不同禽類Mel 1c基因克隆及生物信息學(xué)分析

王淑娟，劉文舉，王立克，龐訓(xùn)勝，車傳燕

(安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院， 安徽 鳳陽 233100)

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不同禽類Mel 1c基因克隆及生物信息學(xué)分析

王淑娟，劉文舉，王立克，龐訓(xùn)勝，車傳燕

(安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院， 安徽 鳳陽 233100)

為進(jìn)一步研究克隆到的鵝、鴨、鵪鶉、斑鳩Mel 1c 基因，對該序列進(jìn)行特征分析，為Mel 1c 基因的功能研究打下基礎(chǔ)。 參考NCBI其它物種的序列設(shè)計引物，克隆得到鵝、鴨、鵪鶉、斑鳩Mel 1c基因的部分cDNA序列，并對其編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。鵪鶉、鴨、鵝和斑鳩的Mel 1c部分片段，長度為850bp，編碼 283個 氨基酸。通過分析鵪鶉、鴨、鵝和斑鳩Mel 1c的結(jié)構(gòu)表明符合褪黑素受體的結(jié)構(gòu)特征，含有一N端在胞內(nèi)六個跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。該蛋白質(zhì)為分泌蛋白，包含一個信號肽，其剪切位點位于26和27之間(VVA-VY)。同源性比對結(jié)果表明不同物種間Mel 1c基因序列及氨基酸序列的同源性較高均大于71%，Mel 1c在進(jìn)化過程中比較保守。鵝、鵪鶉、斑鳩、鴨和原雞的核酸和氨基酸的同源性最高分別大于92%和96%。Mel 1c符合進(jìn)化規(guī)律，斑鳩、鵪鶉、鵝和鴨屬于高等的非哺乳類脊椎動物，處于分子進(jìn)化樹的最頂層。

褪黑素受體；Mel 1c；基因克隆；生物信息學(xué)

褪黑素是松果體分泌的一個重要的激素，視網(wǎng)膜的光感受器也能夠合成褪黑素，通過旁分泌和或胞分泌結(jié)合到視網(wǎng)膜褪黑素受體。褪黑素通過與其受體結(jié)合發(fā)揮調(diào)控血壓[1]，調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律[2]，調(diào)控視網(wǎng)膜的生理功能[3-4]，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[3]，調(diào)控季節(jié)性繁殖[5]，調(diào)控卵巢功能[6]抗氧化功能[7]等重要的生物學(xué)作用。動物機體褪黑素的含量受晝夜節(jié)律和季節(jié)的變化影響[8-10]；一天之中，白天褪黑素的含量最低，而夜間褪黑素的含量最高，季節(jié)同樣對褪黑素的分泌有重要的影響，冬季褪黑素的水平要高于夏季。褪黑素受體分為Mel 1a(也稱為MT1)、Mel 1b (也稱為MT2)和Mel 1c 等3種亞型，目前褪黑素受體已被證實屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域[11]。 Mel 1a和Mel 1b存在所有的脊椎動物中，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織[12]。在哺乳動物中，Mel 1a主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，垂體、晝夜節(jié)律位點和生殖系統(tǒng)[13]；Mel 1b主要表達(dá)于視網(wǎng)膜，介導(dǎo)晝夜節(jié)律的調(diào)控[14]。而Mel 1c主要存在于非哺乳類脊椎動物的腦和視網(wǎng)膜[15]。褪黑素的分泌受多種因素影響，進(jìn)而影響褪黑素對受體的結(jié)合，發(fā)揮不同的生理功能。褪黑素受體的表達(dá)和功能受到多種因素調(diào)控，比如日夜循環(huán)，褪黑素，激素，內(nèi)源性的心率節(jié)律等[8-9]。褪黑素受體在腦、腎、腎上腺、腸、胃、心臟、肺、皮膚、睪丸及卵巢周邊組織均有表達(dá)，在視交叉上核及腦的表達(dá)量最高。褪黑素受體不同亞型在不同物種中的表達(dá)分布及定位具有差異[16],褪黑素受體在神經(jīng)系統(tǒng)及周邊組織廣泛分布，這與褪黑素對神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)及生理效應(yīng)以及對晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)有著重要的關(guān)系[17]。褪黑素通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸，進(jìn)而調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖性動物的生殖功能，而對非季節(jié)性繁殖動物亦有重要的調(diào)節(jié)作用[18]。褪黑素直接調(diào)節(jié)卵巢的功能通過激活顆粒細(xì)胞及卵泡的多重受體及信號通路褪黑素可以調(diào)節(jié)禽類的晝夜節(jié)律、睡眠、體溫和神經(jīng)內(nèi)分泌[19]。褪黑激素對牛的顆粒細(xì)胞具有抗凋亡作用[20]。本試驗通過RT-PCR的方法克隆鵝、鴨、鵪鶉、斑鳩的Mel 1c基因序列，并對該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為研究Mel 1c在不同物種中的定位分布以及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗對象 成年母鵝、母鴨、鵪鶉、斑鳩各1只，取新鮮腦組織于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒(購自北京索萊寶)、M-MLV RT反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶等(均購自fermentas)、dNTP Mix(購自天根公司)、DNA回收試劑盒(購自上海生工公司)、pMD18-T載體(購自TaKaRa)，質(zhì)粒小提試劑盒(購自天根公司)。

1.2 方法

1.2.1 腦組織總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 采用RNA提取試劑盒提取凍存于液氮中的腦組織中的總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉目俁NA 為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序及條件：5μL總RNA、0.5μL Oligo(dT) Primer，70℃ 5min，迅速置于冰上預(yù)冷2min；然后加入11.75μL Rnasefree-H2O、5μL M-MLV RT 5×Buffer、1.25μL dNTP、0.5μL RNasin Ribonuclease Inhibitor和1μL M-MLV Reverse Transcriptase，42℃ 60min，72℃ 10min，得到cDNA，置于-20℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴增 參考GeneBank報道的原雞(Gallus, NM_205361)、金魚(Carassius auratus, AB481375)、斑馬魚(Danio rerio, NM_001161484)、狼鱸(Dicentrarchus labrax, EU378920)、點帶石斑魚(Epinephelus coioides, JX524510)、香魚(Plecoglossus altivelis, AB481370)、點籃子魚(Siganus guttatus, DQ768088)、塞內(nèi)加爾鰨(Solea?senegalensis, FM213465)和蟾蜍(Xenopus laevis, XLU67880) Mel 1c基因序列，針對序列保守區(qū)域利用Primer5.0軟件優(yōu)化設(shè)計2對引物。引物由上海生工公司合成。

表1 鵝、鴨、鵪鶉和斑鳩Mel 1c基因擴增引物

以合成的cDNA第一鏈為模版進(jìn)行目的基因的擴增，PCR反應(yīng)體系為：2μL cDNA、引物(10μmol/L)各0.8μL、0.5μL dNTP (10mM)、2.5μL 10×Buffer、0.5μL Taq酶(5U/μL),加dd H2O補至20μL。

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物保存在4℃。PCR擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察切下目的片段，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 將目的片段與pMD18-T克隆載體連接。連接體系：0.3μL pMD18-T vector、2.5μL SolutionⅠ、7.2μLDNA回收產(chǎn)物，混合，4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，鋪含Amp+LB瓊脂糖培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h。挑取單菌落，小量培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，然后以質(zhì)粒為模板用PCR鑒定重組質(zhì)粒。

1.2.4 測序與分析 選PCR鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 氨基酸序列通過expasy軟件翻譯獲得(http://www.expasy.ch/tools/dna.html)，采用NCBI 的BLAST工具比對序列的同源性(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，通過ClustalW程序構(gòu)建分子進(jìn)化樹(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)。利用SignalP-4.0進(jìn)行Mel 1c蛋白信號肽預(yù)測。利用TMHMM Serverv.2.0對蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMD18-T-Mel1c的鑒定

對挑取的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖1，從陽性克隆中，挑選任一個進(jìn)行序列測定。

2.2 核苷酸和氨基酸序列分析結(jié)果

鵝、鴨、鵪鶉和斑鳩的RT-PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果片段均為850bp(圖1)。對獲得的序列在GeneBank上進(jìn)行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)為Mel 1c基因的部分cDNA序列。該編碼區(qū)與已報道動物的Mel 1c具有較高的同源性。由ExPASy的ProtParamToo軟件分析該片段共編碼283個氨基酸，且為疏水性。另外還預(yù)測該蛋白質(zhì)為分泌蛋白，包含一個信號肽，其剪切位點位于26和27之間(VVA-VY)(圖2)；而且該蛋白具有G蛋白偶聯(lián)受體家簇1的結(jié)構(gòu)域(1-244)，含六個強的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖3)；這些蛋白含有褪黑素受體的典型特征：在第二個跨膜區(qū)的下游含有NRY基本單元，在第六個跨膜區(qū)含有NAXXY(X為除了脯氨酸外的任意氨基酸)基本單元。對維持哺乳動物褪黑素受體1a重要功能的氨基酸已被加灰色背景(圖4)。經(jīng)亞細(xì)胞定位分析預(yù)測其可能位于漿膜、高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

鵝、鴨、鵪鶉和斑鳩Mel 1c基因部分cDAN序列和推測氨基酸序列分別與GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲得的其它已知物種Mel 1c基因cDNA序列與氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(表2、表3)。結(jié)果表明，鵝、鴨、鵪鶉、斑鳩和原雞間的核苷酸序列同源性較高達(dá)92%～98%；而和金魚、斑馬魚、狼鱸、點帶石斑魚、香魚、點籃子魚、曬內(nèi)加爾鰨及蟾蜍的同源性均大于71%。鵝、鴨、鵪鶉、斑鳩和原雞間氨基酸序列的同源性在96%～98%；而和金魚、斑馬魚、狼鱸、點帶石斑魚、香魚、點籃子魚、曬內(nèi)加爾鰨及蟾蜍的同源性均大于75%。

Xenopus -MMEVNSTCL DCRTPGTIRT --EQDAQDSA SQGLTSALAV VLIFTIVVDV LGNILVILSV

Solea MGDELEVKDV NGSNCLSRNE --SDRGLSAS SAGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Siganus --MDLDVEDV NGSNCVSRNE --SGRGLSAS SSGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Plecogloss --MELEAN-L SGVHCLSHDE NGSCAAEQTS STGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Gallus ---------M ERPGSNGSCS --GCRLEGGP AARAASGLAA VLIVTIVVDV LGNALVILSV

Epinephelu --MDLEVKDE NGSSCLSRNE --SDRGLNAS SAGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Dicentrarc --MDLEVKDV NGSNCLSRNE --SVRGLSAS SAGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Danio --MAMTKANL SCLDSLSQGN --NCLTARST SPGVAATLAG VLIFTTVADI VGNLLVILSV

Carassius --MELLKANL SCLDSLSPGN --NCLPARGT SPGVAATLAG VLIFTTVADI VGNLLVILSV

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Siganus YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LVLTAIFHND WTMGDLNCQA SGFIMGLSVI

Plecogloss FRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVAVYPYP LVLTAIFHND WTMGDLHCQA SGFIMGLSVI

Gallus LRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVAVYPYP LILSAIFHNG WTMGNIHCQI SGFLMGLSVI

Epinephelu YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LVLTAIFHDD WTMGDLHCQA SGFIMGISVI

Dicentrarc YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LVLTAIFHND WTMGDLHCQA SGFIMGLSVI

Danio YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LALIAIFHND WTMGSLHCQL SGFIMGLSVI

Carassius YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LALVAIFHNG WTMGSLHCQL SGFIMGLSVI

Coturnix LRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVAVYPYP LILSAIFHNG WTMGNVHCQI SGFLMGLSVI

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googse LRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVAVYPYP LILSAIFHNG WTMGNVHCQI SGFLMGLSVV

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圖4 鵝、鴨、鵪鶉和斑鳩的Mel1c氨基酸序列與其它脊椎動物比對

Fig.4 Deduced amino acid sequence of goose,duck,geopelia and coturnix Mel1c melatonin receptor and alignment with Mel1c from other vertebrate species.

表2 不同物種Mel 1c基因核苷酸序列同源性比較(%)

表3 不同物種Mel 1c基因氨基酸序列同源性比較(%)

2.3 分子進(jìn)化樹分析

由表3可見Mel 1c的氨基酸序列比對結(jié)果顯示該基因比較保守，經(jīng)比較分析不同物種間有相同的結(jié)構(gòu)域。據(jù)此構(gòu)建的分子進(jìn)化樹(圖5)表明，Mel 1c基因符合進(jìn)化規(guī)律，狼鱸(dicentrarchus labrax)是本研究中最低等的脊椎動物，位于分子進(jìn)化樹的最底層，而斑鳩、鵪鶉、鵝和鴨處于分子進(jìn)化樹的最頂層。

3 討論

本研究成功克隆了鵪鶉、鴨、鵝和斑鳩的Mel 1c基因部分片段，長度為850bp，編碼 283個 氨基酸，并對其分子特征進(jìn)行分析。結(jié)果表明，鵪鶉、鴨、鵝和斑鳩的Mel 1c基因符合褪黑素受體的結(jié)構(gòu)特征，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族[11]。維持褪黑素受體功能的氨基酸序列在鵪鶉、鴨、鵝和斑鳩以及其他物種之間是保守的，這些保守序列包括在跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅱ含有兩個保守的絲氨酸殘基，在跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅲ含有保守的纈氨酸、組氨酸和靠近的NRY殘基，在跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅵ、Ⅶ分別含有保守的脯氨酸和絲氨酸。這些保守的氨基酸組成對于維持Mel 1c高級結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能具有重要的作用[21]。

與Genebank其它物種的Mel 1c核苷酸和氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)不同物種間的Mel 1c基因核酸和氨基酸的同源性較高(分別高于71%和75%)。鵝、鵪鶉、斑鳩、鴨和原雞的核酸和氨基酸的同源性最高(分別大于92%和96%)。鵝、鵪鶉、斑鳩、鴨和原雞均屬于禽類，所以在氨基酸和核酸的同源性上較高。氨基酸序列的比對表明Mel 1c在進(jìn)化過程中比較保守。通過氨基酸序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹，Mel 1c符合進(jìn)化規(guī)律，斑鳩、鵪鶉、鵝和鴨屬于高等的非哺乳類脊椎動物，處于分子進(jìn)化樹的最頂層，狼鱸(dicentrarchus labrax)是本研究中最低等的非哺乳類脊椎動物，位于分子進(jìn)化樹的最底層。

根據(jù)Mel 1c氨基酸序列通過相應(yīng)軟件預(yù)測表明該蛋白質(zhì)為分泌蛋白，包含一個信號肽，其剪切位點位于26和27之間(VVA-VY)。Mel 1c蛋白為具有七個跨膜結(jié)構(gòu)功能蛋白，而跨膜結(jié)構(gòu)多構(gòu)成受體通道，執(zhí)行信號傳導(dǎo)等重要功能[22]。這種結(jié)構(gòu)對于維持褪黑素調(diào)控動物的節(jié)律性及調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸可能具有重要的作用，褪黑素在外界光源等因素的影響下與Mel 1c結(jié)合，作為一種信號進(jìn)而調(diào)控動物的晝夜節(jié)律及生殖生理活動。

本研究為Mel 1c在調(diào)控動物節(jié)律性中的作用，在不同組織中的表達(dá)分布，以及Mel 1c在禽類生殖生理中的調(diào)控研究提供基礎(chǔ)。同時本研究通過克隆獲得鵝、鵪鶉、斑鳩和鴨的Mel 1c基因序列，這為研究Mel 1c在不同物種中的遺傳進(jìn)化研究提供可靠的序列參考。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了鵝、鵪鶉、斑鳩和鴨的Mel 1c基因的部分片段，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過PCR擴增獲得Mel 1c基因部分編碼序列，該序列含有六個跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。該蛋白質(zhì)為分泌蛋白，包含一個信號肽。與其他物種比對， Mel 1c基因同源性較高，其中鵝、鵪鶉、斑鳩、鴨和原雞的核酸和氨基酸的同源性最高，在進(jìn)化過程中比較保守。

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Cloning and Bioinformatics Analysis of Mel 1c Genes in Different Poultry

WANG Shu-juan, LIU Wen-ju, WANG Li-ke, PANG Xun-sheng, CHE Chuan-yan

(Colloge of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

The study cloned the Mel 1c gene of goose, duck, coturnix and geopelin, and analyzed the biological information of the sequence, which laid the foundation for further research on Mel 1c gene. Partial sequence of Mel 1c gene of goose, duck, coturnix and geopelin were cloned by using the sequence database of NCBI, and analyzed the biological information of Mel 1c protein. The result showed that the cloned sequences length of Mel 1c gene were 850 bp, which encoded 211 amino-acid fragment. The protein contained a cytoplasmic N-termini in the six-transmembrane domains and belong to a superfamily of G-protein coupled receptors. And it was a secreted protein containing a signal peptide, while the splice site was located between 26 and 27(VVA-VY). Compared with other species Mel 1c genes published, the homology among different species was higher than that of 71%, the gene was conserved in evolution. Meanwhile the goose, duck, coturnix and geopelin nucleotide and putative amino acid sequence homology are highest, which are more than 92% and 96% respectively. Goose, duck, coturnix and geopelin belong to non mammalian vertebrates, at the top of the phylogenetic tree, which accord with biological evolution rule. More biological information of Mel 1c gene showed that the gene belonged to melatonin receptor subtype.

Melatonin receptor; Mel 1c; Gene cloning; Bioinformatics

2015-05-03

國家自然科學(xué)基金(31301972)；安徽省自然科學(xué)基金(1308085QC66)；安徽省教育廳自然科學(xué)基金項目(kj20136077)。

王淑娟(1983-)，女，山東省荷澤市人，博士，講師，主要從事動物生殖生理與繁殖研究。

Q71

A

1673-8772(2015)04-0001-08