牛結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Ag85B的表達(dá)及納米疫苗的制備

摘要：以牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，MTB）C68001株基因組DNA為模板，克隆免疫優(yōu)勢(shì)抗原基因Ag85B，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ag85b，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。以明膠為佐劑，Ag85B為目的抗原制備納米疫苗，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的工藝檢測(cè)。以BCA法建立測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)納米疫苗的載藥率和包封率。結(jié)果顯示，明膠佐劑疫苗的載藥率為71.83%，包封率為41.03%，符合納米疫苗的工藝要求。

關(guān)鍵詞：牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，MTB）；Ag85B抗原；原核表達(dá)；納米疫苗

中圖分類號(hào)：R392.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）06-1421-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.035

Abstract： The immuno-dominant antigen gene Ag85B was cloned using the genomic DNA of Mycobacterium bovis strain C68001 as template and used to construct the recombinant plasmid pET-28a-ag85b， transformed into E. coli BL21（DE3）. Induced by IPTG， the expressed recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and Western blot method. The nano-vaccine was prepared using gelatin as adjuvant and Ag85B as objective antigen. The related technology was tested. Based on the protein standard curve obtained with BCA method. The drug loading and encapsulation efficiency of the nano-vaccine was 71.83% and 41.03%， respectively， metting the technological requirements of nano-vaccine.

Key words： Mycobacterium bovis（MTB）， Ag85B antigen， prokaryotic expression， Nano-vaccine

牛結(jié)核病是由牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，MTB）引起的一種牛的慢性消耗性傳染病，該病可通過病畜傳染給人類或其他動(dòng)物，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，并威脅人類的健康[1，2]。據(jù)2009年世界衛(wèi)生組織（WHO）的調(diào)查報(bào)告顯示，全球每年新發(fā)結(jié)核病病例為800萬～1 000萬，有近300萬的患者死亡[3，4]。目前，中國是世界上結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的22個(gè)國家之一，是除印度之外的世界第二大結(jié)核病危害的重災(zāi)區(qū)[5]。世界衛(wèi)生組織專家早就指出，除非消滅牛結(jié)核病，否則人類結(jié)核病的控制是不會(huì)成功的。可見，結(jié)核病不僅嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，造成了巨額的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重危害著人類的健康。因此，為了控制牛結(jié)核病的傳播流行，亟待開發(fā)牛結(jié)核病的新型診斷試劑和預(yù)防制劑?？ń槊纾˙CG）是目前公認(rèn)的預(yù)防結(jié)核病的惟一疫苗，但由于它的免疫保護(hù)效力不穩(wěn)定，對(duì)人群的保護(hù)率介于0～80%之間[6]。而對(duì)于牛來講，接種BCG后，會(huì)干擾牛結(jié)核菌素（PPD）的檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致不能區(qū)別人工免疫和自然感染，從而影響牛的檢疫和國際貿(mào)易。因此，為控制牛結(jié)核病的傳播流行，研制開發(fā)一種有效且高效的牛結(jié)核病新型疫苗迫在眉睫。

目前，亞單位疫苗雖然有副作用較小、可以明確組成成分等優(yōu)點(diǎn)，但其成本較高，而且加強(qiáng)免疫需要佐劑的輔助。重組BCG疫苗有生長緩慢、培養(yǎng)要求高、轉(zhuǎn)化率較低等缺點(diǎn)。應(yīng)用于DNA疫苗的載體有痘病毒載體和腺病毒載體，這些載體均屬于病毒類載體，雖然可有效地將外源基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，但仍然存在著潛在的安全問題。以病毒作為載體具有不可控制的細(xì)胞毒性、對(duì)于刺激所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的不可控以及缺乏區(qū)分感染細(xì)胞的能力等缺點(diǎn)，從而難于生產(chǎn)和包裝[7-9]。

由于納米粒子具有尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、靶向作用和釋緩藥物、延長藥物作用時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，利于刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。因而，納米疫苗的研制已成為生物技術(shù)領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)之一[11，12]。

本試驗(yàn)以明膠為載體材料，以卡波姆和Tween-80等為佐劑或表面活性劑，制備了載牛結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢(shì)抗原蛋白Ag85B的納米疫苗，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的工藝檢測(cè)，旨在為下一步研究其免疫原性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 牛結(jié)核分枝桿菌C68001株基因組DNA、BL21（DE3）菌株、質(zhì)粒載體pET-28a（+）由西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器 SpectraTM Multicolor Low Range Protein Ladder購于Thermo公司；Western BrightTM ECL購于環(huán)亞生物科技有限公司；Anti-His標(biāo)簽小鼠單克隆抗體、HRP-羊抗鼠IgG（H+L）、Protein Pure Ni-NTA Resin購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；IPTG購自陜西省西安化玻站化學(xué)廠；丙烯酰胺、N，N′-甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸胺購自華美生物工程有限公司；β-巰基乙醇、溶菌酶、考馬斯亮藍(lán)R250購自北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；TEMED購自Promega公司；明膠、大豆油購于新泰裕興生物科技有限公司；Tween-80、卡波姆購自SIGMA-ALDRICH公司；Ag85B特異性抗體購自Abcam公司；HRP-羊抗鼠IgG；凱基BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-4802型紫外可見分光光度計(jì)，UNIC公司；超聲破碎儀，UIBRA-CELL公司；Hitachi-7650B型電子透射顯微鏡（寧夏醫(yī)科大學(xué)）。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET-28a-ag85b的構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法和操作步驟構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-ag85b并對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-ag85b誘導(dǎo)表達(dá) 將陽性重組菌株接種于10 mL含有30 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.5～0.7時(shí)，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4～5 h，收集菌體。以同樣的方法誘導(dǎo)空載體pET-28a作為對(duì)照。

1.2.3 Ag85B重組蛋白SDS-PAGE 和Western blot分析 以pET-28a（+）空載體的轉(zhuǎn)化菌為空白對(duì)照，收集誘導(dǎo)表達(dá)過程中的各個(gè)樣品，在之后的冰浴超聲破碎離心后，分別收集上清液和包涵體沉淀，上樣于18%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE分析，以確定重組蛋白Ag85B 是否正確表達(dá)。電泳結(jié)束后用半干電轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h，洗滌后再與1∶1 000稀釋的特異性抗體在4 ℃條件下孵育過夜，洗滌后再與1∶6 000稀釋的HRP-羊抗兔IgG在37 ℃條件下孵育1 h，充分洗滌后，用Western BrightTM ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光曝光顯影。

1.2.4 Ag85B重組蛋白的純化

1）將過濾的鎳柱用Lysis buffer進(jìn)行平衡，之后加入Ag85B蛋白菌液，室溫下顛倒混勻2 h，混勻后靜置。

2）加入Wash buffer，所滴下的溶液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3）重復(fù)步驟2。

4）加入Elution buffer，所滴下的溶液-20 ℃保存?zhèn)溆?。Elution buffer根據(jù)其所含有的咪唑含量的不同分為3種溶液：即Elution buffer （250 mmol/L咪唑）、Elution buffer （500 mmol/L咪唑）、 Elution buffer （1 mol/L咪唑）。

5）將所收集的樣品進(jìn)行Western blot分析。

1.2.5 納米粒疫苗的制備 根據(jù)文獻(xiàn)資料總結(jié)，本試驗(yàn)采用的制備配方為明膠復(fù)合佐劑，制備步驟如下[14]：

1）將0.5 mL Tween-80加入6 mL大豆油中攪拌混勻，設(shè)為A液。

2）將目的抗原蛋白加入4 mL去離子水中進(jìn)行混合，之后加入0.35 g卡波姆，1.5 g明膠，攪拌混勻，設(shè)為B液。

3）將A液緩緩加入B液中，慢慢滴加，邊滴加邊攪拌，形成的乳液在水浴中超聲處理10～20 min。待明膠乳滴完全膠凝后，再用丙酮稀釋，用220 nm孔徑的濾膜進(jìn)行過濾，將過濾后的濾液保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，并繪制蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 載藥率和包封率的測(cè)定 將所制備的納米疫苗溶液用PBS緩沖液進(jìn)行透析處理，分別換液3次，第一次和第二次換緩沖液的時(shí)間間隔8 h，最后一次換緩沖液的時(shí)間間隔24 h。取已制備好的納米疫苗懸浮液1 mL，用1% HCI破壞微球，蒸餾水稀釋并定容至15 mL，之后調(diào)節(jié)pH至中性，按“1.2.6”的方法測(cè)定其OD540 nm值，換算得到載藥納米微囊中目的蛋白Ag85B的含量。計(jì)算納米粒的包封率和載藥率。計(jì)算公式如下：

包封率=納米粒中抗原含量/抗原投入量×100%

載藥率=（溶液中總抗原量-游離抗原量）/總抗原量×100%

1.2.8 穩(wěn)定性的檢測(cè) 將制備好的納米疫苗置4 ℃保存3個(gè)月，觀察有無凝結(jié)、沉淀。

1.2.9 納米疫苗的表征檢測(cè) 取一定量的納米疫苗懸浮液，加入0.9% NaCl溶液分散稀釋40倍。滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，濾紙吸干，自然晾干后在透射電子顯微鏡下觀察納米粒的表面形態(tài)，測(cè)量粒徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ag85B重組蛋白Western blot分析結(jié)果

以pET-28a（+）空載體的轉(zhuǎn)化菌為空白對(duì)照，收集誘導(dǎo)表達(dá)過程中的各個(gè)樣品，以特異性抗體，HRP-羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果（圖1）表明，誘導(dǎo)后的菌株、誘導(dǎo)后分離出的可溶性蛋白和包涵體蛋白均在33 ku左右出現(xiàn)了特異性陽性條帶，對(duì)照組空載體pET-28a在相同位置無相應(yīng)條帶，表明表達(dá)的重組蛋白Ag85B能與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，說明其具有良好的免疫原性。

2.2 Ag85B重組蛋白純化結(jié)果

由于重組蛋白Ag85B攜帶His標(biāo)簽，通過與鎳柱相結(jié)合，用含有的咪唑含量不同的3種洗脫液溶液（250 mmol/L咪唑、500 mmol/L咪唑、1 mol/L咪唑）分別進(jìn)行洗脫，進(jìn)而對(duì)洗脫液的濃度篩選出最適的條件，并對(duì)每一次所滴下的樣品進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果（圖2）表明，誘導(dǎo)后分離出的可溶性蛋白、過柱后的菌液、洗脫液（250 mmol/L咪唑）洗脫下的樣品和洗脫液（500 mmol/L咪唑）洗脫下的樣品均在33 ku左右出現(xiàn)了特異性陽性條帶，而洗液后所收集的樣品和洗脫液（1 mol/L咪唑）洗脫下的樣品在相同位置無相應(yīng)條帶。綜合分析后認(rèn)為洗脫液（250 mmol/L咪唑）為最適合的濃度，所洗脫下的重組蛋白Ag85B的表達(dá)量明顯高于誘導(dǎo)后分離出的可溶性蛋白。

2.3 納米粒的載藥率及包封率

2.3.1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按照“1.2.6”的方法，建立蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)得的OD540 nm值如表1所示。以O(shè)D540 nm值與對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度關(guān)系線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.011 8 x+ 0.146 4（R2=0.983 3）。結(jié)果表明在1～20 μg/μL濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與OD540 nm值之間有良好的線性關(guān)系（圖3）。

2.3.2 載藥率和包封率的測(cè)定結(jié)果 初始抗原投入量為200 mg，按照“1.2.7”的方法和公式測(cè)定載藥率和包封率，結(jié)果見表2。載藥率是衡量載體效率的重要指標(biāo)，由文獻(xiàn)結(jié)果顯示，藥物載體的載藥率一般為60%～85%，包封率一般為17.64%～56.84%[14]。由表2可見，所制備的明膠佐劑的納米疫苗載藥率和包封率的結(jié)果與文獻(xiàn)相一致。

2.4 納米疫苗穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

將所制備的納米疫苗在4 ℃靜置6個(gè)月，明膠納米疫苗為乳白色懸乳液，外觀無變化，無沉淀析出，表明其穩(wěn)定性好。

2.5 納米疫苗顆粒的表征

透射電子顯微鏡下觀察明膠復(fù)合佐劑納米疫苗的表面形態(tài)，由圖4可見，所制備的明膠復(fù)合佐劑納米疫苗顆粒粒徑均一，平均粒徑在100 nm左右。

3 小結(jié)與討論

目前，國內(nèi)外研究較多的結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢(shì)抗原蛋白主要有Ag85B復(fù)合物、CFP10、ESAT-6和MPB64等。研究發(fā)現(xiàn)，在牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌和BCG培養(yǎng)液中Ag85B含量豐富[15]。Ag85復(fù)合物參與菌體細(xì)胞壁的合成，對(duì)維持菌體的結(jié)構(gòu)起著重要作用[16]。研究表明，Ag85A和Ag85B可誘導(dǎo)特異性Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生及CTL反應(yīng)[17]。Horwitz等[18]研究表明，重組Ag85A或者重組Ag85B免疫豚鼠后，可有效地誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)Ag85B刺激健康人體后，外周血單個(gè)核細(xì)胞（Perpheral blood mononuclear cell， PBMC）有明顯增殖并提高分泌IFN-γ[19]。因此，Ag85B是開發(fā)新型抗結(jié)核藥物作用的靶位點(diǎn)[20，21]，也是開發(fā)新型疫苗的候選抗原。

本研究以明膠為載體材料，輔以卡波姆、Tween-80等佐劑或表面活性劑，采用納米技術(shù)制備了明膠佐劑配方的載牛結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢(shì)抗原蛋白Ag85B的納米疫苗，對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的工藝檢測(cè)。結(jié)果顯示，所制備的明膠納米疫苗為乳白色懸乳液，穩(wěn)定性好，4 ℃保存6個(gè)月外觀無變化，無沉淀析出。在疫苗中的顆粒通過透射電鏡觀察形態(tài)，并測(cè)量了粒徑。結(jié)果表明，疫苗顆粒粒徑均一，平均粒徑在100 nm左右，載藥率為71.83%，包封率為41.03%，為下一步研究制備成功的納米疫苗免疫原性的相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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