利用SPME—GC×GC/TOFMS對(duì)香草蘭中揮發(fā)、半揮發(fā)性成分萃取與分析研究

谷風(fēng)林　董智哲　徐飛　趙建平

摘 要 利用固相微萃?。⊿PME）法萃取香草蘭中揮發(fā)和半揮發(fā)性的成分，再結(jié)合全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC/TOFMS）技術(shù)進(jìn)行定性分析。試驗(yàn)共鑒定出香草蘭中181種揮發(fā)、半揮發(fā)性化合物，其中含量較高的成分主要有香蘭素、呋喃甲醛、（2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇、鄰甲氧基苯酚、2，3-丁二醇、苯酚、正己醛、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、對(duì)羥基苯甲醛、3-甲基丁酸、2，3，5，6-四甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮、香草酸、壬醛、正己酸、1-辛烯-3-酮。結(jié)果表明，GC×GC/TOFMS高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)非常適合復(fù)雜組分體系的定性分析。

關(guān)鍵詞 香草蘭；全二維氣相色譜；飛行時(shí)間質(zhì)譜

中圖分類號(hào) TQ651 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Analysis of Volatile and Semi-volatile Compounds in Vanilla Using

Solid Phase Micro-Extraction-Comprehensive Two

Dimensional Gas Chromatography/Time of

Flight Mass Spectrometry

GU Fenglin1，3， DONG Zhizhe2， XU Fei1，3， ZHAO Jianping1，3 *

1 Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural， Wanning， Hainan 571533， China

2 College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

3 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan

571533， China

Abstract Volatile and semi-volatile compounds in vanilla were extracted by using solid phase micro-extraction and were identified by comprehensive two-dimensional gas chromatography/time of flight mass spectrometer. A total of 181 volatile or semi-volatile compounds in vanilla were identified and compounds with high content were vanillin， 2-furancarboxaldehyde，[S-（R*，R*）]-2，3-butanediol， 2-methoxy-phenol， 2，3-butanediol， phenol， hexanal， [R-（R*，R*）]-2，3-butanediol， 4-hydroxy-benzaldehyde， 3-methyl-butanoic acid， tetramethyl-pyrazine， 3-hydroxy-2-butanone， 4-hydroxy-3-methoxy-benzoic acid， nonanal， hexanoic acid， 1-octen-3-one.The results showed that GC×GC/TOFMS with high resolution and sensitivity is suitable for the identification of complex system.

Key words Vanilla； Comprehensive two-dimensional gas chromatography； Time of flight mass spectrometer

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.031

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）是著名熱帶植物，原產(chǎn)于墨西哥，現(xiàn)已引種至中國、馬達(dá)加斯加、科摩羅、印度尼西亞、烏干達(dá)、印度等地區(qū)。香草蘭因其獨(dú)特的香味而聞名，作為增香劑廣泛用于食品、冰激凌、化妝品等行業(yè)[1-2]，因此其也被認(rèn)為是最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蘭科植物[3]。目前香草蘭香味成分的研究報(bào)道較多。Adedeji等[4]利用直接熱力解析法鑒定出香草蘭中61種成分；Perez-Silva[5]利用溶劑萃取法鑒定出墨西哥地區(qū)香草蘭中65種揮發(fā)性成分；Toth[6]對(duì)波旁、塔西提島、烏干達(dá)和印度尼西亞地區(qū)的香草蘭中進(jìn)行鑒定比較；Brunschwig等[7]利用同時(shí)蒸餾萃取法萃取塔西提島香草蘭中96種揮發(fā)性成分。

前人采用不同的萃取方法對(duì)香草蘭中揮發(fā)性或半揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取，但定性方法均為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）。全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC/TOFMS）能克服傳統(tǒng)單柱氣相色譜對(duì)多組分樣品分離能力相對(duì)較差的問題，具有分辨率高、靈敏度高等特點(diǎn)，在分析復(fù)雜體系樣品中的應(yīng)用越來越廣泛[8-10]。

香草蘭揮發(fā)性成分具有組分多、難分離的特點(diǎn)，因此可借助GC×GC/TOFMS技術(shù)對(duì)香草蘭中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，而目前暫未見相關(guān)報(bào)道，因此本研究在前期研究的基礎(chǔ)上將固相微萃取技術(shù)（SPME）與GC×GC/TOFMS技術(shù)相結(jié)合，對(duì)中國海南地區(qū)香草蘭中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 香草蘭由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供

1.1.2 設(shè)備儀器 手動(dòng)固相微萃取裝置、CAR/PDMS（75 μm）纖維頭（美國SUPELCO公司）；全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀由Agilent 6890N（美國安捷倫公司）和配備有Pegasus4D工作站的TOFMS（美國LECO公司）組成。

1.2 方法

1.2.1 固相微萃取 萃取條件參照董智哲等[11]報(bào)道的方法。

1.2.2 全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析 色譜柱：色譜柱1為Rxi-XLB， 30 m×0.25 mm×0.25 μm，色譜柱2為Rxi-200， 1.5 m×0.18 mm×0.2 μm；程序升溫：柱溫箱1為初始溫度50 ℃保持1 min，再以8 ℃/min 升溫至270 ℃保持10 min；柱溫箱2為初始溫度55 ℃保持1 min，再以8 ℃/min 升溫至275 ℃保持10 min。載氣：He（流速為1.0 mL/min）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；調(diào)制器調(diào)制周期：5 s（熱吹時(shí)間1 s）；傳輸線溫度：270 ℃；電子轟擊電離源的電壓：70 eV；離子源溫度：220 ℃；檢測器電壓：1 600 V；數(shù)據(jù)采集頻率： 100 Hz；質(zhì)量數(shù)采集范圍： 45～550 amu；軟件將解卷積后得到的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)Wiley譜庫和NIST譜庫進(jìn)行匹配定性。

2 結(jié)果與分析

GC×GC由兩根色譜柱組成，通過改變固定相極性和柱溫可實(shí)現(xiàn)混合物在兩維色譜柱中的正交分離[12-13]。本研究中，第一根色譜柱極性較弱，第二根色譜柱極性較強(qiáng)，則色譜柱1中混合物根據(jù)其沸點(diǎn)由低到高依次流出，色譜柱2中混合物根據(jù)其極性強(qiáng)弱依次流出。

圖1和圖2是香草蘭中揮發(fā)、半揮發(fā)性組分GC×GC/TOFMS二維圖和三維圖，從圖中可看出，GC×GC/TOFMS分離的組分較多，并且多數(shù)組分都可以得到較好分離，顯示了GC×GC/TOFMS對(duì)復(fù)雜組分的較強(qiáng)分離能力。

利用全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜的方法共鑒定出香草蘭中181種揮發(fā)、半揮發(fā)性成分。表1中列出這些化合物的相關(guān)信息。這些成分中含量較高的成分有：香蘭素、呋喃甲醛、（2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇、鄰甲氧基苯酚、2，3-丁二醇、苯酚、正己醛、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、對(duì)羥基苯甲醛、3-甲基丁酸、2，3，5，6-四甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮、香草酸、壬醛、正己酸、1-辛烯-3-酮等。

在此基礎(chǔ)上，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同對(duì)香草蘭中鑒定出來的化合物進(jìn)行分類，圖3和圖4列出了各類化合物個(gè)數(shù)和相對(duì)含量。從圖中看出香草蘭中芳香族化合物的種類最多而且相對(duì)含量最大，是香草蘭中最重要的一類香氣成分。其中含量最高的成分是香蘭素，它是香草蘭中整體香氣貢獻(xiàn)最大的香氣成分，對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)率高達(dá)1/3[14]。此外鄰甲氧基苯酚的含量也較高，也是香草蘭中重要香氣成分，Brunschwig[7]研究表明鄰甲氧基苯酚是塔西提島香草蘭中關(guān)鍵香氣成分之一。

在先前利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)研究香草蘭中揮發(fā)性成分的相關(guān)報(bào)道中，醇類化合物含量并不占優(yōu)勢[11]，但本研究中醇類化合物的相對(duì)含量僅次于芳香族化合物，這可能是由分析儀器的差異所造成的，GC×GC/TOFMS相對(duì)于GC-MS而言能更好的分離組分，因此能鑒定出更多的醇類物質(zhì)。例如先前研究中利用GC-MS只能鑒定出2種2，3-丁二醇的同分異構(gòu)[11]，而本研究中利用GC×GC/TOFMS則能鑒定出3種2，3-丁二醇同分異構(gòu)體，而且這3種同分異構(gòu)體的含量均較高，共占總峰面積的18.9%。

香草蘭中醛類化合物個(gè)數(shù)為18種，相對(duì)總峰面積為7.5%，其含量與芳香族化合相比雖然較少，對(duì)香草蘭的香氣貢獻(xiàn)較大，主要呈巧克力、水果等令人愉快的香味[7，11]，如（E）-2-庚烯醛、反式-2-壬烯醛、辛醛等。Brunschwig等的研究表明塔西提島香草蘭中醛類化合物的香氣強(qiáng)度僅低于以芳香族化合物的香味[7]。本研究中醛類化合物中正己醛和壬醛的相對(duì)含量最高，分別為3.4%和1.5%，呈水果香和油脂味。

雜環(huán)類化合物的種類較多、相對(duì)含量較大。在已鑒定的雜環(huán)化合物中呋喃甲醛的相對(duì)含量最高，在所有化合物中僅次于香草醛，含量為10.2%，呈杏仁味。2，3，5，6-四甲基吡嗪的相對(duì)含量也較高約為1.8%，呈烘烤、堅(jiān)果香味。此外，烷烴類物質(zhì)種類較多，僅次于芳香族化和雜環(huán)合物，但是其峰面積相對(duì)較小，香氣也強(qiáng)度較弱，對(duì)香草蘭整體香氣貢獻(xiàn)不大。

3 討論與結(jié)論

香草蘭的香氣成分十分復(fù)雜，產(chǎn)地不同，加工方法不同，香氣組成就差異明顯，文獻(xiàn)中香草蘭的香氣成分已檢出250多種，本實(shí)驗(yàn)中通過全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定出181種，而以前的報(bào)道中一次實(shí)驗(yàn)中最多檢出96種香氣成分[7]，由此可以看出，全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜適合用于香草蘭這類復(fù)雜化學(xué)成分體系中揮發(fā)性、半揮發(fā)性組分的研究分析，這主要是由于全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜高分辨率和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。通過提取條件的優(yōu)化，香草蘭的未被檢出的微量香氣成分也可以通過全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，從而為香草蘭風(fēng)味指紋圖譜的構(gòu)建提供基礎(chǔ)。

與普通GCMS相比，全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜的分離部分是由兩根色譜柱組成，色譜柱間由調(diào)制器連接。調(diào)制器對(duì)第一根色譜柱中流出組分進(jìn)行冷凝和聚焦并注入第二根色譜柱。這種冷凝聚焦作用一方面減小了第二維峰寬、提高了柱效，另一方面很大程度上增強(qiáng)了色譜峰的信噪比，使得一些痕量化合物在GC×GC上有較高的響應(yīng)值[15]，因此對(duì)一些一維色譜上難以檢測的痕量成分有較高的靈敏度[12]。另外許多結(jié)構(gòu)相近的化合物如同分異構(gòu)體有相同或相似的沸點(diǎn)或極性，在一維色譜上極易出現(xiàn)“共餾峰”，導(dǎo)致難以分離鑒定。而GC×GC的瓦片和族分離效應(yīng)使得GC×GC具有較高的分辨率，能分離對(duì)這類重疊峰有較好的分離效果[9]。

本研究中借助全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的高分辨率和高靈敏度，再將其與固相微萃取技術(shù)相結(jié)合共鑒定出香草蘭中181種揮發(fā)、半揮發(fā)性成分，這些成分包含有芳香族、醛、醇、酮、酸、酯、雜環(huán)、烷烴等化合物，其中芳香族化合物在種類和含量方面均有顯著的優(yōu)勢，是香草蘭中最重要的一些成分。在已鑒定出來的成分中含量較高的物質(zhì)主要有香蘭素、呋喃甲醛、（2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇、鄰甲氧基苯酚、2，3-丁二醇、苯酚、正己醛、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、對(duì)羥基苯甲醛、3-甲基丁酸、2，3，5，6-四甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮、香草酸、壬醛、正己酸、1-辛烯-3-酮等。

參考文獻(xiàn)

[1] Dong Z Z， Gu F L， Xu F， et al. Comparison of Four Kinds of Extraction Techniques and Kinetics of Microwave-Assisted Extraction of Vanillin from Vanilla planifolia Andrews[J]. Food Chemistry， 2014， 149（15）： 54-61.

[2] Gu F L， Xu F， Tan L H， et al. Optimization of enzymatic process for vanillin extraction using response surface methodology[J]. Molecules， 2012， 17： 8 753-8 761.

[3] 陳慶文， 郭運(yùn)青. 海南香草蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展概況[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 30（7）： 61-64.

[4] Adedeji J， Hartman T G， Ho C. Flavor characterization of different varieties of vanilla beans[J]. Perfumer and Flavors， 1993， 18： 115-133.

[5] Perze-Silva A， Odoux E， Bart P， et al. GC-MS and GC-olfactometry analysis of aroma compounds in a representative organic aroma extract from cured Vanilla（Vanilla planifolia G. Jackson）beans[J]. Food Chemistry， 2006， 99（4）： 728-735.

[6] Toth S J. Comparison and integration of analytical methods for the characterization of vanilla chemistry. （Ph D dissertation）[M]. Rutgers： The State University of New Jersey， 2012.

[7] Brunschwig C， Senger-Emonmot P， Aubanel M L， et al. Odor-active compounds of Tahitian vanilla flavor[J]. Food Research International， 2012， 46： 148-157.

[8] Phillips J B， Xu J. Comprehensive multi-dimensional gas chromatography[J]. Journal of Chromatography A， 1995， 703（1）： 327-334.

[9] 李海峰， 鐘科軍， 路 鑫， 等. 全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC/TOFMS）用于煙葉中揮發(fā)、半揮發(fā)性堿性化合物的組成研究[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào)， 2006， 64（18）： 1 897-1 903.

[10] 李海峰， 路 鑫， 鹿洪亮， 等. 全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC/TOFMS）用于煙葉中酸性成分的分離與分析[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào)， 2006， 27（4）： 612-617.

[11] 董智哲， 谷風(fēng)林， 徐 飛， 等. 固相微萃取和同時(shí)蒸餾萃取法分析海南香草蘭揮發(fā)性成分[J]. 食品科學(xué)， 2014， 35（02）： 158-163.

[12] 路 鑫， 蔡君蘭， 武建芳， 等. 全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜用于卷煙主流煙氣中酚類化合物的表征[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 62（8）： 804-810.

[13] Dallüge J， Vreuls R J J， Beens J， et al. Optimization and characterization of comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass spectrometric detection（GC×GC-TOF MS）[J]. Journal of Separation Science， 2002， 25（4）： 201-214.

[14] Ranadive A S. Vanilla-Cultivation， curing， chemistry， technology and commercial products[J]. Developments in Food Science， 1994.

[15] 李 莉， 蔡君蘭， 蔣錦鋒， 等. 全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析煙草揮發(fā)和半揮發(fā)性酸性成分[J].煙草科技， 2006 （5）： 25-32.