不同產(chǎn)地重樓的HPLC指紋圖譜研究

摘要：采用Sepax Gp-C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，以此測(cè)試條件分別測(cè)定了云南、四川、貴州、甘肅省出產(chǎn)的10批重樓（Rhizoma Paridis）藥材樣品HPLC色譜圖，以重樓HPLC 7號(hào)色譜峰為參照物，按照重樓HPLC指紋圖譜共有模式，建立了來(lái)自4個(gè)不同省產(chǎn)地10批重樓的HPLC指紋圖譜。通過(guò)相似度分析、聚類(lèi)分析和主成分分析方法，對(duì)不同產(chǎn)地重樓進(jìn)行鑒別研究。結(jié)果表明，10批重樓可以分為兩大類(lèi)，甘肅省的重樓單獨(dú)為一類(lèi)，其他3個(gè)省產(chǎn)地的重樓聚為另一類(lèi)。同時(shí)該HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快捷、重現(xiàn)性好，可用于重樓質(zhì)量控制，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)重樓產(chǎn)地的初步鑒別。

關(guān)鍵詞：重樓（Rhizoma Paridis）；HPLC指紋圖譜；相似度分析；聚類(lèi)分析；主成分分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949.71+8.23；R284.1；O21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）06-1407-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.032

Abstract： Sepax Gp-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm） column was used to establish HPLC fingerprints of ten batches of Rhizoma Paridis from four different habitats. The mobile phase was acetonitrile-phosphoric acid with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃. Detection wavelength was 210 nm. According to HPLC fingerprint patterns of the Rhizoma Paridis， No.7 peak was chosen as the internal reference peak， Hierarchical cluster analysis， similarity analysis and principal component analysis were used to identify Rhizoma Paridis from different regions. Results showed that 10 batches of Rhizoma Paridis were divided into two categories including Rhizoma Paridis from Gansu province and the other three origin of Rhizoma Paridis. The HPLC fingerprint was simple， reproducible and can be used for controlling polyphylla quality and determing the origin of Rhizoma Paridis.

Key words：Rhizoma Paridis； HPLC fingerprint； similarity analysis； hierarchical cluster analysis； principal component analysis

重樓（Rhizoma Paridis）為百合科（Liliaceae）重樓屬（Paris L.）植物云南重樓[P. polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand-Mazz.]或七葉一枝花[P. polyphylla Smith var chinensis（Franch.）Hara]等植物的干燥根[1]。重樓屬植物種類(lèi)繁多，我國(guó)有19種、10個(gè)變種，其根莖均可入藥，主產(chǎn)于云南、貴州、四川、廣西等省（自治區(qū)）[2]。重樓屬是多年生草本植物，根狀莖肉質(zhì)，呈團(tuán)塊狀圓柱形；作為中藥材，其藥用在中國(guó)有著悠久的歷史，自古以來(lái)就有許多關(guān)于它的記載。重樓性微寒，有小毒，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于癰瘡、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風(fēng)抽搐等病癥[3]，是著名中成藥云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧等的主要組分?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，重樓具有抗腫瘤[3-5]、免疫調(diào)節(jié)、止血、治療心血管疾病等廣泛的藥理活性[6，7]，因而極具研發(fā)價(jià)值，并受到廣泛關(guān)注。

近年來(lái)隨著對(duì)重樓需求量的急劇增加，野生重樓基源植物被大肆采挖，使得重樓資源日漸枯竭，逐漸成為瀕臨消亡的珍稀物種；同時(shí)市場(chǎng)上假重樓也不斷出現(xiàn)。為了擴(kuò)大重樓藥用基源，試驗(yàn)采用HPLC指紋圖譜法，對(duì)國(guó)內(nèi)4個(gè)不同省產(chǎn)區(qū)的10批重樓進(jìn)行質(zhì)量分析，通過(guò)指紋圖譜相似度比較和聚類(lèi)分析等方法區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)重樓，從而更科學(xué)地全面評(píng)價(jià)不同來(lái)源地重樓藥材的質(zhì)量及其真?zhèn)危瑸橹貥堑纳钊胙芯考捌鋺?yīng)用提供樣品鑒定和指紋信息，并為其質(zhì)量控制和擴(kuò)大藥用基源提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材料 試驗(yàn)共選取了云南、四川、甘肅及貴州省出產(chǎn)的共10批重樓藥材樣品，其樣品編號(hào)、來(lái)源地見(jiàn)表1。將不同產(chǎn)地的重樓藥材清洗干凈，于35 ℃烘干，粉碎后過(guò)60目篩，制成重樓藥材粉末，備用。

1.1.2 試劑 乙醇、甲醇和乙腈為色譜純；磷酸等其他試劑均為分析純；水為超純水（自制）。

1.1.3 儀器 主要有LC-2010A型高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器、四元泵溶劑淋洗系統(tǒng)和CLASS-VP色譜工作站（日本島津公司）；Mettler AE200型電子分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)條件選擇

1.2.1 提取溶劑 稱取S1重樓藥材粉末0.5 g，取4份，各置于具塞錐形瓶中，分別加入25 mL的乙醇、甲醇、70%甲醇、70%乙醇，都各自稱定重量（W），浸泡12 h后超聲提取60 min，放冷后再次稱重量，分別用乙醇、甲醇、70%甲醇、70%乙醇對(duì)應(yīng)補(bǔ)足減少的重量至W，過(guò)濾，將濾液水浴揮干，用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。然后用210 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)；色譜條件是色譜柱：Sepax Gp-C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）和0.05%磷酸（B）；洗脫程序：0～20 min，2% A；20～40 min，2%～5% A；40～80 min，5%～21% A；流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL；通過(guò)色譜分析確定提取溶劑類(lèi)型。

1.2.2 提取方法 以往重樓藥材中活性成分的提取方法主要有加熱回流提取法和超聲提取法，試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8，9]分別設(shè)置了加熱回流提取、直接超聲提取和浸泡12 h后超聲提取3種提取方法，即在加入提取溶劑后，用這3種方法分別提取、再進(jìn)行“1.2.1”的后續(xù)試驗(yàn)，通過(guò)色譜分析比較各方法的適合與否。

1.2.3 色譜分析的波長(zhǎng) 分別在203、210、220、240 nm波長(zhǎng)處對(duì)S1樣品進(jìn)行測(cè)定，比較各處理波長(zhǎng)對(duì)色譜分析結(jié)果的影響，從而確定試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)參數(shù)。

1.2.4 色譜流動(dòng)相 分別考察甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸溶液，甲醇-乙腈-水各流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)色譜分析結(jié)果的影響，從而確定試驗(yàn)的流動(dòng)相取舍。

1.3 供試品溶液制備

稱取各重樓藥材樣品粉末0.5 g，都置具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%乙醇，稱定重量（W1），浸泡12 h后超聲提取60 min，放冷后再次稱重量，用乙醇補(bǔ)足減少的重量至W1，過(guò)濾，將濾液水浴揮干，用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即作為供試品溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Sepax Gp-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.05%磷酸（B）；洗脫程序：0～20 min，2% A；20～40 min，2%～5% A；40～80 min，5%～21% A；流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm 。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1樣品供試溶液，在24 h內(nèi)每4 h測(cè)定1次，重復(fù)6次；以峰值最高的峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以考察試驗(yàn)方法的穩(wěn)定性能。

1.5.2 精密度試驗(yàn) 取S1樣品供試溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄100 min內(nèi)的圖譜。以峰值最高的峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以考察試驗(yàn)方法的精密程度。

1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1樣品，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，再測(cè)定指紋圖譜，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以考察試驗(yàn)方法的重復(fù)性能。

1.6 指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理

1.6.1 相似度分析 分別將10批重樓樣品的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A國(guó)家藥典委員會(huì)）軟件里，以生成的特征指紋圖譜共有模式為對(duì)照，計(jì)算各批次樣品的相似度，考察色譜峰的一致性。

1.6.2 系統(tǒng)聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析能夠揭示樣品之間的關(guān)系，繼而對(duì)樣品進(jìn)行分類(lèi)，從而能提供的圖譜信息比較多，可作為中藥指紋圖譜應(yīng)用于質(zhì)量控制的補(bǔ)充，這將在中藥材質(zhì)量控制及綜合評(píng)價(jià)分析中發(fā)揮作用。試驗(yàn)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，以相對(duì)峰面積為變量，對(duì)不同產(chǎn)地的10批重樓藥材做聚類(lèi)譜系圖，進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.6.3 主成分分析 采用SIMCA-P11.0軟件，以10批重樓中7個(gè)共有峰為變量進(jìn)行主成分分析，其中前兩個(gè)主成分的權(quán)重分別占總變異量的55.2%和34.5%（共計(jì)89.7%），取前2個(gè)主成分繪制主成分二維圖，以第一主成分值為橫坐標(biāo)、第二主成分值為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件的確定

2.1.1 提取溶劑 在乙醇、甲醇、70%甲醇、70%乙醇4個(gè)溶劑的色譜分析結(jié)果中，以采用70%乙醇提取的色譜峰數(shù)目較多，效果較好，所以試驗(yàn)采用70%乙醇作為試驗(yàn)的提取溶劑。

2.1.2 提取方法 在加熱回流提取，直接超聲提取和浸泡12 h后超聲提取3種提取方法的色譜分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)加熱回流提取和浸泡12 h后超聲提取方法能夠取得相同的效果，而且浸泡后超聲提取法更方便、安全。故選擇浸泡12 h后超聲提取法作為試驗(yàn)的提取方法。

2.1.3 色譜分析的波長(zhǎng) 在203、210、220、240 nm 4個(gè)波長(zhǎng)的色譜分析比較試驗(yàn)里，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)在203 nm處的基線漂移較嚴(yán)重；在210 nm處的基線稍穩(wěn)定，色譜峰較多，峰信號(hào)較強(qiáng)；而在220、240 nm處的基線雖然更平穩(wěn)，但峰個(gè)數(shù)較少，峰信號(hào)較弱。故確定210 nm作為試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4 色譜流動(dòng)相 在甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸溶液，甲醇-乙腈-水3個(gè)流動(dòng)相的色譜分析比較試驗(yàn)里，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相的各峰達(dá)到分離效果，色譜峰形較好，并且經(jīng)過(guò)多次反復(fù)試驗(yàn)得出了較理想的二元梯度洗脫條件，所以選擇乙腈-0.05%磷酸溶液作為試驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.2 重樓指紋圖譜的建立

分別取不同產(chǎn)地的重樓樣品S1～S10制成供試品溶液，按選定的測(cè)試條件，測(cè)定所有供試品的HPLC色譜圖（指紋圖譜），結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，HPLC色譜圖得到了若干個(gè)色譜峰，其中7號(hào)峰為重樓的主要指標(biāo)成分，因其在重樓中的含量較高且相對(duì)穩(wěn)定，故將其作為參比峰。將各色譜峰保留時(shí)間與同一圖譜中參比峰保留時(shí)間的比值作為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間；以相對(duì)保留時(shí)間定性，得到7個(gè)共有峰，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，共有峰的相對(duì)峰面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。從圖1、表2、表3可知，不同產(chǎn)地的重樓指紋圖譜存在較大的差異，其共有峰相對(duì)保留時(shí)間基本一致，但相對(duì)峰面積存在很大的不同，表明不同產(chǎn)地的重樓質(zhì)量之間存在相當(dāng)?shù)牟町?，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[10]。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 穩(wěn)定性 在試驗(yàn)條件下按穩(wěn)定性試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法測(cè)定重樓樣品S1的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果S1各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3.19%、相對(duì)峰面積的RSD均小于4.01%，S1的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD都小于5%，說(shuō)明供試品在測(cè)定的24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，顯示出試驗(yàn)采用的方法使樣品的穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度 在試驗(yàn)條件下按精密度試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法測(cè)定重樓樣品S1的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果S1各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3.03%、相對(duì)峰面積的RSD均小于3.99%，S1的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD都小于5%，說(shuō)明試驗(yàn)采用的供試品進(jìn)樣精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性 在試驗(yàn)條件下按重復(fù)性試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法測(cè)定重樓樣品S1的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果S1各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.55%、相對(duì)峰面積的RSD均小于4.07%，S1的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD都小于5%，表明試驗(yàn)采用的方法其重復(fù)性較好。

以上結(jié)果表明，試驗(yàn)得到的重樓HPLC指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差基本一致，相似度較高，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.4 指紋圖譜的數(shù)據(jù)分析

2.4.1 相似度分析 在中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件中計(jì)算10批重樓樣品的相似度，結(jié)果顯示，S1的相似度為0.968、S2為0.922、S3為0.589、S4為0.887、S5為0.836、S6為0.876、S7為0.564、S8為0.823、S9為0.678、S10為0.808。這個(gè)結(jié)果表明，10個(gè)不同產(chǎn)地的重樓總體上相似度較高，只有甘肅省的蘭州市、天水市重樓樣品（S3、S7）的相似度較低，說(shuō)明蘭州市、天水市所產(chǎn)重樓在特征指紋色譜峰的相對(duì)大小及非共有峰上與其他產(chǎn)地之間還存在明顯差別，也反映出不同產(chǎn)地的重樓受當(dāng)?shù)赝寥?、氣候和生態(tài)環(huán)境等的影響較大。

2.4.2 系統(tǒng)聚類(lèi)分析 10批重樓樣品的聚類(lèi)譜系圖見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，10批重樓可分為兩大類(lèi)，來(lái)自甘肅省的2個(gè)重樓樣品（S3、S7）可聚為一類(lèi)，其他3省（云南、四川、貴州省）的8個(gè)重樓樣品可聚為另一大類(lèi)。并且同一產(chǎn)地的重樓其樣品間的距離比較近，如貴州省的S5和S6、甘肅省的S3和S7其樣品間的距離都非常接近，云南省的S1、S4、S8、S10 4個(gè)樣品間的距離比較近，說(shuō)明貴州、甘肅、云南省的重樓質(zhì)量比較穩(wěn)定；而四川省的S2、S9樣品間距離偏遠(yuǎn)，說(shuō)明四川省的重樓間質(zhì)量差異較大，沒(méi)有明顯的地域特征。在不同產(chǎn)地方面，甘肅省所產(chǎn)重樓與其他產(chǎn)地的重樓距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明甘肅省的重樓與其他產(chǎn)地的重樓具有明顯的區(qū)別，在化學(xué)成分上差異較大。貴州省的重樓（S5、S6）與云南省的重樓距離較近，但也能夠區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明聚類(lèi)分析的結(jié)果能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)重樓產(chǎn)地的初步判斷。

2.4.3 主成分分析 采用SIMCA-P11.0軟件進(jìn)行主成分分析得到的結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，10批重樓根據(jù)距離遠(yuǎn)近可分為2個(gè)大區(qū)域，來(lái)自甘肅省的重樓S3和S7分布在第一主成分軸的靠左邊，與來(lái)自其他產(chǎn)地（云南，四川和貴州?。┑闹貥瞧x較遠(yuǎn)，可視為一類(lèi)；其他3個(gè)產(chǎn)地的重樓之間相距較近，可視為另一大類(lèi)，這與前面聚類(lèi)分析的結(jié)果是一致的。

3 討論

通過(guò)對(duì)云南、四川、貴州、甘肅4省10批的重樓HPLC色譜圖進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的重樓整體色譜峰峰形相似、相似度較高。但一些樣品在特征指紋色譜峰的相對(duì)大小及非共有峰上還存在明顯差異，說(shuō)明不同產(chǎn)地的重樓受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán)境等的影響較大；因此，為了保證中藥材、中藥生產(chǎn)中間體、中藥制劑等質(zhì)量的均一性、穩(wěn)定性和臨床用藥的安全性、有效性，必須對(duì)中藥材的品質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格控制。試驗(yàn)結(jié)果顯示，聚類(lèi)分析和主成分分析將不同產(chǎn)地的重樓分為了兩類(lèi)，其中來(lái)自四川、貴州、云南省的8批樣品聚為了一類(lèi)，甘肅省的2批樣品聚為了一類(lèi)。對(duì)云南、貴州、四川省的重樓進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)省產(chǎn)地的重樓也不能全部聚集在一起，只有云南省的4批重樓和貴州省的2批重樓能夠明顯區(qū)分開(kāi)，具有顯著的區(qū)域性，與產(chǎn)地歸屬相符合。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明重樓藥材的歸類(lèi)與產(chǎn)地有較大的關(guān)系，建議在臨床應(yīng)用中根據(jù)具體情況選用固定產(chǎn)地的重樓藥材。同時(shí)試驗(yàn)還可為建立易操作的、規(guī)范化的重樓指紋圖譜體系提供參考，并可為重樓的品質(zhì)評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)制定、GAP規(guī)范種植產(chǎn)地規(guī)劃和發(fā)展道地藥材生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

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