枇杷花藥胚狀體誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

陶煉　潘翠萍　謝紅江　王永清　楊文淵　唐一平　涂美艷

摘 要 以‘大五星枇杷花藥為外植體，研究小孢子發(fā)育時(shí)期、低溫處理及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)及胚狀體發(fā)生的影響。結(jié)果表明：枇杷小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾橫徑存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，橫徑為4.68～5.28 mm的枇杷花蕾處于單核靠邊期，此時(shí)期的小孢子胚狀體誘導(dǎo)率最高，為25.05%；經(jīng)4 ℃低溫處理2 d的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)69.93%；花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基是MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率為78.22%；枇杷花藥愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體的最適培養(yǎng)基為MS+ZT 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+IBA 0.05 mg/L，胚狀體誘導(dǎo)率為25.56%。

關(guān)鍵詞 枇杷；花藥培養(yǎng)；愈傷組織；胚狀體

中圖分類號(hào) S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Optimization of Inducing Conditions of Embryogenesis

in Loquat（Eriobotrya japonica Lindl.）

TAO Lian1 ， PAN Cuiping2， XIE Hongjiang1， WANG Yongqing2 *，

YANG Wenyuan1， TANG Yiping3， TU Meiyan1

1 Horticulture Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu，Sichuan 610066， China

2 College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Ya'an，Sichuan 625014， china

3 Agricultural and Forestry Bureau， Longmatan District， Luzhou， Sichuan 646000， China

Abstract The anthers of loquat（Eriobotrya japonica Lindl. cv.‘Dawuxing）were used as the material to optimize the plant regeneration system. A series of experiments were carried out to investigate the effects of microspore developmental stages， 4 ℃ low temperature pretreatment and growth regulators on the anther callus induction and somatic embryogenesis. The results showed that there was corresponding relationship between transverse diameter of flower bud and the developmental stages of microspore. When the transverse diameter of flower buds was 4.68-5.28 mm，the microspore was at the late-uninucleate developmental stage which was suitable for inducing embryoids with a rate of 25.05%. Two days of 4 ℃ cold treatment in darkness to anthers were more favorable， resulting in 69.93% of callus formation. The most suitable medium for anther callus induction was MS（Murashige and Skoog）medium supplemented with 2，4-dichlorophenox acetic acid（2，4-D） 5mg/L and 6-benzyladenine（6-BA）2.0 mg/L， in which anther calluses were induced at a frequency of 78.22%. The most suitable medium for anther-derived embryos induction was MS supplemented with zeatin（ZT）0.05 mg/L， a-naphthalene acetic acid（NAA）0.01 mg/L and indolebutyric acid（IBA）0.05 mg/L， in which embryos were induced at a rate of 25.56%.

Key words Loquat； Anther culture； Callus； Embryoid

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.019

枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]屬于薔薇科（Rosaceae）枇杷屬（Eriobotrya），原產(chǎn)我國(guó)西南（川雅安市境內(nèi)大渡河流域），枇杷秋萌冬花，春實(shí)夏熟，在百果中獨(dú)具先天四時(shí)之氣，被譽(yù)為獨(dú)冠時(shí)新的嘉果珍味，深受人們喜愛[1]。

大量研究結(jié)果表明，胚狀體是理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料[2]。其中，花藥胚狀體不僅有利于遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，同時(shí)還能得到單倍體，經(jīng)人工加倍后可快速獲得純合二倍體，從而縮短育種年限，提高育種效率， 在一些作物上已有較大成果[3-4]。自1964年，Guha等[5]首次通過花藥培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)出了世界上第一例曼陀羅花藥胚狀體，并最終獲得再生植株后，花藥培養(yǎng)技術(shù)得到迅猛發(fā)展，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已有23科52屬約300種高等植物的花藥培養(yǎng)獲得成功[6]。有關(guān)枇杷花藥胚狀體方面的報(bào)道較少，李俊強(qiáng)等[7]初步建立了枇杷花藥培養(yǎng)及植株再生技術(shù)體系，但存在胚狀體誘導(dǎo)率低的問題，限制了該項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

本試驗(yàn)以‘大五星枇杷花藥為材料，在前人工作基礎(chǔ)上對(duì)影響枇杷花藥胚發(fā)生的條件進(jìn)行了優(yōu)化，為建立高效且適宜枇杷遺傳轉(zhuǎn)化的花藥胚狀體再生系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

栽植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝生物技術(shù)研究中心枇杷園的12年生‘大五星枇杷花藥。

1.2 方法

1.2.1 小孢子發(fā)育進(jìn)程的觀察 在減數(shù)分裂結(jié)束即發(fā)育到四分體之后，于晴天上午（9 ： 00～11 ： 00）和下午（15 ： 00～16 ： 00）每隔1 h左右取樣，用卡諾Ⅰ固定液（無水乙醇 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）固定24 h后轉(zhuǎn)入70%酒精，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，并邊固定邊制片跟蹤觀察。改良品紅染色和壓片處理，奧林巴斯BX-51顯微鏡觀察雄配子體發(fā)育各時(shí)期典型特征，DP70攝像頭拍照、CCD軟件進(jìn)行照片處理，每個(gè)時(shí)期至少觀察40個(gè)視野。改良品紅壓片觀察雄配子體發(fā)育過程的同時(shí)，觀察花蕾外部形態(tài)的變化。鑒于枇杷花蕾內(nèi)小孢子母細(xì)胞發(fā)育過程分裂相不同步，分裂期以全部分裂相中占大多數(shù)的時(shí)期為準(zhǔn)。

1.2.2 小孢子不同發(fā)育時(shí)期胚狀體的誘導(dǎo) 分別取四分體時(shí)期、單核居中期、單核靠邊期及雙核期的小孢子經(jīng)低溫預(yù)處理48 h后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.4-D 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L上，然后將獲得的愈傷組織（花藥愈傷體積相當(dāng)于花藥大小時(shí)）轉(zhuǎn)移到胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+ZT 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+IBA 0.05 mg/L上培養(yǎng)， 培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)胚狀體誘導(dǎo)率（發(fā)生胚狀體的愈傷數(shù)/接種愈傷數(shù)×100%）。

1.2.3 花藥愈傷組織誘導(dǎo)的低溫處理 采集處于單核靠邊期的枇杷花蕾，分別對(duì)其進(jìn)行不同時(shí)間4 ℃低溫處理，低溫處理時(shí)間設(shè)置為24、48、72、96、120 h，以不處理為對(duì)照，處理后的花蕾經(jīng)表面滅菌后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+蔗糖70 g/L+瓊脂7.5 g/L上。每個(gè)處理接種450枚花藥，重復(fù)3次。接種后定期觀察并記錄花藥形態(tài)變化，花藥愈傷啟動(dòng)生長(zhǎng)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率（長(zhǎng)出愈傷的花藥數(shù)/成活的花藥數(shù)×100%）、愈傷組織質(zhì)地及長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.4 花藥愈傷組織誘導(dǎo) 將經(jīng)4 ℃低溫處理后的枇杷花蕾去除表面絨毛，少量洗衣粉加兩滴吐溫20清洗，流水沖洗2 h。75%酒精消毒20 s，無菌水沖洗2次，再用0.1%升汞表面滅菌12 min，無菌水沖洗多次。剝開花蕾取出花藥，并徹底去除與花藥相連的花絲，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L）、2，4-D（0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 mg/L），采用兩因素完全組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，附加蔗糖70 g，瓊脂7.5 g，pH5.8，每個(gè)材料接種15瓶，每瓶接種10～15枚花藥，重復(fù)3次。接種后定期觀察并記錄花藥形態(tài)變化，花藥愈傷啟動(dòng)生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率（長(zhǎng)出愈傷的花藥數(shù)/成活的花藥數(shù)×100%）、愈傷組織質(zhì)地及長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.5 胚狀體的誘導(dǎo) 將初代培養(yǎng)獲得的花藥愈傷組織（花藥愈傷體積相當(dāng)于花藥大小時(shí)）從花藥壁上剝離下來，轉(zhuǎn)至胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的ZT（0. 05、0.1、0.5 mg/L）、NAA（0.01、0.03、0.05 mg/L）、IBA（0.05、0.1、0.15 mg/L），采用三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)附加蔗糖30 g，瓊脂7.5 g，pH5.8，每處理接種150個(gè)外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)胚狀體誘導(dǎo)率（發(fā)生胚狀體的愈傷數(shù)/接種愈傷數(shù)×100%）。

1.2.6 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照時(shí)間14 h/d，光照強(qiáng)度為1 500 lx。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用DPS7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷小孢子發(fā)育進(jìn)程的觀察

減數(shù)分裂結(jié)束（四分體時(shí)期）（圖1-A），‘大五星枇杷小孢子進(jìn)入雄配子體發(fā)育階段，由單核期（圖1-B、C、D）、雙核期（圖1-E）至成熟花粉（圖1-F）的雄配子體發(fā)育過程中，花蕾橫徑長(zhǎng)度總體呈增加趨勢(shì)（表1），變化幅度在4.42～6.04 mm之間，花藥顏色則由嫩綠色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\綠色，至成熟花粉時(shí)呈淺黃色。

2.2 小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

表2顯示，四分體時(shí)期及雙核期的小孢子均不能誘導(dǎo)出胚狀體，只有單核期的小孢子才能誘導(dǎo)出胚狀體，其中單核居中期有少量小孢子能誘導(dǎo)出胚狀體，誘導(dǎo)率為3.23%，單核靠邊期胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)25.05%，結(jié)合表1可知，單核靠邊期的花蕾直徑為4.68～5.28 mm。

2.3 不同低溫處理對(duì)枇杷花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3顯示，對(duì)枇杷花蕾進(jìn)行24、48 h的4 ℃低溫處理，與對(duì)照比較，愈傷組織發(fā)生時(shí)間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異，但愈傷組織誘導(dǎo)率不同，以低溫處理48 h愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)69.93%，極顯著高于對(duì)照的3.31%，愈傷組織呈綠色致密顆粒狀。隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸降低，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到96 h時(shí)，誘導(dǎo)率下降為5.54%，當(dāng)處理時(shí)間為120 h時(shí)，沒有愈傷組織的發(fā)生。因此，枇杷花藥愈傷組織的誘導(dǎo)以4 ℃低溫處理花蕾48 h為宜。

2.4 外源激素對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

花藥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d，花藥膨脹明顯，邊緣開始出現(xiàn)綠色或黃綠色顆粒狀愈傷組織。對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行方差分析，F(xiàn)檢驗(yàn)表明，2，4-D對(duì)枇杷花藥愈傷組織的誘導(dǎo)有極顯著的影響（F2，4-D=32.7，p<0.01），6-BA有顯著的影響（F6-BA=5.18，0.01﹤p<0.05），當(dāng)6-BA一定時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的上升而上升；在2，4-D 0.5 mg/L、6-BA 2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了78.22%，極顯著高于其他處理，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)好，呈綠色致密顆粒狀（圖2-A），隨著2，4-D濃度的繼續(xù)增加（2，4-D﹥0.5 mg/L），愈傷誘導(dǎo)率反而降低，當(dāng)2，4-D濃度為1.0 mg/L、6-BA濃度為3.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率最低，僅為14.25%，愈傷組織呈現(xiàn)黃綠色塊狀（圖2-B）。綜上所述，培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L為枇杷花藥花愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基（表4）。

2.5 外源激素對(duì)愈傷組織形成胚狀體的影響

花藥愈傷組織接近花藥大小時(shí)，立即轉(zhuǎn)入胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過1～2周左右的培養(yǎng)，部分愈傷組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成質(zhì)地脆嫩、結(jié)構(gòu)致密的胚性愈傷組織。再經(jīng)過4～5周培養(yǎng)后，胚性愈傷組織表面開始凸起，出現(xiàn)球胚（圖3-A）。球形胚繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)過心形胚（3-B），魚雷形胚（圖3-C），最后發(fā)育形成簇狀的子葉胚（圖3-D）。

表5顯示，較低濃度的ZT、NAA和IBA組合有利于枇杷花藥胚狀體的誘導(dǎo)，當(dāng)ZT選用0.05 mg/L、NAA選用0.01 mg/L、IBA選用0.05 mg/L時(shí)，胚狀體誘導(dǎo)率最高，為25.56%，極顯著高于其他處理，其次為ZT 0.05 mg/L、NAA 0.03 mg/L與IBA 0.1 mg/L的組合，誘導(dǎo)率為18.81%。較高濃度的ZT、NAA與IBA的組合對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)反而不利，當(dāng)ZT選用0.5 mg/L、NAA選用0.01mg/L、IBA選用0.15 mg/L與 ZT選用0.5 mg/L、NAA選用0.05mg/L、IBA選用0.1 mg/L的濃度組合時(shí)，胚胎誘導(dǎo)率為0。對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率進(jìn)行方差分析表明，ZT、NAA、IBA對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)均達(dá)到了極顯著的水平（p﹤0.01），且ZT占主導(dǎo)作用（FZT=2 630.10），NAA的影響作用次之（FNAA=348.74），影響最小的是IBA（FIBA=215.39）。綜上所述，適宜枇杷花藥愈傷組織胚狀體誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+ZT 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+IBA 0.05 mg/L。

3 討論與結(jié)論

3.1 小孢子發(fā)育時(shí)期與花藥培養(yǎng)效率

多數(shù)研究表明小孢子細(xì)胞發(fā)育時(shí)期一般經(jīng)歷四分體時(shí)期、單核居中期、單核靠邊期、雙核期和成熟花粉粒時(shí)期[8]。本實(shí)驗(yàn)研究了‘大五星枇杷小孢子發(fā)育各時(shí)期與花蕾形態(tài)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾橫徑、花藥顏色變化具有一定對(duì)應(yīng)關(guān)性。由此可見，通過花蕾形態(tài)特征來判斷小孢子發(fā)育時(shí)期是可行的，可以作為枇杷花藥培養(yǎng)的材料選擇標(biāo)準(zhǔn)。

在花藥培養(yǎng)中，小孢子發(fā)育時(shí)期與花藥培養(yǎng)效率密切相關(guān)，研究認(rèn)為，單核居中期之前的花粉過于幼嫩，雙核期之后的花粉太過成熟。對(duì)于大多數(shù)植物來說，單核靠邊期是最適合的小孢子發(fā)育階段[9-10]。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，枇杷花藥培養(yǎng)過程中，四分體時(shí)期及雙核期的小孢子均不能誘導(dǎo)出胚狀體，只有單核期的小孢子能誘導(dǎo)出胚狀體，其中單核靠邊期胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)25.05%。枇杷屬于圓錐花序[11]，同一植株不同花序，同一花序不同花蕾，其小孢子的發(fā)育進(jìn)程均有所差異，可以通過使用染色劑如堿性品紅、醋酸洋紅及DAPI（4'， 6-二脒基-2苯基吲哚）來確定小孢子的發(fā)育時(shí)期，從而快速進(jìn)行花藥愈傷組織或胚狀體的誘導(dǎo)。

3.2 低溫處理與枇杷花藥愈傷組織誘導(dǎo)

多種預(yù)處理方式影響著植物花藥愈傷組織的形成，其目的就是從形態(tài)上改變其極性分布，從生理生化上改變其細(xì)胞生理狀態(tài)，從而改變其分裂方式和發(fā)育途徑[12]。對(duì)于不同種類、品種和生理狀態(tài)的植株，花藥培養(yǎng)所要求的預(yù)處理方式也不同。

Nitsch等[13]在花藥培養(yǎng)中首先用低溫處理花蕾， 大大提高了花藥培養(yǎng)的效率，花藥培養(yǎng)中低溫處理的有效性在多種植物上得到了證實(shí)[14-16]，本試驗(yàn)中，低溫處理對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)有極顯著的影響，枇杷花藥經(jīng)4 ℃低溫處理后，愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于對(duì)照，當(dāng)處理時(shí)間為48 h時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到了最高的69.93%。隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)（>48 h），愈傷組織誘導(dǎo)率大大降低，說明枇杷對(duì)低溫相對(duì)敏感。經(jīng)深入研究發(fā)現(xiàn)低溫可以改變紡錘絲的軸向，破壞紡錘絲的微管蛋白，使有絲分裂的正常過程被打破，導(dǎo)致分化過程的發(fā)生[17]，并且低溫可以在一定程度上抑制花藥離體后小孢子的衰敗， 使小孢子存活的時(shí)間延長(zhǎng)， 從而有較多的小孢子啟動(dòng)雄核發(fā)育[18]，這一顯著差異很可能是低溫處理能夠大大提高花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的關(guān)鍵所在。

3.3 外源激素與枇杷花藥培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)中胚狀體的發(fā)生受多種因素的影響，其中激素仍是最為關(guān)鍵的因素[19]，在花藥培養(yǎng)的不同階段外植體對(duì)激素的要求不同。大量試驗(yàn)結(jié)果表明，在花藥脫分化階段，外源生長(zhǎng)素2，4-D是啟動(dòng)小孢子分裂形成愈傷組織的必要條件[20]，本試驗(yàn)也證實(shí)了這點(diǎn)，2，4-D在枇杷花藥愈傷組織誘導(dǎo)中起主導(dǎo)作用，這一結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致[21]。而在胚狀體誘導(dǎo)階段應(yīng)少用或者不用2，4-D，否則對(duì)胚狀體的發(fā)生有抑制作用[22]，因此，花藥培養(yǎng)間接胚胎發(fā)生途徑中，要審慎地改變培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，才有可能改變雄核發(fā)育方式，獲得胚狀體的發(fā)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明，枇杷花藥完成脫分化進(jìn)入胚狀體發(fā)生階段時(shí)，低濃度的ZT是必需的，將初代培養(yǎng)獲得的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到含ZT、NAA與IBA的一定濃度組合的培養(yǎng)基上，獲得了25.56%胚狀體發(fā)生率，高于李俊強(qiáng)等[7]的9.0%，枇杷花藥胚狀體誘導(dǎo)率的提高，對(duì)完善花藥胚再生體系，建立枇杷花藥胚狀體高頻再生受體系統(tǒng)具有重要意義。

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