微孔板Alamar blue顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的研究

鄭玉紅，郭 倩,3，李 超,4，魏劍浩,4，趙麗麗，蔣 毅，趙秀芹，萬(wàn)康林，李桂蓮

微孔板Alamar blue顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的研究

鄭玉紅1,2，郭 倩1,2,3，李 超1,2,4，魏劍浩1,2,4，趙麗麗1,2，蔣 毅1,2，趙秀芹1,2，萬(wàn)康林1,2，李桂蓮1,2

目的 評(píng)價(jià)微孔板Alamar blue顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的可行性。方法 用微孔板Alamar blue顯色法對(duì)78株結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)氧氟沙星的最小抑菌濃度，記錄獲得結(jié)果時(shí)間，利用ROC曲線確定氧氟沙星的最佳耐藥閾值，并和傳統(tǒng)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)羅氏培養(yǎng)基比例法進(jìn)行比較。結(jié)果 微孔板Alamar blue顯色法獲得結(jié)果平均時(shí)間為8 d，氧氟沙星的最佳耐藥閾值為2 μg/mL，以羅氏培養(yǎng)基比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，氧氟沙星的靈敏度和特異度分別為88.6%和94.1%。結(jié)論 微孔板Alamar blue顯色法是一種簡(jiǎn)便、敏感、快速的藥物敏感性檢測(cè)方法，可用于結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的快速檢測(cè)。

結(jié)核分枝桿菌；氧氟沙星；耐藥性；Alamar blue顯色法

近年來(lái)，耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensive drug resistant tuberculosis, XDR-TB)的出現(xiàn)使結(jié)核病控制面臨嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。我國(guó)是一個(gè)MDR-TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家，MDR-TB病人數(shù)占全球的22%[1-3]。2007年全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果顯示MDR-TB患病率初治病人為5.7%，復(fù)治病人則高達(dá)25.6%[2]。氟喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有高度抗菌活性，是MDR-TB聯(lián)合治療方案的藥物之一，而且氟喹諾酮類(lèi)藥物成員莫西沙星作為一線抗結(jié)核藥用于減少結(jié)核病治療療程的臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谠u(píng)估當(dāng)中[4-5]。然而氟喹諾酮類(lèi)藥物由于其廣譜抗菌活性，該藥在我國(guó)目前廣泛用于非呼吸道感染性疾病已經(jīng)有20多年的歷史。氟喹諾酮類(lèi)藥物的濫用可能會(huì)使MDR-TB的治療效果不盡如人意。因此快速、準(zhǔn)確的對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)對(duì)指導(dǎo)臨床治療、控制結(jié)核病流行具有極其重要的意義。

目前臨床上仍廣泛采用羅氏培養(yǎng)基比例法藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，藥敏結(jié)果獲得需要4～5周，不能及時(shí)準(zhǔn)確的指導(dǎo)結(jié)核病治療。Alamar blue顯色法藥敏實(shí)驗(yàn)是近年興起的表型藥物敏感性檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)的比例法相比，實(shí)驗(yàn)周期從4～5周縮短至8～9 d，而且操作簡(jiǎn)單，可快速測(cè)定大量樣本。文獻(xiàn)報(bào)道Alamar blue顯色法藥敏實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)結(jié)核菌4種一線抗結(jié)核藥的敏感性具有良好的靈敏度和特異度[6-10]。但是目前關(guān)于該方法檢測(cè)結(jié)核菌氟喹諾酮敏感性的報(bào)道較少?，F(xiàn)將我們用Alamar blue顯色法檢測(cè)結(jié)核菌氧氟沙星耐藥性的結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv，ATCC27294)和78株經(jīng)菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌的臨床分離株為本室保存菌株。78株臨床株含經(jīng)比例法藥敏試驗(yàn)鑒定的44株氧氟沙星耐藥株和34株氧氟沙星敏感株，具體的耐藥表型見(jiàn)表1。

表1 78株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐藥譜

Note: OF, ofloxacin; INH, isoniazid; RIF, rifampicin; STR, streptomycin; EMB, ethambutol; KAN, kanamycin; CPM, capreomycin; Pan-susceptible strains means that strains were susceptible to all of the above drugs.

1.2 試劑和耗材 Middlebrook 7H9干粉和OADC營(yíng)養(yǎng)添加劑購(gòu)自美國(guó)BD公司；利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、喹諾酮、卡那霉素和卷曲霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ALamar blue購(gòu)自英國(guó)AbD Serotec公司；滅菌96孔酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.3 主要試劑配制 7H9液體培養(yǎng)基配制方法為秤取4.7g 7H9干粉、2 mL甘油，加入到898 mL蒸餾水中，于121 ℃高壓滅菌10 min后置4 ℃冰箱保存。臨用時(shí)，加入100 mLADC營(yíng)養(yǎng)添加劑。Alamar blue顯色劑為臨用前配制。氧氟沙星用滅菌后的1%氫氧化鈉水溶液配成1.28 mg/mL。

1.4 羅氏培養(yǎng)基藥敏比例法 按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，培養(yǎng)基中藥物終濃度如下：利福平40 μg/mL，異煙肼0.2 μg/mL，鏈霉素4 μg/mL，乙胺丁醇2 μg/mL，卡那霉素30 μg/mL，氧氟沙星2 μg/mL，卷曲霉素 40 μg/mL[11-12]。

1.5 氧氟沙星MIC測(cè)定 H37Rv和78株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)氧氟沙星的MIC檢測(cè)采用微孔板Alamar blue顯色法，具體步驟參照文獻(xiàn)[6]。簡(jiǎn)言之，先于96孔板每一行的各個(gè)孔加入100 μL7H9，然后采用倍比稀釋的方法使氧氟沙星的濃度為64 μg/mL～0.125 μg/mL，同一行的各孔均加入同一菌株的稀釋菌液(濃度為50 μg/mL)100 μL，一個(gè)微孔板可以做6株菌株對(duì)氧氟沙星的MIC。將上述微孔板在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d；從第6 d開(kāi)始，在空白板中加入70 μL顯色劑(Alarmar blue：5%Tween-80=2∶5)，隔天觀察變色情況。如顏色從藍(lán)色變成紫紅色或粉色，則在含藥培養(yǎng)基中加入顯色劑；若沒(méi)有變色或變色程度較淺，則繼續(xù)在另一對(duì)照孔中加入顯色劑，觀察至變色為止。在含藥培養(yǎng)基中加入顯色劑的第2 d，觀察結(jié)果并記錄獲得結(jié)果的天數(shù)。MIC定義為藍(lán)色完全沒(méi)有發(fā)生改變的最小藥物濃度。

1.6 數(shù)據(jù)分析 微孔板Alamar blue顯色法的準(zhǔn)確度利用ROC曲線評(píng)價(jià)，曲線下面積越大，則認(rèn)為該方法正確區(qū)分氧氟沙星耐藥和敏感的能力越大。ROC曲線可給出區(qū)分耐藥和敏感的最佳耐藥閾值，當(dāng)ROC曲線下面積為1時(shí)，該閾值可正確的將耐藥和敏感完全分開(kāi)，當(dāng)面積小于或等于0.5時(shí)，該閾值不能將敏感和耐藥分開(kāi)。金標(biāo)準(zhǔn)為改良羅氏比例法。ROC數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS16.0進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 氧氟沙星MIC值檢測(cè)結(jié)果 78株菌株氧氟沙星的MIC值見(jiàn)表2。44株氧氟沙星耐藥菌株中，39株菌株氧氟沙星的MIC值在2 μg/mL及以上，MIC值最高為64 μg/mL；其余5株中4株菌株MIC值為1 μg/mL，1株菌株為0.5 μg/mL。34株氧氟沙星敏感菌株中2株MIC為2 μg/mL，2株為1 μg/mL，2株為0.5 μg/mL，14株為0.25 μg/mL，其余12株≤0.125 μg/mL。

利用ROC曲線分析，曲線下面積為0.981，P值為0.000，氧氟沙星的最佳耐藥閾值為2 μg/mL。此時(shí)Alamar blue顯色法的靈敏度和特異度分別為88.6%和94.1%，見(jiàn)表3。

表2 78株結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星MIC檢測(cè)結(jié)果

Note: OF, ofloxacin.

表3 微孔板Alamar blue 顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的敏感度和特異度分析Tab.3 Sensitivity and specificity of Microplate Alamar blue assay for ofloxacin susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis

Note: MABA, Microplate Alamar blue assay; the breakpoint of ofloxacin resistance was ≥2 μg/mL for Microplate Alamar blue assay.

2.2 檢測(cè)時(shí)間 本研究共檢測(cè)78株臨床菌株對(duì)氧氟沙星的耐藥性，共有60株菌株8 d獲得結(jié)果，12株9 d獲得結(jié)果，6株10 d獲得結(jié)果。平均時(shí)間(中位數(shù))為8 d。

3 討 論

由于結(jié)核分枝桿菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重[13]，因此快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的藥物敏感性檢測(cè)方法的出現(xiàn)就顯得尤為重要。多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道ALamar blue(刃天青)顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇藥物敏感性的靈敏度和特異度均在97%以上[6-10]。本研究用微孔板Alamar blue顯色法測(cè)定結(jié)核分枝桿菌對(duì)氧氟沙星的最小抑菌濃度，并與羅氏比例法進(jìn)行比較。

本研究結(jié)果顯示，以比例法作為金標(biāo)準(zhǔn)，氧氟沙星的耐藥閾值為2 μg/mL時(shí)，Alamar blue顯色法的靈敏度和特異度分別為88.6%和94.1%。王芝等人用微量液體培養(yǎng)基MIC快速法檢測(cè)220株結(jié)核菌發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異度分別為90.8%和96.5%[14]。而B(niǎo)actec MGIT960藥敏系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核菌的靈敏度和特異度分別介于71.2%～95.2%和91.5%～95.7%[15-16]。由此可見(jiàn)，Alamar blue顯色法可以較準(zhǔn)確的判斷結(jié)核菌株的藥物敏感性。此外，本方法既可以獲得結(jié)核菌株的藥敏檢測(cè)結(jié)果，還可獲得藥物的MIC值，從而了解菌株的耐藥水平高度，為指導(dǎo)臨床治療用藥提供細(xì)致可靠的依據(jù)。

結(jié)核分枝桿菌是一種慢速生長(zhǎng)菌，由此給結(jié)核病的快速診斷以及藥物敏感性的快速檢測(cè)帶來(lái)了保礙。目前WHO推薦的用于結(jié)核分枝桿菌喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性診斷的方法有羅氏培養(yǎng)基比例法和Bactec MGIT960藥敏系統(tǒng)，但羅氏培養(yǎng)基比例法獲得結(jié)果的平均時(shí)間為28 d，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本法需要的時(shí)間8 d，和Bactec MGIT960藥敏系統(tǒng)的10 d差不多[15]。而B(niǎo)actec MGIT960藥敏系統(tǒng)儀器及試劑價(jià)格昂貴，限制了其在中等及資源貧乏的國(guó)家和地區(qū)的應(yīng)用。然而本研究利用微孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備設(shè)施以及實(shí)驗(yàn)人員的生物安全知識(shí)要求較高，建議在螺旋蓋的培養(yǎng)管中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以提高安全性?？傊?，Alarmar blue顯色法是一種簡(jiǎn)便、敏感、快速、低廉的藥物敏感性檢測(cè)方法，可用于結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的快速檢測(cè)。

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s: Wan Kang-lin, Email: wankanglin@icdc.cn;LI Gui-lian, Email: LiguiLian@icdc.cn

Rapid determination on resistance of ofloxacin forMycobacteriumtuberculosiswith microplate alamar blue assay

ZHENG Yu-hong1,2,GUO Qian1,2,3,LI Chao1,2,4,WEI Jian-hao1,2,4, ZHAO Li-li1,2,JIANG Yi1,2,ZHAO Xiu-qin1,2,WAN Kang-lin1,2,LI Gui-lian1,2

(1.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 2.CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China; 3.PathogenicBiologyInstitute,SouthofChinaUniversity,Hengyang421000,China; 4.WenzhouMedicalCollege,KeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,Wenzhou325035,China)

We assessed the feasibility of microplate alamar blue assay for determining the ofloxacin resistance ofMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis). MIC of ofloxacin of 78M.tuberculosisisolates was determined by microplate alamar blue assay and the time of obtaining the results was recorded; receiver operating characteristic (ROC) curve was used to determine the resistant threshold value of ofloxacin, and compared to the conventional proportional method. Results showed that the resistant threshold value of ofloxacin was 2 μg/mL for microplate alamar blue assay, and compared to the gold standard proportional method, the sensitivity and specificity were 88.6% and 94.1%, respectively. And the time obtaining the results for microplate alamar blue assay was 8 days. Microplate alamar blue assay is simple, sensitive and rapid, and is a promising alternative method for rapidly determining the resistance of ofloxacin ofM.tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; ofloxacin; resistance; alamar blue assay

萬(wàn)康林，Email：wankanglin@icdc.cn； 李杜蓮，Email：LiguiLian@icdc.cn

1.傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，傳染病預(yù)防控制所，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心， 北京 102206； 2.感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003； 3.南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，衡陽(yáng) 421000； 4.溫州醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325035

Supported by the project of the National Key Program of Mega Infectious Disease (No. 2013ZX10003006-002-001)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.009

R378.91

A

1002-2694(2015)06-0537-04

2014-12-29；

2015-03-30

國(guó)家重大傳染病專(zhuān)項(xiàng)課題(No.2013ZX10003002-001)，(鄭玉紅，郭倩有同等貢獻(xiàn))