磷酸三2—氯乙基酯降解菌的降解條件優(yōu)化研究

摘要：采用H-1菌株降解有機磷系阻燃劑磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP），通過單因素試驗和正交試驗對降解條件進行優(yōu)化，得到TCEP的最佳生物降解條件：溫度為30 ℃、pH為7.0、培養(yǎng)時間為7 d、TCEP初始濃度為20 mg/L，此條件下TCEP的降解率達到最大，為86.00%。其中，溫度對TCEP降解的影響最大，其次是TCEP的初始濃度及pH，培養(yǎng)時間的影響最小。

關鍵詞：磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP）；H-1菌株；降解條件；降解率

中圖分類號：X172；X703 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1341-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.016

Abstract： Strain H-1 was used to degrade tris（2-chloroethyl）phosphate（TCEP） which belonged to organophosphorus flame retardants. The degradation conditions of TCEP were optimized with single factor experiment and orthogonal test. The results showed that the optimal temperature， pH， degradation time and initial concentration of TCEP 30 ℃，pH 7.0， 7 d and 20 mg/L， respectively. Strain H-1 degraded 86.00% of TCEP under these conditions. Temperature greatly affected the degradation rate of TCEP， followed by pH， the initial concentration of TCEP， and the degradation time.

Key words： tris（2-chloroethyl）phosphate （TCEP）； H-1 strain； degradation conditions；degradation rate

有機磷系阻燃劑中的磷酸酯類（Organophosphate esters，OPEs）具有良好的阻燃性能，與聚合物基材相容性好，耐水、耐熱以及耐遷移等特點，常作為電器、家具、紡織等材料中的添加型阻燃劑[1-4]。當前，含OPEs的產品在生產、使用以及廢棄回收處理過程中，OPEs極易從這些產品中逃逸揮發(fā)并進入周圍環(huán)境中，繼而擴散分布在各種環(huán)境介質中。目前，OPEs已是污水中的常見污染物，普遍認為污水處理廠（WWTPs）出水是地表水OPEs的主要來源[5-7]。在沒有明顯污染源的農業(yè)地區(qū)，地表水中的OPEs的污染主要源于覆蓋溫室大棚的塑料薄膜[8]，垃圾滲濾液中的OPEs是地下水甚至海水中OPEs的主要來源[8-10]。隨著溴系阻燃劑的禁用和限用，OPEs的產量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。由于OPEs具有明顯的毒理效應，環(huán)境中OPEs污染及風險評估已經成為環(huán)境領域的研究熱點。磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP）是最常用的一類磷酸酯，被廣泛應用于塑料生產行業(yè)[11]。目前有機磷系阻燃劑的主要處理方法是物理化學方法，但該方法成本高，易帶來二次污染問題。生物降解是消除環(huán)境中有機磷系阻燃劑的一種經濟有效且無二次污染的方法。本研究采用一株能夠以TCEP為唯一碳源的高效降解菌株H-1進行試驗，并對其降解條件進行優(yōu)化，以獲得最佳降解效率，為TCEP的生物修復技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 TCEP（97%，百靈威上海分公司），乙酸乙酯（AR，上海凌峰化學試劑有限公司）。

TCEP標準儲備液：以乙酸乙酯為溶劑將TCEP配制成濃度為1 000 mg/L的標準溶液。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基：葡萄糖3 g；（NH4）2SO4 1 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，F(xiàn)eCl2 0.01 g，MnSO4 0.01 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0。

富集培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，H2O 1000 mL，pH 7.0。

分離培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓滅菌25 min。

1.1.3 人工生活污水 葡萄糖0.6 g，無水乙酸鈉0.8 g，酵母提取物0.3 g，NH4Cl 0.283 g， K2HPO4·3H2O 0.07 g，KH2PO4 0.022 g，H2O 1 000 mL。

1.1.4 儀器 氣相色譜—質譜聯(lián)用儀（GC-MS，7890-5975，美國安捷倫公司），紫外可見分光光度計（UV-1800PC，上海美譜達儀器有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），SPH-2102C立式雙層搖床（上海世平儀器設備有限公司），DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），VS-840-1潔凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），pH計（上海精科雷磁有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的篩選 試驗菌種來自上海松東水環(huán)境凈化有限公司曝氣池中的污泥，該廠采用改良式序列間歇反應器（MSBR）工藝，曝氣池污泥顏色為黃褐色，沉降性能好，呈絮狀結構，pH約為7.0，其MLVSS/MLSS（混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度/混合液懸浮固體濃度）為0.40。

1）活性污泥的培養(yǎng)。將采集到的活性污泥不間斷曝氣3 d，靜置后去除上清液，然后加入等量配制的人工生活污水，其化學需氧量（COD）約為600 mg/L，按照序批式活性污泥法（SBR）工藝（進水、曝氣、靜置、排水、閑置）進行培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，開始向人工生活污水加入適量TCEP，使污水中TCEP濃度為0.001 mg/kg左右，培養(yǎng)1個月。

2）菌種的馴化。取培養(yǎng)后的活性污泥上清液1 mL于100 mL富集培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)。待培養(yǎng)基變渾濁后，取1 mL菌液于100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中TCEP的濃度為10 mg/L，使微生物以TCEP為惟一碳源在30℃、160 r/min條件下生長。7 d后，按1%的轉接量轉接培養(yǎng)液于新的TCEP無機鹽培養(yǎng)基中，在相同條件下梯度增加TCEP濃度，馴化培養(yǎng)兩個月，TCEP的最終濃度達到70 mg/L。

3）菌種的分離純化。取馴化后的最后一個周期的菌液適當稀釋后均勻涂布于無機鹽固體培養(yǎng)基（TCEP濃度為70 mg/L）平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)基上長出菌落后，觀察各菌落形態(tài)，并挑取形態(tài)清晰的單一菌落，于分離培養(yǎng)基上劃線分離，反復純化5～7次后編號標記。

4）菌種的初篩。將分離得到的菌株分別接種于無機鹽培養(yǎng)基（TCEP濃度為70 mg/L），于30℃、160 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，根據培養(yǎng)基的渾濁程度（OD600的大小）來判斷菌株利用TCEP的情況。挑選生長相對較旺盛的菌株，分別編號標記。

5）菌種的復篩。將初篩得到的菌株接種于富集培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min條件下?lián)u床擴大培養(yǎng)后，取適量菌液于6 000 r/min離心10 min，收集菌體并用生理鹽水洗滌菌體3次，最后以等體積的生理鹽水重懸，即得菌懸液。按2%的接種量將菌懸液接種于無機鹽培養(yǎng)基（TCEP濃度為70 mg/L）中，30 ℃、160 r/min條件下恒溫搖床培養(yǎng)。降解7 d后采用氣相色譜—質譜聯(lián)用法（GC-MS）測定培養(yǎng)液中TCEP濃度，挑選出降解效果較好的菌株并編號標記。

通過對活性污泥的培養(yǎng)、菌種的馴化、菌種的分離純化、菌種的初篩和復篩，最終得到7株以TCEP為惟一碳源的降解菌種H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-6、H-7，并將各個菌種保存于50%的甘油中備用。

1.2.2 菌懸液的制備 取1環(huán)保藏于甘油中的菌株直接在分離培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)2 d，然后挑取單菌落于富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，最后按照1.2.1中的5）將一定量的新鮮菌液配制成菌懸液備用。

1.2.3 TCEP 降解條件優(yōu)化 1）單因素試驗。本試驗選取不同的菌株、溫度、pH、時間及TCEP初始濃度這5個因素作為考察對象，分別研究各因素對TCEP降解效果的影響。各試驗均以TCEP為惟一碳源進行生物降解，其中試驗②③④⑤分別接種H-1菌株的菌懸液，試驗①②③⑤中無機鹽培養(yǎng)基中TCEP濃度為40 mg/L。①菌株：以2%的接種量將H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-6、H-7菌株的菌懸液接種到裝有100 mL無機鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中（后面錐形瓶試驗接種方法一致），pH 7.0、160 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)7 d。②溫度：分別在20、25、30、35、40、45 ℃溫度下，pH 7.0、160 r/min震蕩培養(yǎng)7 d。③pH：pH分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，160 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)7 d。④TCEP初始濃度：TCEP初始濃度分別為5、10、15、20、30、40、60 mg/L的富集培養(yǎng)基，pH 7.0、160 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)7 d。⑤時間：pH 7.0、160 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)9 d。分別測定試驗①②③④中第七天時TCEP的降解率，在試驗⑤中分別測定1、2、3、4、5、6、7、8、9 d時TCEP的降解率。每個單因素試驗設置3個平行，重復2次。

2）正交試驗。設置四因素三水平正交試驗考察溫度、pH、TCEP初始濃度及時間對H-1菌株降解TCEP的影響，因素水平表見表1所示。按照表1所示條件，各組試驗均按2%的接種量接種菌株H-1菌懸液，160 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)7 d，測定殘余TCEP含量，并計算其降解率。

1.2.4 樣品前處理 取降解液10 mL于分液漏斗中，依次用4、4、2 mL乙酸乙酯萃取15 min，合并3次萃取液。將萃取液過無水硫酸鈉小柱，然后經0.22 μm孔徑的尼龍膜過濾，最后采用GC-MS測定。

1.2.5 TCEP 濃度測定 TCEP濃度采用GC-MS法進行測定，分析條件如下：①氣相色譜條件。色譜柱：HP-5（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初溫90 ℃，以10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；載氣：高純氦氣，純度大于99.999%；恒流控制：1.0 mL/min；模式：不分流進樣；進樣量：1 μL；進樣口溫度：250 ℃。②質譜條件。離子源：EI，70 eV，溫度230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；接口溫度：270 ℃；溶劑延遲時間：5 min；掃描質量范圍：m/z 35～350 amu；TCEP的特征峰：11.73 min；特征離子：249，如圖1所示。

2 結果與分析

2.1 TCEP標準曲線

準確量取一定量的TCEP標準溶液，用乙酸乙酯配制成濃度為5、10、15、20、40、60、80 mg/L的TCEP溶液。采用GC-MS法分別測定各個濃度的TCEP 溶液，將測得的各濃度溶液相對應的峰面積（y）隨TCEP濃度（x）作圖，得到TCEP標準曲線，如圖2所示。從圖中可以看出，TCEP在5～80 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數r=0.998 3。標準曲線方程為y=5×106x-1×107。

2.2 TCEP降解條件優(yōu)化結果

2.2.1 不同菌株對TCEP降解效果的影響 不同菌株對TCEP的降解效果如圖3所示，從圖中可以看出7種菌株對TCEP的降解效果各不相同，其中H-1和H-2菌株能夠高效降解TCEP，降解率均在78%以上，H-1菌株的降解率高達80.25%。這可能是由于TCEP對其他5種菌株具有一定的抑制作用，導致TCEP利用率的降低。因此，本研究選擇菌株H-1作為試驗的降解菌株。

2.2.2 培養(yǎng)時間對TCEP降解效果的影響 菌株H-1對TCEP的降解效果隨時間的變化如圖4所示，從圖中可以看出1 d時TCEP的降解率即達64.14%；2～4 d時TCEP的降解率逐漸增大，4 d時降解率高達80.25%；5～7 d時TCEP的降解率緩慢增大，7 d時降解率為82.25%；8～9 d時TCEP基本不降解。因此，本研究選擇的TCEP降解時間為7 d。

2.2.3 溫度對TCEP降解效果的影響 微生物對TCEP的降解是借助相關酶的催化作用來完成的，而酶的活性只有在一定的溫度范圍內才能得以發(fā)揮[12]，因此溫度是影響TCEP降解的關鍵因素。由圖5可以看出，溫度對TCEP的降解有較大的影響，菌株H-1在20～45 ℃范圍內均可對TCEP進行降解。當溫度為20 ℃時， TCEP的降解率為82.35%；隨著溫度的升高其降解率也隨之升高，在25～30 ℃范圍內，TCEP的降解速度加快，降解率均高于83.17%，30 ℃時的降解效率達到最大，為83.92%；而當溫度超過30 ℃時，TCEP的降解效率反而減小，45 ℃時的降解效率最小，為78.68%。結果表明，溫度為30 ℃時菌株H-1對TCEP有較高的降解率，溫度過高或過低均不利于微生物對TCEP的降解，特別是當溫度高于30 ℃時，可能會引起部分胞外酶的失活，從而導致TCEP降解率的降低。

2.2.4 培養(yǎng)基初始pH對TCEP降解效果的影響 pH是影響微生物生長的一個重要環(huán)境因素，大多數異養(yǎng)菌和真菌喜好中性環(huán)境，因此pH過高或過低都會影響微生物的降解能力[13]。由圖6可以看出，pH為5.0～9.0時，菌株H-1對TCEP均有降解能力；pH為7.0時，TCEP的降解率達到最大，為81.75%；pH高于或低于7.0時，TCEP的降解率明顯下降。結果表明，H-1菌株在中性環(huán)境時對TCEP的降解效果最好，而環(huán)境偏酸或偏堿時，TCEP的降解效果變差。

2.2.5 初始濃度對TCEP降解效果的影響 微生物對污染物的降解率依賴于其自身對污染物的吸收、代謝及污染物的轉化程度[14]。污染物的濃度能夠影響微生物的活性，濃度過高會抑制微生物的活性，濃度低則不利于污染物的有效降解，但不同化合物產生抑制作用的濃度各不相同，某些情況下高濃度污染物卻能夠促進微生物的生長繁殖[15]。由圖7可以看出，H-1菌株對TCEP的降解率隨著TCEP濃度的增加而下降，這可能是由于TCEP對菌株的活性有一定的抑制作用造成的。當TCEP濃度較小時，其降解率較高；隨著TCEP濃度的增加，其降解率呈下降趨勢；當TCEP濃度超過30 mg/L時，菌株H-1對TCEP的降解率低于83.44%。結果表明，TCEP的初始濃度應控制在30 mg/L以內，此時有利于微生物對TCEP的降解。

2.3 正交試驗結果

首先分析因素A各水平對試驗指標的影響，A1的影響反映在試驗1、2、3中，A2的影響反映在試驗4、5、6中，A3的影響反映在試驗7、8、9中。由表2可知，kA1、kA2、kA3值均不相等，說明因素A的水平變動對試驗結果有影響。在表2中kA2>kA1>kA3，所以A2為因素A的優(yōu)水平。對于因素B、C、D，從表2中可以確定B1、C3、D2分別為因素B、C、D的優(yōu)水平。四個因素的優(yōu)水平組合為A2B1C3D2，即培養(yǎng)溫度為30 ℃，TCEP初始濃度為20 mg/L，時間為7 d，pH為7.0。

根據極差R的大小，可以判斷各因素對試驗指標影響的主次。R越大，表示因素的水平變化對試驗指標的影響越大，因素越重要。表2中RA>RD>RB>RC，因此各因素對試驗指標影響的主次順序為A、D、B、C，即溫度對TCEP的降解影響最大，其次是TCEP初始濃度和pH，時間的影響最小。

3 結論

單因素試驗結果表明：培養(yǎng)溫度對TCEP的降解有較大影響，30 ℃時其降解率達到最大值83.92%；pH為7.0時，菌株H-1對TCEP有較強的降解效果，而在偏酸或偏堿環(huán)境中，其降解效率均不及中性環(huán)境；培養(yǎng)降解7 d時，TCEP的降解率達到最大值82.25%，故選擇的培養(yǎng)降解時間為7 d；菌株H-1對TCEP的降解率隨TCEP濃度的增加而下降，TCEP濃度超過30 mg/L時TCEP的降解率低于83.44%，因此TCEP的初始濃度應控制在30 mg/L以內。

對菌株H-1的降解條件進行四因素三水平正交試驗表明：培養(yǎng)溫度為30 ℃，TCEP初始濃度為20 mg/L，時間為7 d，pH為7.0是TCEP降解的最佳條件，降解率最大為86.00%；其中溫度對TCEP降解率的影響最大，其次是TCEP初始濃度及pH，而時間的影響最小。

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