的血脂水平比較 在風(fēng)痰瘀阻證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs2230804基因型攜帶者之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)，它們?cè)诓煌任换驍y帶者之間的分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)。在氣虛血瘀證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs2230804基因型攜帶者之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)，它們?cè)诓煌任换驍y帶者之間的分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)。見表4、表5。

表4 風(fēng)痰瘀阻證患者中不同rs2230804 基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

表5 氣虛血瘀證患者中不同rs2230804 基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

2.3 不同rs3808916基因型、或等位基因攜帶者之間的血脂水平比較 在風(fēng)痰瘀阻證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平水平在不同rs3808916基因型攜帶者之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)，它們?cè)诓煌瑀s3808916等位基因攜帶者之間的分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)。在氣虛血瘀證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs3808916基因型攜帶者之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)，且T等位基因和C等位基因攜帶者之間的TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)。見表6、表7。

表6 風(fēng)痰瘀阻證患者中不同rs3808916基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

表7 氣虛血瘀證患者中不同rs3808916基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為中風(fēng)病主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，其病理因素主要有虛、火、風(fēng)、痰、氣、血、毒六邪。朱丹溪首提“半身不遂，大率多痰。多是濕土生痰，痰生熱，熱生風(fēng)也”；《明醫(yī)雜著》曰：中風(fēng)乃血?dú)饨蛞核兄帲阅郎舳?，不得流通所致?！疤怠蓖＞塾隗w內(nèi)，造成一系列錯(cuò)綜復(fù)雜的病理過程；膏脂與津液同源，是津液的稠濁狀態(tài)即為膏脂，其能入血。目前“痰瘀故邪、痰致中風(fēng)”已深入人心。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為血管壁病變、血液成分和血液動(dòng)力學(xué)改變是引起中風(fēng)的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化是其基本病因之一，而高脂血癥被認(rèn)為是通過引起動(dòng)脈粥樣硬化而引起腦血管病?！冻嗨槿吩唬喝粞獫釟鉁瑒t凝聚為痰，滯于營(yíng)中，浸淫血脈，即成血脈痰濁。而血濁、痰凝與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)高血脂癥的概念相似，是中風(fēng)發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)之一。

CHUK基因編碼核因子NF-kappa-B復(fù)合物的一種抑制劑，其編碼的蛋白可使NF-kappa-B信號(hào)通路上的節(jié)點(diǎn)磷酸化，從而激活核錄因子NF-kappa-B，促進(jìn)成套促炎基因的表達(dá)，最終促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化形成[6]。在Asselbergs的meta研究中發(fā)現(xiàn)CHUK基因上rs11597086位點(diǎn)與血脂紊亂有關(guān)[3]。而筆者的研究發(fā)現(xiàn)在風(fēng)痰瘀阻證患者中，Tg，LDL-C水平在CHUK多態(tài)性rs3808917不同基因型攜帶者之間的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CHUK基因rs3808917多態(tài)性影響中風(fēng)風(fēng)痰瘀阻證的血脂代謝。rs3808917 位于臨近5’UTR端，而5’非編碼區(qū)(5’UTR)已被證明在翻譯表達(dá)過程中通過與某些調(diào)控因子的結(jié)合對(duì)基因差異表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[7]。中醫(yī)醫(yī)家認(rèn)為痰飲內(nèi)停阻滯氣機(jī)易形成瘀血，而瘀血內(nèi)阻亦影響津液代謝，進(jìn)一步形成痰飲。朱丹溪?jiǎng)t提出“治風(fēng)當(dāng)以治痰”。名醫(yī)關(guān)幼波提出痰與血同屬陰，易于交結(jié)凝固，治痰要治血，血行則痰化，可見痰瘀是缺血性中風(fēng)最主要的病機(jī)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證明脂質(zhì)代謝紊亂是引起頸動(dòng)脈的粥樣硬化的物質(zhì)基礎(chǔ)，而頸動(dòng)脈粥樣硬化與中風(fēng)的發(fā)生密切相關(guān)[8-10]。趙玲等[11]認(rèn)為高脂血癥為血中有痰濁之氣，痰濁瘀血凝聚滯于血中致血液呈“黏”、“濃”、“凝”、“聚”狀態(tài)，表明脂質(zhì)代謝異常的病理改變屬于“痰瘀”范疇。黃先長(zhǎng)等[12]在血脂與中風(fēng)中醫(yī)證型研究中，發(fā)現(xiàn)血清TC、TG及LDL-C水平等血脂指標(biāo)可作為中風(fēng)證型的生化物質(zhì)基礎(chǔ)。與我們研究結(jié)果相類似的是，既往已有中醫(yī)學(xué)研究報(bào)道易感基因遺傳多態(tài)性影響中醫(yī)證型的血脂代謝。如歐陽濤[13]發(fā)現(xiàn)在冠心病痰瘀證中，TG和LDL-C 水平在-/-、-/+、+/+基因型患者中存在漸升的趨勢(shì)，+/+基因型的TC 水平和動(dòng)脈硬化指數(shù)顯著高于-/-基因型，表明LDL-R基因可能影響冠心病痰瘀證的血脂代謝，從而促進(jìn)動(dòng)脈硬化形成。另外梁晉普等[14]人報(bào)道ApoE基因多態(tài)性可能影響高脂血癥痰瘀證的血脂代謝，且占呈燕等[15]更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在痰瘀證高脂患者中，TG水平在ApoE基因攜帶E2/3基因型與攜帶E3/3和E3/4基因型的分布差異顯著。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)一些遺傳多態(tài)性位點(diǎn)基因型的差異會(huì)導(dǎo)致缺血性中風(fēng)的血脂代謝差異。例如，Peng[16]等人研究發(fā)現(xiàn)TG水平在TGF-β1基因C-509T位點(diǎn)攜帶TT基因型、TC基因型及CC基因型分布具有顯著性差異，還發(fā)現(xiàn)LDL-C水平在該基因869T/C位點(diǎn)上攜帶TT基因型、TC基因型及CC基因型分布同樣具有顯著性差異；另有陳玉蘭[17]等報(bào)道Ser447Ter基因G等位基因的血脂(TC、TG及HDL-C)水平較C等位基因攜帶者高，提示Ser447Ter基因影響缺血性中風(fēng)的血脂水平。

因此，根據(jù)本研究結(jié)果，CHUK基因多態(tài)性可能影響缺血性中風(fēng)風(fēng)痰瘀阻證的血脂代謝。

[1]D.Mukherjee，C.G.Patil.Epidemiology and the global burden of stroke.World Neurosurg，2011，76(6 Suppl)：S85-90.

[2]Razani B，Reichardt AD，Cheng G：Non-canonical NF-kappaB signaling activation and regulation：principles and perspectives.Immunol Rev，2011，244(1)：44-54.

[3]Asselbergs FW，Guo Y，van Iperen EP：Large-scale gene-centric meta-analysis across 32 studies identifies multiple lipid loci.Am J Hum Genet，2012，91(5)：823-838.

[4]董昌武，高爾鑫.論疾病易感基因多態(tài)性與中醫(yī)證候的多樣性[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27(11)：2355-2356.

[5]丁海拔，盛梅笑.從組學(xué)探討中醫(yī)證候本質(zhì)的研究概況[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，19(4)：502-504.

[6]Hayden MS，Ghosh S.Shared principles in NF-kappaB signaling.Cell 2008，132：344-362.

[7]張芳燕，羅翔，董娜，等.5’UTR與基因表達(dá)的關(guān)系[J].科技經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)，2011，03：13-16.

[8]席剛，劉芳，侯東哲，等.腦梗塞患者血脂和脂蛋自的檢測(cè)及臨床意義[J].大津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，7(l)：102～104.

[9]DavidTann，NiraKoren，UGoldbourt.Blood lipids are importantin dependent risk fators for Isehemie strokeor TIA：aProsPeetivefollow—uPofover11，000PatientsintheBIPregistry[J].Stroke，1999，30(9)：

1907-1915.

[10]孫芳，金紹國(guó)，錢文君.血脂與腦卒中相關(guān)性的探討[J].中國(guó)血液流變學(xué)志，2002，12(3)：218-219.

[11]趙玲，魏海峰，張麗.中醫(yī)痰濁血瘀證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究[J].2008，23(8)：680-683.

[12]黃先長(zhǎng)，賀運(yùn)河，朱惠斌.腦梗死患者血糖、血脂變化與中醫(yī)證型關(guān)系的臨床分析[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22(1)：55-56.

[13]歐陽濤，宋劍南，林謙，等.冠心病體質(zhì)表型和低密度脂蛋白受體基因Avall位點(diǎn)多態(tài)性關(guān)系的研究[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(7)：521-523.

[14]梁晉普，楊惠民，盛彤，等.載脂蛋白E基因多態(tài)性與高脂血癥痰瘀證患者血脂水平關(guān)系的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2008，23(7)：633-635.

[15]占呈燕：載脂蛋白E基因多態(tài)性與高脂血癥痰瘀證血脂水平及調(diào)脂療效的關(guān)系研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)，2006，1-50.

[16]Peng Z，Zhan L，Chen S et al.Association of transforming growth factor-beta1 gene C-509T and T869C polymorphisms with atherosclerotic cerebral infarction in the Chinese：a case-control study[J].Lipids in health and disease，2011，10：100.

[17]陳玉蘭.脂蛋白酯酶基因Ser447Ter 多態(tài)性與缺血性腦卒中關(guān)系的Meta 分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40(17)：3145-3152.

[18]張芳燕，羅翔，董娜，等.5’UTR與基因表達(dá)的關(guān)系[J].科技經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)，2011，03：13-16.

Influence of Helix-loop-helix Domain Diffusion Kinase (CHUK) Gene Polymorphism on Lipid Metabolism of Ischemic Stroke and Phlegm Stasis Resistance Syndrome

WEI Qiu-gui1, WU Yan-li1, CHEN Zi-wen1, ZHOU Jin-ying1, XIE Juan-juan2, GU Lian3

(1.SchoolofPostgraduates,GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530001,Guangxi;2.ICUDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530023,Guangxi;3.NeurologyDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530023,Guangxi)

Objective: To analyze the correlation of CHUK gene polymorphism and ischemic stroke and phlegm stasis syndrome (PS) as well as lipid level of qi deficiency blood stagnation syndrome(QDBS). Methods: 341 PS patients and 284 ischemic stroke QDBS patients were taken into analysis. Sequenom Mass ARRAY iPLEX was used to conduct 3 loci of CHUK (rs3808917, rs2230804, rs3808916) genotyping. HITACHI 7600 automatic biochemical analyzer was used to detect blood lipid level. Results: Among the PSR patients, the distribution differences of TG (TG: F=3.125, P=0.045), LDL-C (LDL-C: F=3.58, P=0.029) between the different levels of rs3808917 genotype were statistically significant. Among the QDBS patients, the distribution differences of TC, Tg, HDL-C, LDL-C levels between different CHUK polymorphism genotype carriers, or between different allele carrier showed no statistical significance (P>0.050). Conclusion: The CHUK genetic polymorphism may affect the lipid metabolism of ischemic stroke PS patients, but does not affect the lipid level of the QDBS patients.

stroke syndrome, CHUK gene, genetic polymorphism, lipid

國(guó)家自然科學(xué)基金課題(NO.81260594)，廣西自然科學(xué)基金課題(NO.2013 gXNSFAA019145)，廣西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)課題(NO.GZYQJ2014018)

韋湫桂(1986-)，女，廣西人，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治腦血管疾病。

△通信作者：古聯(lián)，E-mail：gulian2012@163.com

R255.2

A

1007-2349(2015)12-0061-04

2015-10-26)