龍眼MEE70/MSI1基因DlMEE70—1a及其可變剪接體DlMEE70—1b的分離及其在體胚發(fā)生過程中的表達(dá)分析

盧秉國　練從龍　賴鐘雄

摘 要 MEE70/MSI1是擬南芥母性效應(yīng)胚胎滯育基因，在植物胚胎發(fā)生過程中具有重要作用。采用RACE技術(shù)獲得龍眼MEE70-1a（登錄號KC492117）及其可變剪接體MEE70-1b（登錄號KC492118）cDNA序列，克隆MSI1 gDNA（登錄號KC492126）序列。生物信息學(xué)分析預(yù)測DlMEE70-1a和DlMEE70-1b均為親水不穩(wěn)定的酸性蛋白，主要定位于過氧化物酶體和細(xì)胞核，各含有4和1個(gè)WD-repeat結(jié)構(gòu)域。MEE70-1a和MEE70-1b在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b表達(dá)趨勢以心形胚為界，除了DlMEE70-1b的不完全胚型緊實(shí)結(jié)構(gòu)（ICpEC）到球形胚（GE）階段之間，都表現(xiàn)出先降后升的趨勢；胚性愈傷組織（EC）時(shí)期兩者表達(dá)量一致且最高；心形胚（HE）時(shí)期，兩者表達(dá)量一致且最低，另DlMEE70-1b在不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（ICpEC）表達(dá)量與心形胚基本一致。這2個(gè)表達(dá)劑量是胚胎發(fā)生的重要保障，心形胚（HE）后，DlMEE70-1a被再次激活轉(zhuǎn)錄促進(jìn)胚胎正常發(fā)育。從DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的理化性質(zhì)、WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域數(shù)量、亞細(xì)胞定位以及表達(dá)量和趨勢，可以推測DlMEE70-1a需要DlMEE70-1b的協(xié)同來調(diào)控龍眼胚胎發(fā)育。

關(guān)鍵詞 龍眼；體胚發(fā)生；MEE70/MSI1；母性效應(yīng)；可變剪接；qPCR

中圖分類號 S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Gene Cloning of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b of MEE70/MSI1

from Embryogenic Callus and Their Expression Analysis During

Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.

LU Bingguo， LIAN Conglong， LAI Zhongxiong*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract MEE70/MSI1， a maternal effect embryo arrest gene in Arabidopsis， plays an important role in plant embryogenesis. In the present study， the full-length cDNA sequences of DlMEE70-1a gene（Accession number： KC492117）and its alternative splicing DlMEE70-1b（Accession number： KC492118）were obtained by RT-PCR combined with RACE techniques， while the gDNA sequence of MSI1 gene（Accession number： KC492126）was also obtained. Bioinformatics analysis indicated that both of the proteins encoded by DlMEE70-1a and DlMEE70-1b were of unstable hydrophilic and acidic proteins，mainly located in peroxisomes and the nucleus and containing 4 WD-repeat domains and 1 WD-repeat domain，respectively. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis demonstrated that， during the somatic embryogenesis， the expression levels of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b wre bounded at the stage of the heart-shaped embryo and displayed the trend of first-decreasing-then-rising， except for DlMEE70-1b during the period of development from the incomplete compact pro-embryogenic cultures to globular embryos. High expression of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b in the friable-embryogenic callus was important for embryogenesis，The transcription of DlMEE70-1a was activated after the heart embryo. It was interesting that DlMEE70-1a and DlMEE70-1b had the similar physical and chemical properties， the same subcellular localization and the similar expression levels and trends. Therefore， it was inferred that DlMEE70-1b was coupled with DlMEE70-1a， possessed the coordinated regulation during the embryogenesis of longan. This study provided some new clues to the elaboration of the molecular mechanism of maternal effect genes DlMEE70 in the process of somatic embryogenesis.

Key words Dimocarpus longan； Somatic embryogenesis； MEE70/MSI1；Maternal effect； Alternative splicing； qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.011

MEE（maternal effect embryo arrest）是Pagnussat 等[1]通過Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)篩選擬南芥雌性生殖缺陷突變體群，發(fā)現(xiàn)該突變體群自花授粉或授以野生型花粉，后代都有50%左右種子敗育，體現(xiàn)出母性效應(yīng)基因遺傳特征，遺傳分析確定MEE70和MSI1屬于同一基因。MSI1蛋白是WD40重復(fù)蛋白成員之一，一般只存在于真核生物，是保守的組蛋白綁定蛋白[2]。MSI1蛋白是染色質(zhì)排列因子CAF-1的亞基[3-5]，其還存在于RBR、CUL4-DDB1等多個(gè)染色質(zhì)修飾蛋白復(fù)合體，控制印記基因表達(dá)和關(guān)閉[6-7]。MSI1是多梳抑制蛋白復(fù)合體PRC2的亞基，在擬南芥中有3個(gè)類型PRC2，植物發(fā)育中起重要調(diào)控作用[8]。“非受精種子”FIS2- PRC2[9-10]阻止非受精的胚乳形成，抑制受精后胚乳和胚胎增殖；“春化”VRN-PRC2[11-12]和“萌發(fā)期開花”EMF-PRC2[13-15]都控制孢子體發(fā)育的各個(gè)方面，VRN-PRC2通過表觀修飾抑制FLC表達(dá)，促進(jìn)冷誘導(dǎo)開花；EMF-PRC2抑制重要開花調(diào)節(jié)因子FT和AG，抑制過早開花。

MSI1是自主開花基因之一，其蛋白參與SOC1染色質(zhì)的組蛋白H3K4雙甲基化和H3K9乙酰化的表觀修飾，導(dǎo)致SOC1高表達(dá)，從而促進(jìn)擬南芥適時(shí)開花[16]。擬南芥MSI1在上游調(diào)控開花促進(jìn)基因CO-FT途徑，能產(chǎn)生有效光周期反應(yīng)和誘導(dǎo)開花[17]。此外，MSI1還抑制擬南芥干旱脅迫反應(yīng)[18]。與MEE70突變體一樣，Kohler等[9]研究結(jié)果表明擬南芥T-DNA突變體msi1也表現(xiàn)出母性效應(yīng)遺傳特征，突變體在受精之前就啟動(dòng)胚乳發(fā)育，合子胚被二倍體的胚乳包圍，這可能導(dǎo)致胚胎敗育。MSI1轉(zhuǎn)基因共抑制植株AtMSI1-CS，MSI1表達(dá)量減少，胚珠發(fā)育被嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致雌性不育[19]。

龍眼（Drimocarpus longan Lour.）是無患子科的熱帶亞熱帶的特色水果，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，培育類似近緣屬荔枝焦核品種，是研究人員長期以來一直追求的目標(biāo)[20]。MEE作為母性效應(yīng)胚胎滯育基因，對于果樹胚胎和果實(shí)發(fā)育有非常重要意義，可為培育小核或無核的果樹品種奠定基礎(chǔ)。由于植物胚胎被胚珠包圍，早期胚胎很難被分離或觀察，必須借助顯微手段，研究難度較大，目前這個(gè)方面研究僅限于模式植物，在果樹或多年生木本植物上尚未見報(bào)道。對于培育龍眼這類水果的焦核品種，主要在于讓胚胎在早中期敗育，因此研究早中期胚胎的分子機(jī)制，對于龍眼育種有重要的意義。同步化調(diào)控的龍眼體胚發(fā)生體系是理想的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，它克服了合子胚基因型不一致，發(fā)育程度不一致，早中期活體胚胎難取樣等問題，因而它可以代替合子胚用來研究木本植物的胚胎發(fā)育[21]。因此，本研究采用龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)，結(jié)合龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行分離與擬南芥母性效應(yīng)基因同源的龍眼MEE70基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究其在龍眼體細(xì)胞胚發(fā)育各個(gè)階段的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)過同步化的龍眼（Dimocarpus longan Lour.）體胚發(fā)生不同階段的胚性培養(yǎng)物：松散型胚性愈傷組織（Friable embryogenic callus， EC）、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（Incomplete compact pro-embryogenic cultures， ICpEC）、球形胚（Globular embryos， GE）、心形胚（Heart embryos， HE）、魚雷形胚（Topedo embryos， TE）、早期子葉形胚（Early cotyledonary embryos， ECE），均來自紅核子品種LC2細(xì)胞系[21]；龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（SRR accession number：SRA050205）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA和DNA的提取及模板的合成 龍眼體胚發(fā)生6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的胚性培養(yǎng)物RNA提取采用Tripure Isolation Reagent（Roche）試劑盒；3′RACE、5′RACE和ORF模板cDNA合成采用GeneRacerTM Kit（Invitrogen）；實(shí)時(shí)熒光定量模板cDNA合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaLa）；龍眼基因組DNA提取采用改良CTAB法。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的MEE70片段設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE的2條正向和兩條反向基因特異引物分別與GeneRacerTM 3′Primer和GeneRacerTM 3′Nested Primer引物，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)擴(kuò)增3′端和5′端。將所獲得的序列片段進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物并擴(kuò)增MEE70的ORF。同時(shí)，以龍眼胚性愈傷組織的DNA為模板，用DlMEE70-1a的ORF引物PCR擴(kuò)增基因組序列。引物設(shè)計(jì)及序列分析采用DNAMAN6.0，引物委托華大基因公司合成。本研究中使用的引物見表1。

PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照賴呈純等[22]的方法，根據(jù)擴(kuò)增不同的目的片段，對PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。獲得目的片段后切膠回收，TA克隆后挑取陽性克隆子的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將有目的條帶的菌液送至華大基因公司測序。

1.2.3 DlMEE70生物信息學(xué)分析 DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列拼接和分析；GSDS在線軟件進(jìn)行內(nèi)含子和外顯子分析；ExPASy Protparam預(yù)測蛋白理化性質(zhì)；SignalP 4.1、EMBnet TMpred、PlantLoc預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽、跨膜區(qū)段和亞細(xì)胞定位；蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和功能區(qū)、二級及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分別使用NCBI-CDS和Prosite、SOPMA和SWISS-MODEL在線軟件；NetPhos 2.0在線軟件進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測；MEGA5.02（Neighbor-Joining）軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)檢測1 000次。

1.2.4 qPCR擴(kuò)增 本試驗(yàn)以6個(gè)不同發(fā)育階段的龍眼體胚為材料，采用TaKaRa SYBR ExScript試劑和羅氏LightCycler 480儀器，檢測DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的定量PCR試驗(yàn)，分析兩種轉(zhuǎn)錄本在龍眼體胚發(fā)生不同發(fā)育階段中的表達(dá)情況。qPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照Lin and Lai[23]的方法，首先以龍眼體胚6個(gè)不同發(fā)育階的cDNA混合模板樣進(jìn)行5 倍梯度系列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)，待反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增曲線、融解曲線（60～95 ℃）和凝膠電泳分析，檢測轉(zhuǎn)錄本DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的各自對應(yīng)引物DlMEE70-1a-qF/DlMEE-70-1a-qR和DlMEE70-1b-qF/DlMEE70-1b-qR特異性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Lin and Lai[23]建立的多基因內(nèi)參體系，以EIF4ɑ、EF-1ɑ和FSD三基因?yàn)閮?nèi)參，采用Excel和geNORM（version 3.5）[24]軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算DlMEE70-1a和DlMEE70-1b基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼DlMEE70 cDNA全長的擴(kuò)增及序列分析

經(jīng)過巢式PCR擴(kuò)增獲得DlMEE70的3′和5′兩端特異片段，測序結(jié)果表明：DlMEE70兩個(gè)帶有polyA尾巴的3′-RACE片段大小分別為1 088 bp和782 bp，兩者靠近5′端有518 bp相同堿基，有不同3′端片段； 5′-RACE片段大小為1 028 bp。初步判斷這是來自同一個(gè)基因的可變剪接體。經(jīng)DNAMAN6.0軟件拼接，5′-RACE片段和1 088 bp 3′-RACE片段，完全吻合，得到DlMEE70-1a cDNA全長為1 432 bp；5′-RACE片段和782 bp 3′-RACE 2個(gè)片段，5′端有在517 bp相同堿基，去掉不同5′-RACE 167 bp 3′端片段，加上3′-RACE 3′端264 bp，得到1個(gè)1 126 bp DlMEE70-1b cDNA。設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行cDNA序列拼接驗(yàn)證和DNA序列擴(kuò)增，測序結(jié)果顯示：DlMEE70-1a與DlMEE70-1b拼接驗(yàn)證的序列分別為1 361 bp和916 bp，核苷酸序列與拼接結(jié)果完全相同。

2.2 龍眼DlMEE70基因組序列擴(kuò)增及內(nèi)含子分析

經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得1條3 700 bp DlMEE70的基因組序列，測序結(jié)果表明：DlMEE70 gDNA全長為3 676 bp，它與DlMEE70-1a、DlMEE70-1b序列比對的結(jié)果如圖1所示，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b來源于同一個(gè)基因的可變剪接?；蚪M與DlMEE70-1a序列比對結(jié)果表明，基因組由6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子組成，其內(nèi)含子剪切位點(diǎn)符合真核生物GT-AG規(guī)則。外顯子的長度依次為376、327、153、122、96、224、63 bp；內(nèi)含子的長度個(gè)別波動(dòng)相對較大，分別為86、122、673、181、279、974 bp，內(nèi)含子3和6相對于其他內(nèi)含子，長度較長，占該基因組長度的18.3%和26.5%。DlMEE70-1b與基因組比對結(jié)果表明，DlMEE70-1b是由基因組第1、2和3個(gè)外顯子和部分第3個(gè)內(nèi)含子序列組成，第3個(gè)內(nèi)含子應(yīng)含有1個(gè)弱終止子信號，終止了基因的轉(zhuǎn)錄。

2.3 龍眼胚性愈傷組織DlMEE70基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析 ExPASy ProtParam預(yù)測結(jié)果表明，DlMEE70-1a蛋白由430個(gè)氨基酸組成，分子式為C2185H3325N587O679S16，總原子數(shù)為6 792，相對分子質(zhì)量為49 193.9；由 20種氨基酸組成，其中以亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最豐富為39個(gè)，比例達(dá)到9.1%，其次是天冬氨酸（Asp）占8.4%；該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為48.42，總平均疏水性為-0.541，所帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu）和正電的氨基酸（Arg+Lys）數(shù)分別為75和39個(gè)，理論等電點(diǎn)為4.75 ；而DlMEE70-1b由DlMEE70-1a N端前 276個(gè)氨基酸和另外2個(gè)氨基酸組成，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為46.71，總平均疏水性為-0.509，帶正、負(fù)電的氨基酸數(shù)分別為45和27個(gè)，理論等電點(diǎn)為5.02。綜上分析，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b都是不穩(wěn)定的、親水的酸性蛋白質(zhì)，它們的理化性質(zhì)相近，可能參與類似的代謝反應(yīng)。

SignalP 4.1、EMBnet TMpred和PlantLoc預(yù)測結(jié)果表明，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b不屬于分泌蛋白或者跨膜蛋白，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b主要定位于過氧化物酶體和細(xì)胞核，也有可能定位于葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡（圖2）。

2.3.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征分析 NCBI-CDS在線分析DlMEE70-1a保守結(jié)構(gòu)域，該蛋白存在CAF1C_H4-bd和WD40保守結(jié)構(gòu)域，并分別屬于CAF1C_H4-bd和WD40超家族（圖3）。通過Prosite進(jìn)一步分析，該蛋白存在4個(gè)WD重復(fù)單元的蛋白，分別位于174-216、269-304、312-354和369-403（圖4）。而DlMEE70-1b蛋白僅保留CAF1C_H4-bd結(jié)構(gòu)域和1個(gè)位于174-216的WD結(jié)構(gòu)域。

通過SOPMA對DlMEE70-1a的二維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，如圖5所示DlMEE70-1a蛋白由16.05%的α-螺旋，29.30%的延伸鏈，4.88%的β-轉(zhuǎn)角和49.77%的隨機(jī)卷曲組成。延伸鏈和不規(guī)則盤繞是DlMEE70-1a蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件，而α-螺旋主要分布在蛋白質(zhì)N端和C端，β轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

通過軟件SWISS-MODEL的Automated Model進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，DlMEE70-1a與果蠅CAF1組蛋白綁定蛋白[25]的氨基酸相似性高達(dá)65.66%，因而以它的結(jié)晶體結(jié)構(gòu)為模型構(gòu)建DlMEE70-1a三維結(jié)構(gòu)（圖6），從圖上可見，DlMEE70-1a螺旋卷曲主要存在于蛋白N端和C端，之后均由不規(guī)則盤和延伸鏈貫穿整體，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相符。DlMEE70-1b具有DlMEE70-1a的靠近N端部分二級結(jié)構(gòu)，在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)折疊的蛋白高級結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步確定。

2.3.3 氨基酸磷酸化修飾預(yù)測 經(jīng)NetPhos 2.0分析，結(jié)果如圖7所示，DlMEE70-1a存在21個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，分布于整條多肽鏈中，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)數(shù)分別是11、3和7，DlMEE70-1b只擁有靠近DlMEE70-1a N端7個(gè)絲氨酸和6個(gè)酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)數(shù)，龍眼DlMEE70-1a和DlMEE70-1b豐富的磷酸化位點(diǎn)意味著它們可參與生物體內(nèi)多種代謝途徑反應(yīng)，它們可能擁有多種功能。

2.4 龍眼胚性愈傷組織DlMEE70-1a基因編碼的蛋白質(zhì)同源性和進(jìn)化分析

同源序列比對結(jié)果顯示，DlMEE70-1a氨基酸序列與原始生物藻類植物的團(tuán)藻、萊茵衣藻和蕨類植物江南卷柏相似性分別為65.51%、65.05%和72.23%；與裸子植物北美云杉、玉米、水稻和擬南芥相似性分別為80.74%、80.32%、81.38%和81.21%；與同源物種荔枝的同源性更是高達(dá)98.60%。該基因與其他物種氨基酸具有高度同源性，說明基因功能在進(jìn)化中的保守性。

采用Mega5.02近鄰相接法NJ分析15個(gè)不同物種的MEE70進(jìn)化樹，如圖8所示，其中原始生物藻類和蕨類被歸為一類，裸子植物北美云杉與被子植物被分開歸類，被子植物的單子葉植物和雙子葉植物各歸為一類。此外，同為無患子科的龍眼與荔枝被歸為一類。因此，從該進(jìn)化樹上可以看出，該基因的進(jìn)化符合經(jīng)典的物種進(jìn)化過程。

2.5 龍眼體胚發(fā)生過程DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的表達(dá)模式分析

DlMEE70-1a和DlMEE70-1b實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果如圖9所示，DlMEE70-1a在體胚發(fā)生過程的表達(dá)總趨勢為先降后升，從胚性愈傷組織（EC）、不完全胚型緊實(shí)結(jié)構(gòu)（ICpEC）、球形胚（GE）和心形胚（HE），表達(dá)量均逐漸下降，呈平穩(wěn)下降趨勢；從心形胚（HE）到魚雷形胚（TE）階段，呈明顯上升趨勢；從魚雷形胚（TE）到早期子葉型胚（ECE）階段，其表達(dá)量沒有明顯變化。DlMEE70-1b在體胚發(fā)生過程表達(dá)量波動(dòng)較大，其在EC最高急劇下降，至ICpEC最低，呈急劇下降趨勢；ICpEC到GE階段，表達(dá)量呈上升趨勢；從GE到HE階段呈現(xiàn)下降趨勢，HE表達(dá)量與ICpEC基本一致；從HE到TE階段，表達(dá)量沒有明顯變化；從TE到ECE階段，表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上升趨勢。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b表達(dá)趨勢以HE為界，除了DlMEE70-1b的ICpEC到GE這個(gè)階段，都表現(xiàn)出先下降，而后上升的趨勢。除了ICpEC和TE，通過DlMEE70-1b與DlMEE70-1a表達(dá)量在其他4個(gè)時(shí)期相對表達(dá)量基本一致，且兩者在EC相對表達(dá)量最高。

3 討論

3.1 DlMEE70基因可變剪接

可變剪接是用不同方式剪接pre-mRNA產(chǎn)生各種各樣的mRNA，在多細(xì)胞真核生物中廣泛存在。在模式植物擬南芥的多個(gè)器官有41%～60%的多外顯子基因存在可變剪接體，內(nèi)含子駐留是擬南芥可變剪接顯著特征[26]，其中65%內(nèi)含子駐留出現(xiàn)部分開放閱讀框，在非翻譯區(qū)或者最后一個(gè)內(nèi)含子，它們不參與NMD無義介導(dǎo)的衰變[27]。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b來自同一條基因組，與DlMEE70-1a基因相比，DlMEE70-1b插入第3個(gè)部分內(nèi)含子，使基因轉(zhuǎn)錄提前終止，開放閱讀框變短，它不參與NMD無義介導(dǎo)的衰變。DlMEE70-1b在龍眼植株中表達(dá)情況，有助于進(jìn)一步了解可變剪接功能。

3.2 生物信息學(xué)推測DlMEE70蛋白可能作用機(jī)制

DlMEE70-1a和DlMEE70-1b主要定位于過氧化物酶體和細(xì)胞核，也有可能定位于葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡。過氧化物酶體發(fā)生或功能的缺陷，會(huì)導(dǎo)致種子不能萌發(fā)、植株矮小、胚胎敗育[28]。DlMEE70或過氧化酶體都與胚胎發(fā)育相關(guān)，兩者之間通過何種途徑來調(diào)控胚胎發(fā)育還有待進(jìn)一步的研究。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b各具有4和1個(gè)WD結(jié)構(gòu)域，而擬南芥MEE70具有5個(gè)WD結(jié)構(gòu)域，這意味著DlMEE70-1a需要DlMEE70-1b協(xié)同互作。龍眼DlMEE70可參與多種細(xì)胞器代謝，而擬南芥MEE70主要定位于細(xì)胞核和葉綠體， 龍眼DlMEE70應(yīng)具有更復(fù)雜的代謝途徑和功能。

3.3 DlMEE70-1a和DlMEE70-1b在龍眼體胚發(fā)生過程中的協(xié)同互作

MEE70作為母性效應(yīng)基因之一，在體胚發(fā)生過程中的調(diào)控起著重要的作用。擬南芥msi1敗育胚胎中MEE70基因僅在雌配子體形成過程轉(zhuǎn)錄，支撐后期的受精卵和合子胚發(fā)育。擬南芥msi1敗育胚胎有36%停滯在球形胚前或者球形胚，有50%停滯在心形胚，只有少數(shù)心形胚繼續(xù)分裂增殖而不進(jìn)行分化，說明MEE70具有調(diào)控胚胎細(xì)胞的分裂和分化的功能，尤其是細(xì)胞的分化[2，9]。儲(chǔ)備于卵細(xì)胞中MEE70 mRNA及其蛋白，基本上能滿足合子胚生長發(fā)育到心形胚，心形胚之后必須重新啟動(dòng)MEE70基因轉(zhuǎn)錄，才能維持胚胎的生長發(fā)育。龍眼DlMEE70-1a與擬南芥MEE70在胚胎發(fā)育表達(dá)趨勢一致，具有典型的母性效應(yīng)基因特點(diǎn)，是調(diào)控龍眼胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因。

DlMEE70-1b和DlMEE70-1a兩者在4個(gè)時(shí)期相對表達(dá)量基本一致，且DlMEE70-1b不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)表達(dá)量最低與DlMEE70-1a在心形胚最低表達(dá)量基本一致，暗示這個(gè)劑量DlMEE70基因濃度是龍眼體胚發(fā)生過程能忍受最低極限濃度；當(dāng)DlMEE70-1b和DlMEE70-1a比例濃度不一致，轉(zhuǎn)錄機(jī)制就會(huì)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄DlMEE70-1b，使其達(dá)到DlMEE70-1a一致的比例濃度，這都暗示DlMEE70-1b協(xié)同DlMEE70-1a調(diào)控龍眼胚胎發(fā)育。與DlMEE70-1a平穩(wěn)下降不同，DlMEE70-1b從胚性愈傷組織最高點(diǎn)急劇下降到不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)階段最低點(diǎn)，可以推測DlMEE70-1b還具有其他功能。

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