綿羊IGFBP—7基因的克隆及序列分析

摘要：試驗以涼山半細毛羊為研究對象，采用RT-PCR方法克隆了其IGFBP-7基因的CDS全序列，生物信息學方法深入分析其序列。結果表明，涼山半細毛羊IGFBP-7基因的CDS序列為846 bp，編碼282個氨基酸，與牛、人、鼠的CDS同源性分別為99%、95%、90%，氨基酸序列同源性分別為98%、93%、89%，GenBank登錄號為FJ589640.1；IGFBP-7基因的氨基酸分子質(zhì)量為29.0 ku，理論等電點（pI）為8.25；進化分析顯示其與牛、山羊等哺乳動物關系較近，與斑馬魚、鮑等親緣關系較遠；IGFBP-7基因的蛋白質(zhì)疏水性區(qū)域與親水性區(qū)域間隔較為均勻分布，有1個信號肽、 2個跨膜區(qū)、16個磷酸化位點、 4個N-糖基化位點和1個O-糖基化位點；二級結構分析顯示無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-折疊區(qū)域分別為64.89%、19.86%、15.25%；三級結構分析顯示存在IGFBP_N和Ig-like功能域。該試驗為進一步研究綿羊IGFBP-7基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：綿羊；IGFBP-7基因；克??；序列分析

中圖分類號：S826；Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1416-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.034

Abstract： The whole CDS sequence of IGFBP-7 gene was cloned from Liangshan semi-fine wool sheep and sequenced with RT-PCR and bioinformatics. The results showed that the CDS sequence of IGFBP-7 gene was 846 bp， encoding 282 amino acids. Its CDS homology with bovine， human and rat was 99%， 95% and 90%， respectively. The registry number in GenBank was FJ589640.1. Analysis of the amino acid sequence revealed that it was close to mammals such as cattle and sheep and far from Haliotis diversicolor， fish， etc. Its molecular weight was 29.0 ku， with the theoretical isoelectric point of 8.25. The hydrophobic and hydrophilic regions in IGFBP-7 gene distributed uniformly. It had a signal peptide， two transmembrane region，16 sites of phosphorylation， 4 sites of N-glycosylation and 1 sites of O-glycosylation. The analyses of secondary structure showed that the random coil， α-helix and β-sheet region were 64.89%，19.86% and 15.25%， respectively. It had IGFBP_N domain and a Ig-like domain. It will provide a scientific basis for further studying on the function of IGFBP-7 gene in sheep.

Key words： sheep；insulin growth factor binding protein-7 gene（IGFBP-7 gene）； clone； sequence analysis

胰島素樣生長因子結合蛋白7（IGFBP-7）是胰島素樣生長因子結合蛋白家族（IGFBPs）的成員之一，在不同物種的不同組織中發(fā)現(xiàn)，各自進行了命名，胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1（IGFBP-rP1）[1]、胰島素樣生長因子結合蛋白7（IGFBP-7）、MAC25[2]、腫瘤黏附因子（TAF）[3]和前列腺素刺激因子（PSE）[4]等都是同一種蛋白。在對其他物種的IGFBP-7的結構研究中發(fā)現(xiàn)，IGFBP-7有類似于IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6等高度保守的N端結構域，位于信號肽之后80～93個氨基酸殘基區(qū)域[5]，IGFBP-7的N端還含有整個氨基酸序列的18～20個半胱氨酸（Cys）中的12個，是高度保守的半胱氨酸富含區(qū)域，N端偶數(shù)個Cys形成的二硫鍵有利于維持IGFBPs三級結構的穩(wěn)定性[6]。

IGFBP-7基因的功能與IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6等基因一致，主要表現(xiàn)為IGF依賴和獨立于IGF的作用，在IGF信號通路中，IGFBPs、IGFs和IGF-1R的信號傳遞過程通過絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化激活作用最終開啟細胞內(nèi)MAPK激酶途徑和P13激酶途徑，實現(xiàn)細胞外信號向細胞內(nèi)轉導，進而來調(diào)控細胞活性、細胞分化、細胞增殖、細胞分裂、細胞遷移及蛋白質(zhì)合成的變化[5]。有關綿羊IGFBP-7基因的序列分析、單核苷酸多態(tài)性等報道較少。本研究以涼山半細毛羊為研究對象，克隆了其IGFBP-7基因的全CDS序列，利用生物信息學方法分析了CDS序列及相應的氨基酸序列，為進一步研究該基因在綿羊生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用以及標記的輔助選擇育種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以四川省涼山州布拖縣的涼山半細毛羊原種場的7～9月齡的涼山半細毛羊母羊為試驗材料，采用頸靜脈放血，宰殺后10 min內(nèi)收集肝臟組織，浸泡于Sample Protector（寶生物）試劑中，置放于液氮中保存，帶回實驗室于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計

參照NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的普通牛（Bos taurus）的IGFBP-7基因（NM_001102300）的mRNA序列，采用Prime 5.0軟件設計引物，Oligo 6.0進行引物評價，采用NCBI網(wǎng)站的Blast工具檢索比對以驗證引物特異性，IGFBP-7引物序列為F：5′-ACGCCATGGAGCGGCCGCTGC-3′，R：5′-TTA

CAGCTCAGCACCTTCACCTT-3′，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3 總RNA的提取

取涼山半細毛羊的肝臟組織約100 mg，迅速把組織放入預冷好的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至組織被研磨成粉末狀，采用RNA的Trizol提取法提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性，核酸蛋白檢測儀檢測RNA提取的濃度與純度，提取的RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR擴增

反轉錄反應按PrimeScript RT reagent Kit反轉錄試劑盒（TaKaRa公司）進行， 反轉錄反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s終止反應。以合成的第一條cDNA鏈為模板，以IGFBP-7基因的特異性引物進行PCR擴增，擴增體系為50 μL，擴增條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，62 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。

1.5 RT-PCR產(chǎn)物克隆

將回收的RT-PCR產(chǎn)物與PMD 18-T載體連接，載體與片段的摩爾比控制在1∶2～10，根據(jù)凝膠電泳或核酸蛋白儀檢測后的濃度及載體與片段分子大小來計算其摩爾比。輕輕渦旋離心管以混合內(nèi)容物，短暫離心，將混合反應液置于16 ℃水浴中過夜連接。用滅菌牙簽挑取單個白色菌落，接種于含有Amp的1.5 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日吸取1 μL菌液作模板，依據(jù)RT-PCR擴增體系和條件進行PCR鑒定，通過1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測目的條帶。據(jù)菌液PCR檢測結果，吸取含有目的條帶的1 mL菌液，送往Invitrogen公司測序。

1.6 生物信息學分析

將測序結果與測序峰圖結合進行校對，尋找基因的起始密碼子與終止密碼子，確定基因的編碼區(qū)序列。用NCBI的Blast服務器和Clustal W軟件進行序列的同源性分析。核酸序列與其他物種比對后，利用Expasy服務器（http：//au.expasy.org/tools/）相關軟件預測各個基因的氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點和氨基酸組成等，將序列提交到ExPASy ScanProsite、HNN、SWISS-MODEL服務器，預測蛋白質(zhì)的磷酸化位點、N-磷酸化位點、O-磷酸化位點、跨膜區(qū)、信號肽、疏水性、二級結構和功能域等。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取及RT-PCR擴增

從涼山半細毛羊的肝臟中提取到的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖疑膠電泳后可以清晰地觀察到3條帶。由圖1可見。以遷移率從大到小依次是5 S rRNA、18 S rRNA、28 S rRNA，28 S rRNA條帶亮度大約為18 S rRNA條帶的兩倍，5 S rRNA條帶亮度較低，總RNA樣品完整、降解較少、質(zhì)量良好。以涼山半細毛羊的肝臟組織的cDNA為模板，用IGFBP-7基因的引物擴增，得到的長度約850 bp，凝膠電泳檢測結果見圖2。

2.2 序列分析

根據(jù)正反測序進行校正，采用DNAMAN去除載體序列和尋找上下游引物序列，確定各個基因編碼氨基酸的CDS序列，IGFBP-7基因的完整CDS序列長度為846 bp，編碼282個氨基酸。利用NCBI中的Blast程序比對克隆的涼山半細毛羊IGFBP-7基因與近源物種的同源性，結果表明，涼山半細毛羊IGFBP-7基因與牛、人、鼠的CDS區(qū)的同源性分別為99%、95%、90%，氨基酸序列同源性分別為98%、93%、89%；同源性比對結果顯示克隆的序列為綿羊IGFBP-7基因的CDS序列，將PCR擴增得到的序列提交到NCBI，登錄號為FJ589640.1。

利用BioEdit軟件對此次試驗克隆得到的涼山半細毛羊IGFBP-7基因的CDS編碼區(qū)的堿基組成成分進行分析（圖3），其A、C、G和T等4種堿基組成含量分別為18.49%、31.45%、33.69%和16.37%，單鏈分子質(zhì)量為259.0 ku，雙鏈分子質(zhì)量為518.0 ku；氨基酸分子質(zhì)量為29.0 ku， 理論等電點（pI）為8.25。

2.3 IGFBP-7基因的分子進化

從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫下載牛、鼠、人、雞、斑馬魚和鮑等物種的IGFBP-7基因的氨基酸序列，用Mega 6.06軟件的Neighbor-Joining程序構建涼山半細毛羊IGFBP-7基因的分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），可見其IGFBP-7基因與其他物種的進化關系跟傳統(tǒng)的分類比較一致，綿羊與牛關系最近，最先聚合，隨著親緣關系的遠近逐步與豬、人、鼠、雞、斑馬魚和鮑聚合。

2.4 蛋白質(zhì)特性預測

2.4.1 疏水性分析 蛋白質(zhì)的疏水性分析采用ExPASy在線平臺的ProtScale程序計算綿羊IGFBP-7基因的疏水性圖譜。結果（圖5）表明，IGFBP-7基因的N段區(qū)域與C段區(qū)域，疏水性區(qū)域與親水性區(qū)域間隔較為均勻分布，因此，預測IGFBP-7基因與IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因的結合相對較弱。

2.4.2 信號肽分析 根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性分析，IGFBP-7基因的蛋白質(zhì)可能存在信號肽，將IGFBP-7基因的氨基酸序列提交到SignalP 3.0服務器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），結果（圖6）表明，IGFBP-7基因的蛋白質(zhì)的N段存在信號肽的概率為0.999，信號肽的長度為26個氨基酸殘基，切割位置為Ser-Ser之間。

2.4.3 跨膜區(qū)分析 聯(lián)網(wǎng)到“http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html”進行蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)預測。結果（圖7）表明，IGFBP-7基因存在3個跨膜區(qū)，剔除信號肽位置處的跨膜區(qū)，該基因存在兩個跨膜區(qū)，分別為98-114和169-192兩個位置處。

2.4.4 磷酸化和糖基化位點 利用NetPhos 2.0在線磷酸化位點預測服務器，對克隆的IGFBP-7基因的磷酸化位點預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）。結果（圖8）表明，IGFBP-7基因中共發(fā)現(xiàn)16個磷酸化位點，分別為Ser（12）、Thr（2）、Tyr（2）。

利用NetNGlyc1.0及NetOGlyc3.1服務器，對克隆的IGFBP-7基因的分子進行N-糖基化和O-糖基化位點預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）。結果（圖8）表明，IGFBP-7共有4個N-糖基化位點，分別位于171、194、215、252位置；有1個O-糖基化位點，位于155位置。

2.5 二級結構分析

利用HNN在線二級結構預測服務器，對IGFBP-7蛋白預測（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_nn.html）。結果（圖9）表明，IGFBP-7以無規(guī)卷曲為主，其次為α-螺旋，β-折疊最少。IGFBP-7的無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊區(qū)域分別占64.89%、19.86%、15.25%。

2.6 蛋白質(zhì)功能域預測及分析

將序列提交到ExPASy ScanProsite（http：//www.expasy.org/tools/scanprosite/）結構域分析數(shù)據(jù)庫，進行蛋白質(zhì)結構域的查找與分析。結果（圖10）表明，克隆的IGFBP-7基因的N端具有一個IGFBP_N功能域序列，位于28-114；在C端，IGFBP-7具有一個Ig-like（160-264）域，含有一個二硫鍵（181-248）。

3 小結與討論

蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙?；龋谒寺〉?個基因中，以在線預測存在大量的磷酸化和糖基化等修飾過程。磷酸化是通過蛋白質(zhì)磷酸化激酶將ATP的磷酸基轉移到蛋白質(zhì)的特定位點上的過程，大部分細胞過程實際上是被可逆的蛋白質(zhì)磷酸化所調(diào)控的，至少有30%的蛋白質(zhì)被磷酸化修飾[7，8]。磷酸化的作用位點為蛋白質(zhì)上的Ser、Thr和Tyr殘基，在磷酸化調(diào)節(jié)過程中，細胞的形態(tài)和功能都發(fā)生改變，可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程，如細胞信號轉導、腫瘤發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細胞的增殖、發(fā)育和分化等。在細胞信號轉導過程中，作為細胞信號的一些激素或細胞因子與細胞膜受體或細胞內(nèi)受體結合并被激酶激活，激素或信號因子隨著激酶的磷酸化也被磷酸化，引起細胞內(nèi)的信號效應。IGFBP-7蛋白共發(fā)現(xiàn)16個磷酸化位點、4個N-糖基化位點和1個O-糖基化位點。

IGFBP-7在保守的N-端區(qū)域存在12個Cys，形成6個二硫鍵，其二硫鍵是以相鄰的2個Cys依次而構成，形成IGFBP-7的第一亞域，在C-端的保守區(qū)域內(nèi)存在2個Cys，形成1個二硫鍵，構成第二亞域，在綿羊的IGFBP-7蛋白氨基酸序列的二硫鍵跟人的研究一致[9，10]，經(jīng)二硫鍵折疊形成穩(wěn)定、精細的IGFBP-7的球狀結構，保證了高級結構與IGFs結合的親和力。IGFBP-7的ACGCCXXC取代了GCGCCXXC序列[11]，取代了IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4和IGFBP-5等的GCGCCXXC序列，可能導致了IGFBPs與IGFs結合的差異。IGFBP-7在N-端都具有一個完整IGFBP_N功能域序列和一個Ig-like域。正因IGFBP-7具有的Ig-like域而表現(xiàn)出與IGFs較低的親和力，反而與胰島素具有較高的親和力。

參考文獻：

[1] YAMANAKA Y， WILSON E M， ROSENFELD R G， et al. Inhibition of insulin receptor activation by insulin-like growth factor binding proteins[J]. J Biol Chem，1997，272（49）：30729-30734.

[2] MURPHY M， PYKETT M J， HARNISH P， et al. Identification and characterization of genes differentially expressed in meningiomas[J]. Cell Growth Differ， 1993， 4（9）： 715-722.

[3] AKAOGI K， OKABE Y， FUNAHASHI K， et al. Cell adhesion activity of a 30-kDa major secreted protein from human bladder carcinoma cells[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1994， 198（3）： 1046-1053.

[4] YAMAUCHI T， UMEDA F， MASAKADO M， et al. Purification and molecular cloning of prostacyclin-stimulating factor from serum-free conditioned medium of human diploid fibroblast cells[J]. Biochem J， 1994， 303（2）： 591-598.

[5] HWA V， OH Y， ROSENFELD R G. The insulin-like growth factor-binding protein （IGFBP） superfamily[J]. Endocr Rev， 1999， 20 （6）：761-787.

[6] AKAOGI K， SATO J， OKABE Y， et al. Synergistic growth stimulation of mouse fibroblasts by tumor-derived adhesion factor with insulin-like growth factors and insulin[J]. Cell Growth Differ，1996，7（12）：1671-1677.

[7] FICARRO S B， MCCLELAND M L， STUKENBERG P T. Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae[J]. Nature Biotechnology，2002， 20（3）：301-305.

[8] KRUPA A， PREETHI G， SRINIVASAN N. Structural modes of stabilization of permissive phosphorylation sites in protein kinases：distinct strategies in Ser/Thr and Tyr kinases[J]. J Mol Biol，2004， 339（5）：1025-1039.

[9] NEUMANN G， BACH L. The N-terminal disulfide linkages of human insulin-like growth factor-binding protein-6（hIGFBP-6） and hIGFBP-1 are different as determined by mass spectrometry[J]. J Biol Chem，1999，274（2）： 14587-14594.

[10] HASHIMOTO R， FUJIWARA H， HIGASHIHASHI N， et al. Binding sites and binding properties of binary and ternary complexes of insulin-like growth factor-II（IGF-II）， IGF-binding protein-3， and acid-labile subunit[J]. J Biol Chem，1997， 272（44）： 27936-27942.

[11] HWAV，OH Y， ROSENFELD R G. The insulin-like growth factor-binding protein（IGFBP）superfamily[J]. Endocrine Reviews，1999， 20（6）： 761-787.