豬流行性腹瀉病毒S基因的克隆與鑒定

摘 要：試驗(yàn)利用軟件設(shè)計(jì)出兩條特異性引物，再通過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒S基因片段，然后將S基因片段連接到表達(dá)載體PMD18-T中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，提取重組質(zhì)粒，再經(jīng)過雙酶切鑒定和PCR鑒定，來(lái)證實(shí)提取的基因片段與預(yù)期目標(biāo)一致.本實(shí)驗(yàn)為以后建立豬流行性腹瀉快速診斷方法、基因免疫、以及豬流行性腹瀉病毒基因的進(jìn)一步的研究工作奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒； S基因；克隆；鑒定

PEDV具有冠狀病毒科的所有形態(tài)特征。從糞便中檢到的病毒粒子呈多形態(tài)，近似球形，其直徑（含纖突）約95 nm～190 nm，平均130 nm，纖突長(zhǎng) 18 nm～23 nm，規(guī)則地呈花瓣?duì)钆帕?。許多粒子有不透明的核心，由一半透明環(huán)與囊膜分開。

PEDV 亞基因組翻譯產(chǎn)生3種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別為S纖突糖蛋白、M膜蛋白和N核衣殼蛋白[1]，其中S蛋白（180 kDa～220 kDa）突出于病毒粒子外，在受體細(xì)胞結(jié)合吸附、膜融合等方面起者重要的作用，其也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的主要免疫原[2]。PEDV的S基因長(zhǎng)為4.15×103 bp， S基因的啟動(dòng)密碼子通常并不是用于啟動(dòng)蛋白質(zhì)的合成， 而是翻譯分子量 （Mr） 為151K的1 383個(gè)氨基酸的多肽， 該多肽含有29個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)的PEDV S基因大多數(shù)糖基化位點(diǎn)都具有生物學(xué)意義[3]。PEDV 的中和抗原發(fā)現(xiàn)存在于S基因的1495 bp～1914 bp之間[4]。中國(guó)1976年首次報(bào)道PED的發(fā)生[5]，現(xiàn)在PEDV已成為引起豬場(chǎng)仔豬死亡的重要病原之一，而且給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)其他冠狀病毒基因工程苗、核酸苗的研制已有了較大的進(jìn)展，而PEDV在此方面的研究比較滯后，而獲得PEDV免疫基因是研制此類疫苗的前提，我國(guó)雖然有不同毒株序列的克隆，但對(duì)其特性的報(bào)道很少，故對(duì)S基因進(jìn)行可克隆和蛋白特性分析，將為進(jìn)一步研制PEDV基因工程苗和S蛋白的結(jié)構(gòu)及功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1毒株

PEDV DX毒株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所傳染病研究室分離鑒定并保存。取凍存的病豬小腸刮取腸內(nèi)容物，-70 ℃保存以備用。

1.2 菌種與質(zhì)粒

E. coli JM109 菌株由蘭州獸醫(yī)研究所傳染病研究室保存；pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）公司。

1.3 主要試劑

RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Q-Gene公司；DL2000 DNA Marker、IPTG、X-gal、氨芐青霉素、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Premix Taq 酶、dNTP、DNA凝膠純化試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

25日齡健康仔豬，購(gòu)自蘭州養(yǎng)豬場(chǎng)。

1.5 儀器

PCR擴(kuò)增儀（MJ Rearch，PTC-150，USA）；2K15高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Sigma，USA）；低溫冷凍離心機(jī)（Hermler）；紫外凝膠成像儀（GeneGelius）；DYY-31A型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；高速微量離心機(jī)（Hettich）。

2 方法

2.1 病毒的增殖與收獲

將凍存的腸容物2 mL投服于25日齡以內(nèi)的健康小豬，當(dāng)其出現(xiàn)發(fā)病癥狀或死亡以后取小腸內(nèi)容物，5 000 r/min 離心，取上清于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病毒RNA的提取

利用RNeasy Mini Kit 試劑盒提取總RNA。具體操作按RNeasy Mini Kit 試劑盒說明書進(jìn)行。試驗(yàn)所用的離心管、槍頭、預(yù)先經(jīng)1 ‰ DEPC水處理（DEPC為焦碳酸二乙酯，Diethylpyrocarbonate），操作時(shí)應(yīng)戴手套。

（1）毒液350 μL （400 μL） 5 000 r/min 離心1 min。

（2）將上清液移入1.5 mL Eppendorf管中加RLT （1 000 μL RLT 加10 μL β-ME）350 μL（400 μL）混勻，4 ℃放置10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液。

（3）加700 μL（800 μL）70%乙醇（DEPC水配）輕混。

（4）取700 μL上述樣品于Mini柱中，12 000 r/min離心15 s，棄離心液，再將剩余樣品加入柱中，12 000 r/min離心30 s，棄離心液。

（5）加700 μL RW1洗液于柱中12 000 r/min離心15 s。

（6）更換離心管，加500 μL RPE洗液（提前用4倍無(wú)水乙醇配好）于MiNi柱中，12 000 r/min離心15 s。

（7）加500 μL RPE洗液于柱內(nèi)，12 000 r/min離心30 s。

（8）在1.5 mL Eppendorf 管中加1.5 μL RNasin（HPR），將MiNi 柱置于管中，向柱內(nèi)膜上加30 μL～50 μL RNase-free水，置30 s后，12 000 r/min離心1 min。

2.3引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中PEDV CV777株基因序列，應(yīng)用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)用來(lái)擴(kuò)增S基因的2對(duì)特異性引物（表1），由上海生工公司合成。

2.4 RT-PCR擴(kuò)增

以提取的病毒RNA為模板，分別以S1和S2相應(yīng)片段下游引物為反轉(zhuǎn)錄引物，按照常規(guī)方法合成cDNA。在0.5 mL的微量離心管中加入病毒RNA 6.0 μL 、下游引物1.0 μL，混勻，將微量離心管置于70 ℃水浴10 min，然后冰浴1 min，按順序依次加入以下試劑：

5×AMV Buffer 5.0 μL

dNTP Mix（2.5 mM） 4.0 μL

RNasin（50 U/μL） 1.0 μL

AMV （10U/μL） 1.0 μL

DEPC水 加至總體積到25.0 μL

將以上試劑混勻后點(diǎn)擊離心，42 ℃反應(yīng)1 h。置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取3 μL cDNA、上下游引物各1 μL加入到 25 μL的Premix Taq 中，最后用滅菌去離子水將終體積調(diào)至50 μL?；蛟?00 μL的擴(kuò)增管內(nèi)依次加入以下試劑：

10×PCR Buffer 5.0 μL

dNTP Mix（2.5 mM） 4.0 μL

MCl2（25 mM） 4.0 μL

cDNA 3.0 μL

Taq 酶 1.0 μL

上下引物各1.0 μL，最后加水至50 μL?；靹蚝笤赑CR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度見表2。

擴(kuò)增完畢后取5 μL于10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，并以標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker作為分子質(zhì)量參照物進(jìn)行分析。

2.5 PCR產(chǎn)物的純化回收

將待回收的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下所需目的片段，用DNA 片段回收試劑盒純化目的DNA片段：

（1）使用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

（2）在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減少凝膠體積，提高DNA回收率（切膠時(shí)請(qǐng)注意不要將DNA長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下）。

（3）切碎膠塊。膠塊切碎后，向膠塊中加入融化液DR-ⅠBuffer（600 μL～700 μL），均勻混合后75 ℃加熱融化膠塊（低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠只需在45 ℃加熱）。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6 min～10 min）。

（4）向上述膠塊融化液中加入DR-ⅠBuffer量的1/2體積量的DR-Ⅱ Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20 %的異丙醇。

（5）將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

（6）將上述操作步驟4的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，3 600 r/min離心1 min（如Spin Column中有液體殘留，可適當(dāng)提高離心速度，再離心1 min），棄濾液（如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA回收率）。

（7）將500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 3 600 r/min離心30 s，棄濾液。

（8）將700 μL的Rinse B加入Spin Column中， 3 600 r/min離心30 s，棄濾液。

（9）重復(fù)操作步驟（8），12 000 r/min再離心1 min.

（10）將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央加和適量的水或洗脫液（50 μL），室溫靜置1 min。12 000 r/min離心1 min洗脫DNA（把水或洗脫液加熱至60 ℃使用時(shí)有利于提高洗脫效率）。

2.6 連接反應(yīng)

按照順序在擴(kuò)增管中依次加入

pMD18-T Vector 1.0 μL

Solution I 5.0 μL

純化回收DNA 4.0 μL

輕輕混勻，16 ℃ 1h或4 ℃過夜，取出準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。

2.7 感受態(tài)細(xì)胞的制備

大腸埃希氏桿菌JM109由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所病毒室提供。按常規(guī)方法制備感受態(tài)細(xì)胞：

（1）取大腸桿菌菌種在LB平皿上劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜。

（2）挑取單菌落轉(zhuǎn)到含有100 mL LB的三角瓶中，于37 ℃振搖3 h（此時(shí)可取菌液加甘油于-70 ℃保存菌種）。

（3）培養(yǎng)物冰浴10 min或4 ℃作用1 h。

（4）將菌液移到一無(wú)菌、用冰浴冷卻的50 mL離心管中，4 ℃，4 000 r/mi離心10 min。

（5）倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

（6）加入0.1 M CaCl2 20 mL 重懸沉淀（先加1 mL用槍頭吹打，混勻后再加其余部分），冰浴45 min。

（7） 4 ℃，4 000 r/min離心10 min（離心完的沉淀散開呈U形較好）。

（8）棄上清，加入0.1 M CaCl2 2 mL 重懸沉淀（先加1 mL用槍頭吹打混勻后，再加入剩余量）。

（9）取200 μL 分裝于無(wú)菌的Eppendorf管中，封口，4 ℃過夜（12 h～14 h內(nèi)效果最好，3 d～4 d也能用）或加入終濃度為150 mL/L的甘油-70 ℃保存。

2.8 轉(zhuǎn)化

采用熱激法進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：

（1）將連接過夜的DNA質(zhì)粒，吸取5 μL加入制備好的4 ℃保存?zhèn)溆玫母惺軕B(tài)細(xì)胞中輕混，冰浴 30 min。同時(shí)取SOC或無(wú)氨芐LB置37 ℃水浴鍋。

（2）置42 ℃水浴90 s，嚴(yán)格控制時(shí)間，不可搖動(dòng)，不振蕩，然后快速移入冰水中3 min。

（3）加入37 ℃水浴預(yù)熱的LB（夏天早點(diǎn)取出） 800 μL（無(wú)氨芐）37 ℃搖培1 h，轉(zhuǎn)速220 r/min，不超過225 r/min。

（4） 4 000 r/min離心4 min。

（5）棄部分上清液，留約100 μL上清液重懸細(xì)菌。

（6）取AMPr平板，加入16 μL X-gal（50 mg/mL），4 μL IPTG（200 mg/mL），用彎玻璃棒（提前用酒精棉搽后酒精燈烘烤）均勻涂板，等稍干后倒置平板置 37 ℃溫箱過夜。

2.9 質(zhì)粒DNA的提取

以α-互補(bǔ)原理挑選在涂有X-gal和IPTG的LB瓊脂平板上挑選白色菌落，接種于含Ampr的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖培12 h～18 h后抽提質(zhì)粒。抽提質(zhì)粒用質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒進(jìn)行：

（1）取1 mL～4 mL的過夜培養(yǎng)液，12 000 r/min離心2 min，棄上清。

（2）用250 μL的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分懸浮細(xì)菌沉淀（注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器（Vortex）等劇烈振蕩使菌體懸?。?。

（3）加入250 μL的Solution Ⅱ輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5～6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液（此步驟不宜超過5 min）。

（4）加入400 μL的Solution Ⅲ，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5～6次，直至形成結(jié)實(shí)的凝集塊，然后室溫靜置2 min。

（5）室溫12 000 r/min離心5 min，取上清。

（6）將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

（7）將上述操作6的上清液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，3 600 r/min離心1 min（如Spin Column中有液體殘留，可適當(dāng)提高離心速度，再離心1 min），棄濾液。

（8）將500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 3 600 r/min離心30 s，棄濾液。

（9）將700 μL的Rinse B加入Spin Column中， 3 600 r/min離心30 s，棄濾液。

（10）重復(fù)操作步驟⑨，然后，12 000 r/min再離心1 min。

（11）將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入適量的水或洗脫液，室溫靜置1 min。

（12）12 000 r/min離心1 min洗脫DNA。

2.10 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將提取的重組質(zhì)粒DNA和空載體質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳篩選出陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性質(zhì)粒DNA進(jìn)行EcoRⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切，酶切體系為：

10×Buffer H 4.0 μL

EcoRⅠ 0.5 μL

Hind Ⅲ 0.5 μL

重組質(zhì)粒 8.0 μL

水 7.0 μL

37 ℃水浴2 h，電泳觀察結(jié)果。

2.11 重組質(zhì)粒PCR鑒定

取鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒 DNA 1 μL作為模板，按PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，電泳觀察結(jié)果。

2.12 組質(zhì)粒的核苷酸序列測(cè)定與分析

采用Sanger’s 雙脫氧末端終止法對(duì)經(jīng)酶切和PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。由寶生物（大連）工程有限公司完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAstar等軟件對(duì)PEDV DX 株S基因核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列與Genbank、EMBL和DDBJ中PEDV 其他毒株進(jìn)行同源性比較并繪制進(jìn)化樹，利用Protein Prediction在線軟件對(duì)PEDV DX株S蛋白進(jìn)行功能位點(diǎn)的分析，利用SOSUI在線軟件對(duì)其進(jìn)行跨膜分析，利用DNAstar Protein 不同方法對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和B淋巴細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 PEDV DX S基因的RT-PCR擴(kuò)增

分別用S基因的兩對(duì)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出了大小約為2 10 6bp和2 182 bp片段，與預(yù)期片段的大小相符（圖1）

3.2 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定

3.2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

將提取的重組質(zhì)粒與空載體DNA質(zhì)粒進(jìn)行電泳比較，選取陽(yáng)性質(zhì)粒。

3.2.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

以陽(yáng)性質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段（圖2）。

3.2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生了與空載體和目的片段（S2目的片段中有酶切位點(diǎn)將其切成兩段）大小相符的酶切片段（圖3）。

3.3 核苷酸序列的測(cè)定

陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析表明為TGEV的S基因序列，其片段大小為4 152 bp。

4 討論

豬流行性腹瀉（PEDV）是20世紀(jì)70年代在比利時(shí)、荷蘭、捷克、英國(guó)、匈牙利等歐洲國(guó)家新發(fā)現(xiàn)的豬的一種腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征。由于PED與豬傳染性胃腸炎（TGE）十分相似，直到1977年從病料中分離到致病因子類冠狀病毒，才確認(rèn)這是一種獨(dú)立的疾病，并建議稱作流行性腹瀉病毒[6]。1971年，在我國(guó)上海地區(qū)也發(fā)生了以新生仔豬高死亡率，各種不同年齡品種劇烈腹瀉為特征的傳染病，用各類抗生素和各種中西藥物治療都無(wú)濟(jì)于事，稱作疑似傳染性胃腸炎。1980年，用組織化學(xué)酶標(biāo)技術(shù)證實(shí)此流行性瀉病毒實(shí)質(zhì)為PED。PED在世界上分布很廣。我國(guó)發(fā)生的所謂TGE，證實(shí)很多屬于PED，對(duì)本病的研究也取得了重大進(jìn)展[7]。

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種以嘔吐、腹瀉和脫水等為主要特征的急性腸道傳染病。自發(fā)現(xiàn)本病以來(lái)，其傳播范圍極廣，而且發(fā)病率、死亡率居高不下，已成為全球危害最為嚴(yán)重的病毒性腹瀉病之一[8]。

本毒株是采在甘肅本地，對(duì)PEDV不同毒株克隆分析發(fā)現(xiàn)，不同毒株S基因的大小略有不同。英國(guó)株CV777和Br1/87、中國(guó)株JS-2004-2以及韓國(guó)株Chinju99 S 基因均為4152個(gè)堿基[9]，而韓國(guó)毒株登陸號(hào)為AF500215、AF237764兩株S基因?yàn)? 161個(gè)堿基[10]。實(shí)驗(yàn)表明PEDV DX株S 基因?yàn)? 152個(gè)堿基，推導(dǎo)氨基酸1 383個(gè)，編碼一個(gè)151611D的蛋白。同英國(guó)株CV777相比，在中和抗原區(qū)域DX株10個(gè)氨基酸發(fā)生了變異，分別是517位A-S，521位L-H，523位S-G，527位V-I，549位T-S，594位G-S，605位A-G，608位S-G，612位L-F，635位I-V?！酢?/p>

參考文獻(xiàn)：（10篇，略）