牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化及功能驗證

賀小英 馬利兵 程騰 劉希宇 劉銷 吳飛

摘要：乳腺上皮細胞是研究泌乳的調控機理、乳腺癌發(fā)病機制以及制備乳腺生物反應器靶細胞。由于乳腺細胞體外培養(yǎng)生命周期較短并且增殖活力與體外培養(yǎng)時間呈負相關，到目前為止，能夠適合體外研究的乳腺細胞系報道較少。因此，在優(yōu)化了乳腺細胞體外培養(yǎng)條件的基礎上，進一步驗證了優(yōu)化體系后培養(yǎng)的乳腺上皮細胞生物學的穩(wěn)定性、蛋白表達情況及轉基因的效率。結果表明：1：1DMEM/F12基礎培養(yǎng)液+10%胎牛血清+2mmol/L谷氨酰胺+10ng/mL表皮生長因子+10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子+10μg/mL的ITS+5μg/mL胰島素+0.1mmol/L非必須氨基酸是維持乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)的最適條件。在此培養(yǎng)條件獲得的乳腺上皮細胞生長旺盛，傳代次數(shù)能延長到20代，生長后期仍然能穩(wěn)定表達CK18，且具有較高的轉基因效率.

關鍵詞：乳腺細胞；體外培養(yǎng)；轉基因；乳腺生物反應器

中圖分類號：Q2-0 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0019-05

Optimization of Culture Condition and Functional Verification for Bovine Mammary Epithelial Cells in Vitro

HE Xiao-ying*，MA Li-bing，CHENG Teng，LIU Xi-yu，LIU Juan，WU Fei

（School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 104010，Inner Mongolia，China）

Abstract：Mammary epithelia cells are an important invitro model to study the mechanism of lactation，cancer and mammary bioreactor.However，it is very hard to culture in vitro.Currently，fewer cell lines have been used in mammary research field.A valid method for the study of the mammary gland epithelium cell was established.The results showed that the media added 1：1 DMEM/F12，plus 10% FBS，2 mmol/L L-glu-tamine，10ng/mL EGF，10ng/mL FGF，10（xg/mL ITS，5μg/mL insulin and 0.1 mmol/L NAEE was the suitable media for bovine mammary epithelial cells.The mammary epithelia cells obtained under optimized condition grew vigorous，extended life span to 20 passages，steadily expressed CK18 and had high transgenic efficiency.

Keywords：mammarycells；invitroculture；transgene；mammarybioreactor（LifeScienceResearch，2015，19（1）：019-023）

乳腺細胞是研究泌乳的調控機理、乳腺癌疾病模型、乳腺生物反應器制備轉基因動物等領域的靶細胞。到目前為止，由于乳腺上皮細胞是一種高度分化的細胞，體外培養(yǎng)較為困難。盡管現(xiàn)在已經建立了一些永生化的牛乳腺細胞系，但是，這些細胞系除了MAC-T外[1]，其他細胞系還沒有得到別的學者檢驗及進一步的相關研究，而且乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)的體系也不完善，當采用外源基因導人體外培養(yǎng)的細胞方法來分析基因功能或轉基因動物研究時，要求乳腺上皮細胞能長時間地體外穩(wěn)定生長。此外，在培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)環(huán)境的局限性，影響了細胞的正常生長，進而導致調控細胞凋亡等的信號通路發(fā)生改變，加速了細胞的死亡，這樣也局限了正常乳腺細胞的體外研究[2]。因此，探索牛乳腺細胞體外培養(yǎng)條件是該領域研究的迫切需要。本研究旨在研究牛乳腺上皮細胞體外分離培養(yǎng)的最適條件，在此基礎上，進一步驗證優(yōu)化體系后培養(yǎng)的乳腺上皮細胞生物學穩(wěn)定性、蛋白表達及轉基因的效率高低。

1材料與方法

1.1材料和試劑

新鮮乳腺組織取自屠宰場。質粒純化試劑盒說明書（EndofreePlasmidExtractionKit）購自Promega公司（美國）；脂質體2000、1：1DMEM/F12基礎培養(yǎng)液、非必需氨基（NEAA）、胎牛血清（FBS）、表皮生長因子（EGF）、胰島素蛋白轉鐵硒納（100x）（ITS）和膜島素（Insulin）購自Invitrogen公司（美國），單克隆鼠抗角蛋白CK18、羊抗小鼠IgG-cy3二抗和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。Hoechst33342、100U/mL青霉素、100（xg/mL鏈霉素和谷氨酰胺購自Sigma公司（美國）。真核表達載體pEGFP-Cl購自Clontech公司（美國）；宿主菌DH5a為本室保存。

1.2方法

1.2.1乳腺上皮細胞的分離與培養(yǎng)

無菌狀態(tài)下取健康牛乳腺組織，采用PBS液清洗3?5遍，用眼科鑷剪成1mm3小塊，將其貼于培養(yǎng)肌中，間距0.5cm左右，倒置培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱大約2～3h左右。待組織塊與培養(yǎng)皿粘合牢固時，補足培養(yǎng)液，每隔3d換一次液持續(xù)培養(yǎng)，大約10?14d上皮養(yǎng)細胞遷出。待乳腺上皮細胞達90%匯合后，去除培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，加入0.25%胰酶0.04%EDTA消化8min，待胞質回縮變圓，加入等量的含有血清的基礎培養(yǎng)液終止消化，收集細胞懸液，800r/min離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)液制成細胞懸液，按1：3的比例接種在新的培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2，飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2不同培養(yǎng)條件對乳腺上皮細胞生長的影響

根據(jù)表1配制8種不同的細胞培養(yǎng)液。將純化的乳腺上皮細胞分成兩組，以每mL1x104個接種于12孔培養(yǎng)板，第一組培養(yǎng)6d后，消化細胞進行計數(shù)，按Patterson公式計算群體倍增時間T（T=tlg2/（lg/N0- lg/N1）；（N0：對數(shù)生長期末回收細胞數(shù)；N1：對數(shù)生長期細胞數(shù)對數(shù)期培養(yǎng)的時間）。第二組進行持續(xù)傳代培養(yǎng)，統(tǒng)計在8種不同培養(yǎng)條件下細胞的最終傳代次數(shù)。通過細胞生長群體倍增時間和最終存活的代數(shù)評估8種不同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)液對乳腺上皮細胞生長的影響，最終確定乳腺上皮細胞的最佳培養(yǎng)條件。

1.2.3優(yōu)化條件下乳腺上皮細胞的生物學特性檢測情況檢測

首先無菌狀態(tài)下取健康牛乳腺組織，采用組織塊貼壁法，乳腺組織貼壁培養(yǎng)過程，部分組織會直接遷出乳腺細胞，顯微鏡下觀察，取出只遷乳腺細胞的組織塊，轉移到新的培養(yǎng)皿，以1.2.2組確定的最適培養(yǎng)條件培養(yǎng)乳腺上皮細胞，顯微鏡下觀察其生物學特性。

1.2.4優(yōu)化條件下乳腺上皮細胞的標記蛋白表達

以1.2.2組確定的最適培養(yǎng)條件組獲得的上皮細胞為研究對象，選取第15代細胞，以1x105個細胞接種到載玻片，待細胞在載玻片匯合生長后，PBS清洗，用4%多聚甲醛固定細胞20min，然后用封閉液封閉2h，緩沖液洗滌3遍，填加1：50的鼠抗人CK18，4℃過夜，緩沖液洗滌3遍，加1：100Cy3熒光標記的羊抗鼠二抗，室溫暗室1h，用1：500的Hoechst33342避光染核15min，鏡檢。

1.2.5優(yōu)化條件下pEGFP-Cl鑒定乳腺上皮細胞轉染效率

嚴格按照質粒純化試劑盒說明書操作，純化真核表達載體pEGFP-Cl，利用紫外分光光度計檢測濃度為548 比值為1.86。

在上述研究的基礎上，選取細胞體外增殖活力較好且存活時間較長的兩組為研究對象，分別選取體外培養(yǎng)的第10代細胞，待乳腺上皮細胞匯合生長至75%～85%時，按脂質體2000操作說明書進行轉染，DNA與脂質體的轉染比例是1：2|31，轉染48h后通過熒光顯微鏡檢測轉染效率。

2結果

2.1不同體外培養(yǎng)條件對乳腺上皮細胞生長的影響

根據(jù)群體倍增時間和最終傳代次數(shù)綜合判斷兩組乳腺上皮細胞，結果表明，這7種培養(yǎng)液均能維持一定時間的牛乳腺上皮細胞體外生長，且在早期細胞生長活力差異不顯著，在血清濃度10%的條件，單一生長因素對乳腺細胞的群體倍增時間較長，傳代次數(shù)均較低（R1M2M3和R4）。15%的高血清濃度可延長細胞體外壽命，但是群體倍增時間較長（R7）：5%低血清濃度其群體倍增時間最長，細胞存活時間最低（H8），H5組的群體倍增時間為34.45，細胞生長活力較好，細胞能穩(wěn)定存活20代左右，為最適生長條件。

2.2優(yōu)化培養(yǎng)后的乳腺上皮細胞細胞生物學特征

如圖1所示，采用R5組培養(yǎng)體系培養(yǎng)乳腺組織，大約7～10d后，部分組織塊會直接遷出乳腺上皮細胞（圖1A），原代細胞以單層匯合生長，細胞生長旺盛，大多以類“肌細胞”樣生長（圖1B），隨著傳代次數(shù)的增加會形成兩種不同細胞群，即開放型和閉合型細胞群開放型細胞群，邊界不清，大多以類“肌細胞”樣生長；閉合型細胞群，細胞連接緊密，細胞以典型的“鋪路石”樣聚集生長（圖1C）。隨著傳代次數(shù)的增加，乳腺細胞會形成空泡狀結構（圖1D箭頭所示）；采用R5組培養(yǎng)的乳腺上皮細胞生長到18代以后，明顯衰老，細胞體積變大、呈平鋪狀、折光性差（圖1E）通常乳腺細胞形成單克隆的效率較低，但是優(yōu)化培養(yǎng)條件后原代分離培養(yǎng)的乳腺細胞單隆生長狀態(tài)良好（圖1F箭頭所示）。

2.3優(yōu)化后乳腺上皮細胞的免疫熒光結果

常規(guī)配方的培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)的乳腺細胞15代大量死亡，細胞呈平鋪狀，無法檢測蛋白表達情況。采用優(yōu)化條件下培養(yǎng)的第15代乳腺上皮細胞，免疫熒光檢測角蛋白CK18在牛乳腺上皮細胞的胞漿中能夠穩(wěn)定表達（圖2）。

2.4pEGFP-Cl轉染乳腺上皮細胞轉染效率鑒定

乳腺上皮細胞的生長狀態(tài)直接決定細胞的轉染效率，選取上述結果中細胞體外增殖活力較好且存活時間較長的R5和R7組為研究對象，結果表明：采用R5組培養(yǎng)條件下獲得的細胞轉染效率較R7組高（圖3）。

3討論

3.1 乳腺細胞體外培養(yǎng)條件優(yōu)化

乳腺細胞能否在體外維持穩(wěn)定生長是轉基因及陽性克隆篩選的的關鍵，目前，已經證實一些促細胞分裂劑會促進乳腺上皮細胞的增殖：如EGF、胰島素、bFGF、HGFJGF-I.TGF-β、胎牛血清、乳腺提取物等都可以刺激乳腺上皮細胞的增殖'胰島素是細胞周期的主要外源性調節(jié)因子，它和胰島素樣生長因子、EGF等一樣，能促使細胞由G1期進入S期，促進細胞分裂增殖[5]。：EGF和bFGF有很強的促細胞分裂活性和促生長作用[6、7].

本研究通過群體倍增時間和不同培養(yǎng)條件下細胞的傳代次數(shù)檢測不同培養(yǎng)液對hMGEs體外生命的維持[8]。結果表明1：1DMEM/F12基礎培養(yǎng)液+10%胎牛血清+2mmol/L谷氨酰胺+10ng/mL表皮生長因子+10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子+10μg/mL的ITS+5μg/mL胰島素+0.1mmol/L非必須氨基酸是維持乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)的最適條件。利用此條件培養(yǎng)的乳腺上皮細胞形態(tài)良好，活力旺盛，能夠維持20代左右的生長活力。此外，我們發(fā)現(xiàn)EGF與bFGK混合添加不僅促進乳腺匕皮細胞的增殖還能延長細胞的壽命。

3.2優(yōu)化條件下培養(yǎng)的乳腺上皮細胞特征分析細胞生長狀態(tài)的好壞直接決定了體外研究結果的真實性和可靠性。因此，本研究在優(yōu)化了乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)條件的基礎上，進一步檢測了此條件下培養(yǎng)的乳腺細胞生物學的穩(wěn)定性、蛋白表達情況及轉基因的效率。通常培養(yǎng)條件下，組織塊遷移的時間大約需要10?14d，采用優(yōu)化條件后獲得乳腺上皮細胞時間7～10d，縮短了周期，優(yōu)化后的乳腺上皮細胞的生長狀態(tài)旺盛，細胞生物學特征穩(wěn)定，且單克隆形成的效率較高。常規(guī)配方的培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)的乳腺細胞15代大量死亡，細胞呈平鋪狀，無法檢測蛋n表達情況但是采用優(yōu)化條件下培養(yǎng)的第15代乳腺上皮細胞仍能穩(wěn)定表達上皮細胞的標記蛋hCK18進一步驗證其轉基因的效率高低，結果表明采用體外培養(yǎng)條件下優(yōu)化后獲得的乳腺上皮細胞第10代做基因轉導具有較高的轉染效率。

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