冷凍—溶解聯(lián)合外源酶處理香草蘭鮮豆莢對香氣成分的影響研究

張彥軍　徐飛　賀書珍　譚樂和

摘 要 香草蘭是蘭科多年生藤本攀緣植物，經(jīng)過發(fā)酵后散發(fā)出多種芳香成分成為重要的風味原料。然而，傳統(tǒng)發(fā)酵生香時間長，香氣成分轉化率低。本試驗考察冷凍-溶解聯(lián)合不同外源酶處理對香草蘭鮮豆莢主要香氣成分的影響。結果表明：外源酶不僅可以提高香蘭素的含量，還可提高其前體物質-葡糖香草醛的轉化率。在此基礎上，對比空白樣品，所有冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理后的香草蘭中香蘭素、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量均顯著增加，經(jīng)過纖維素酶-果膠酶-β葡萄糖苷酶處理后的香蘭素、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量最高為5.660%、0.089%、0.069%和0.101%；相比于傳統(tǒng)發(fā)酵和普通外源酶處理，所有冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理香草蘭鮮豆莢均顯著增加香蘭素含量（p<0.05），而纖維素酶-果膠酶-β葡萄糖苷酶、果膠酶-β葡萄糖苷酶、纖維素酶-β葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、果膠酶顯著增加對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量（p<0.05）。

關鍵詞 香草蘭；冷凍-溶解；外源酶；主要香氣成分

中圖分類號 TS255.2 文獻標識碼 A

The Effect of Freezing-thawing Combined with Different Exogenous

Enzymes on Main Aroma Components of Fresh Vanilla Pods

ZHANG Yanjun1，2， XU Fei1，2， HE Shuzhen1，2， TAN Lehe1，2 *

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract Vanilla which belongs to Orchidaceae is a perennial vine plant. A variety of aromatic components would be produced after fermentation. The traditional curing process of vanilla led to long fermentation time and low conversion rate of the aroma components. This study investigated the effect of freezing-thawing combined with different exogenous enzymes on main aroma components of fresh vanilla pods. Results showed that exogenous enzymes could not only improve the content of vanillin，it also could improve the conversion rate of its precursor substances（glucovanillin）. In addition， compared to blank samples， all the samples showed significant increase of vanillin，p-hydroxybenzaldehyde， p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid after freezing-thawing combined with different exogenous enzymes treatme， in which it showed the highest content of vanillin， p-hydroxybenzaldehyde， p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid with 5.660%， 0.089%， 0.069% and 0.089% after cellulose-pectinase-β-glycosidase treatment. Compared with the traditional fermentation and exogenous enzyme treatments， all the samples showed significant increase of vanillin（p<0.05）. However， only the samples showed significant increase of p-hydroxybenzaldehyde， p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid after freezing-thawing combined with cellulose-pectinase-β-glycosidase， pectinase-β-glycosidase， cellulose-β-glycosidase， cellulose-pectinase， pectinase treatments（p<0.05）.

Key words Vanilla； Freezing-thawing； Exogenous enzyme； Main aroma components

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.026

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）又名香莢蘭、香子蘭、香果蘭，屬蘭科（Orchidaceae）香子蘭屬多年生熱帶藤本植物。香草蘭是世界食品、飲料、化妝和香煙行業(yè)最重要和芳香的原料成分[1]。香草蘭也是蘭科家族中唯一生產用以作為商業(yè)上重要的風味原料。充分生長和成熟的香草蘭豆莢被稱為香草蘭豆，鮮豆莢僅有青草香。香草蘭傳統(tǒng)發(fā)酵生香過程包括殺青、發(fā)酵、干燥、陳化生香，最終形成組分復雜的香氣，包括烷烴、醇類、醛酮類、酯類、酚類、酸類，少量苯、醚類等[2-3]。如圖1所示，香草蘭發(fā)酵過程產生的主要香氣成分是香蘭素、香蘭酸、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲酸[2]。最近研究表明，香草蘭鮮豆莢中主要香氣成分糖苷干基含量在15%～20%之間，然而傳統(tǒng)發(fā)酵生香轉化率低為2%～3%[3-4]。

目前香草蘭傳統(tǒng)發(fā)酵生香技術比較成熟，但發(fā)酵時間長，主要香氣成分轉化率低。外源酶處理發(fā)酵香草蘭豆莢或鮮豆莢的報道較多，但都集中在提高香蘭素含量的研究。Odoux[3]、Ansaldi[5]研究表明，通過冷凍和融化處理破壞細胞壁完整性，提高香草蘭中香蘭素的含量。Mane、Zucca[6]研究表明，外源添加果膠酶和β-葡萄糖苷酶處理發(fā)酵好的香草蘭豆莢可以顯著提高香蘭素含量。Gu等[7]考察纖維素酶添加量、溫度和加熱時間對提取香草蘭中香蘭素的影響，結果表明在優(yōu)化條件下香蘭素提取率達到7.62 mg/g。Brunerie[8]考察外源添加纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶可以顯著提高香蘭素含量。Ovando等[9]采用纖維素酶預處理香草蘭鮮豆莢增加香蘭素釋放速度。Ruiz-Terán等[10]使用戊聚糖復合酶和纖維素酶兩步法將香草蘭中香蘭素含量提高了3.13倍。Waliszewski等[11]采用3種纖維素酶制劑預處理的香草蘭切段豆莢香蘭素含量增加2倍。Naidu等[12]采用茶葉酶或者戊聚糖復合酶輔助提取香草蘭鮮豆莢中的香蘭素，含量高達4.2%。Perera和Owen[13]表明聯(lián)合機械和冷凍處理后外源添加果膠酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶可以使香蘭素含量達到7%。雖然國內外預處理或外源添加酶對香草蘭提取香蘭素的影響研究報道較多，但未見外源酶處理香草蘭鮮豆莢對除香蘭素之外的主要香氣成分影響的報道。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)外源添加纖維素酶和果膠酶處理香草蘭鮮豆莢可以大大提高香蘭素的提取率[14-15]，在此基礎上，本試驗擬通過外源酶法處理（果膠酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、戊聚糖酶和復合酶）香草蘭鮮豆莢，對比單獨添加外源酶和復合酶的差異性，以便在保證成本的基礎上尋求主要香氣成分含量最高的香草蘭提取工藝，為香草蘭的深加工、品質控制提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物及藥品 成熟伴有底部微微發(fā)黃無開裂的香草蘭豆莢2014年11月采自興隆熱帶植物園；香蘭素、香蘭酸、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲酸標準品購買于Sigma公司；纖維素酶（15 000 U/g）購買于國藥集團化學試劑有限公司；果膠酶（30 000 U/g）購于阿拉丁試劑公司；β-葡萄糖苷酶（9 300 U/g）購于sigma公司；戊聚糖復合酶（100 FBG/g）購于諾維信酶制劑公司；無水乙醇、冰醋酸（均為分析純）購于天津天大化工實驗廠。

1.1.2 儀器與設備 150HL250HL恒溫恒濕干燥箱（上海一恒科學儀器公司）；RT5高效多點加熱磁力攪拌器（德國IKA公司）；Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；KQ-600B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；索式抽提器（蜀牛玻璃儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 水分測定 采用GB/T 5009.3-2003測定。

1.2.2 傳統(tǒng)發(fā)酵法 根據(jù)Dignum等[2]方法進行部分修改，500 g一級香草蘭鮮豆莢首先于70 ℃殺青1.5 min，于恒溫恒濕箱保持相對濕度為95%，溫度為60 ℃發(fā)汗3 h，50 ℃發(fā)汗3 h，45 ℃發(fā)汗3 h，40 ℃發(fā)汗18 h，干燥粉碎備用，經(jīng)測定香草蘭鮮豆莢和發(fā)酵好的豆莢水分含量分別為86.19%和15.20%。粉碎的香草蘭粉末根據(jù)Zhang等[15]的方法進行索式提取，提取的溶液上高效液相檢測葡糖香草醛、香蘭素、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸。

1.2.3 冷凍-溶解處理 冷凍-溶解處理方法根據(jù)Perera等[13]的方法做適當修改，選取新鮮的一級香草蘭豆莢每5根真空包裝成一袋，置于超低溫冰箱-40 ℃處理24 h，于37 ℃溶解，經(jīng)處理后的豆莢稱為冷凍-溶解豆莢。

1.2.4 外源酶處理法 參照莫麗梅等[14]、Zhang等[15]的方法并作部分修改，準確稱取一級香草蘭鮮豆莢和冷凍-溶解香草蘭豆莢各200.0 g，按重量比1 ∶ 1加入水打漿，打漿后香草液pH為5.4，平均分成20份，每份20 g，在指定溫度下分別加入纖維素酶、果膠酶、β葡萄糖苷酶、戊聚糖復合酶和單酶組成的復合酶，另取一份20 g香草蘭漿液同樣條件不加酶作為空白對照，酶解8 h后，于沸水浴中保溫10 min滅酶。濾液冷卻后加入無水乙醇，使無水乙醇的體積分數(shù)為47.5%，室溫下醇提30 min，過濾，定容得到香蘭素浸提液，樣品待上高效液相檢測計算葡糖香草醛、香蘭素、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量。

1.2.5 不同處理香草蘭豆莢中主要香氣成分測定

根據(jù)Naidu[12]的方法略作修改，主要香氣的檢測采用安捷倫1260高效液相色譜法，儀器配備反相色譜柱Agilent ZORBAX XDB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm），柱溫設定為30 ℃；流動相乙腈與水按照體積比設定為10 ∶ 90，流速設定為1.0 mL/min；所有標準品配成濃度分別為20、40、60、80、100和120 μg/mL的溶液，設定進樣量為5 μL，每個樣品進樣3次，紫外檢測波長設定為280 nm，靈敏度為0.01AUFS。樣品在上機分析之前要過0.45 μm膜。以色譜峰的峰面積積分與對應標準品濃度作圖繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算不同處理香草蘭豆莢中主要香氣成分含量，含量統(tǒng)一以干基含量（%）表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 12.0.1計算每組數(shù)據(jù)的平均值、標準偏差和顯著性差異，顯著性差異設定置信區(qū)間為95%（最小顯著性差異的方法，p<0.05），所有試驗結果均重復3次。

2 結果與分析

2.1 外源酶處理對香草蘭鮮豆莢主要香氣成分的影響

2.1.1 葡糖香草醛和香蘭素 如圖2所示，新鮮香草蘭鮮豆莢中香蘭素前體物質-葡糖香草醛含量為11.38%，而香蘭素含量為0.21%。所有外源酶處理后的香草蘭中香蘭素含量均顯著增加，經(jīng)過纖維素酶-果膠酶-β葡萄糖苷酶處理后的香蘭素含量最高為4.68%。香蘭素含量由高到低分別是纖維素酶-β葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、果膠酶-β葡萄糖苷酶、β葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶、果膠酶處理，對應香蘭素含量分別為3.78%、3.59%、3.34%、3.21%、3.05%、2.36%、2.26%、1.68%，對應前體物質-葡糖香草醛含量分別為4.01%、4.34%、4.92%、5.19%、5.52%、6.94%、7.15%、8.35%。相比于傳統(tǒng)發(fā)酵所得香蘭素含量1.98%，除了果膠酶處理之外，其他外源酶處理均增加香蘭素含量。傳統(tǒng)發(fā)酵和鮮豆莢香蘭素轉化率分別為35%和4%，纖維素酶-果膠酶-β葡萄糖苷酶、纖維素酶-β葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、果膠酶-β葡萄糖苷酶、β葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶、果膠酶處理后香蘭素轉化率分別為71%、66%、63%、58%、56%、53%、41%、39%、29%。相比較于傳統(tǒng)發(fā)酵生香，外源酶纖維素酶-果膠酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、果膠酶-β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶增加香蘭素轉化率分別為36%、31%、28%、23%、21%、18%、6%、4%。

2.1.2 對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸

如圖3所示，新鮮香草蘭豆莢中對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量太少未檢出。傳統(tǒng)發(fā)酵香草蘭豆莢對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量分別為0.022%、0.023%和0.050%。經(jīng)纖維素酶-果膠酶-β葡萄糖苷酶、纖維素酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、果膠酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、β-葡萄糖苷酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶、果膠酶處理后對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量分別為0.049%、0.041%和0.072%，0.041%、0.037%和0.067%，0.038%、0.034%和0.066%，0.036%、0.031%和0.051%，0.031%、0.029%和0.060%，0.029%、0.026%和0.054%，0.023%、0.025%和0.056%，0.027%、0.024%和0.053%，0.024%、0.016%和0.058%。相比于傳統(tǒng)發(fā)酵，除果膠酶處理后的香草蘭豆莢中對羥基苯甲酸含量降低外，其他經(jīng)過外源酶處理后香草蘭豆莢對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量均有不同程度增加，其中經(jīng)過纖維素酶-果膠酶-β葡萄糖苷酶處理后對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量增加最顯著（0.027%、0.018%和0.022%，p<0.05）。

2.2 冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理對香草蘭鮮豆莢主要香氣成分的影響

2.2.1 葡糖香草醛和香蘭素 如圖4所示，新鮮香草蘭鮮豆莢中香蘭素前體物質-葡糖香草醛含量為11.38%，而香蘭素含量為0.21%，經(jīng)過冷凍-溶解處理后葡糖香草醛含量為10.21%，而香蘭素含量為0.67%。空白對照葡糖香草醛含量為9.79%，而香蘭素含量為0.98%。對比空白樣品，所有冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理后的香草蘭中香蘭素含量均顯著增加，經(jīng)過纖維素酶-果膠酶-β葡萄糖苷酶處理后的香蘭素含量最高為5.66%。香蘭素含量由高到低分別是果膠酶-β葡萄糖苷酶、纖維素酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、果膠酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶處理，對應香蘭素含量分別為5.42%、5.11%、5.01%、4.96%、4.61%、3.98%、3.22%、2.98%，對應前體物質-葡糖香草醛含量分別為0.62%、1.26%、1.47%、1.57%、2.27%、3.59%、5.17%、5.66%。相比于傳統(tǒng)發(fā)酵所得香蘭素含量1.98%，所有冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理香草蘭鮮豆莢均顯著增加香蘭素含量（p<0.05）。傳統(tǒng)發(fā)酵和空白組香蘭素轉化率分別為35%和17%，纖維素酶-果膠酶-β-葡萄糖苷酶、果膠酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-β葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、果膠酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶處理后香蘭素轉化率分別為98%、94%、89%、87%、86%、81%、70%、56%、52%。相比較于傳統(tǒng)發(fā)酵生香，冷凍-溶解聯(lián)合外源纖維素酶-果膠酶-β-葡萄糖苷酶、果膠酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、果膠酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶增加香蘭素轉化率分別為63%、59%、54%、52%、51%、46%、35%、21%、17%。

如圖4所示，對比未經(jīng)過冷凍-溶解的外源酶處理，經(jīng)過冷凍-溶解聯(lián)合外源纖維素酶-果膠酶-β-葡萄糖苷酶、果膠酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、果膠酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶處理增加香蘭素含量分別為2.93%、2.08、1.96%、1.75%、1.33%、1.26%、0.98%、0.72%、0.39%，香蘭素轉化率分別提高52%、46%、34%、30%、23%、17%、15%、13%、7%。

2.2.2 對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸

如圖5所示，新鮮香草蘭豆莢中對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量太少未檢出。傳統(tǒng)發(fā)酵香草蘭豆莢和空白對照組對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量分別為0.022%、0.023%和0.050%，0.024%、0.011%和0.038%。經(jīng)冷凍-溶解聯(lián)合外源纖維素酶-果膠酶-β-葡萄糖苷酶、果膠酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、果膠酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶處理后對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量分別為0.089%、0.069%和0.101%，0.053%、0.042%和0.083%，0.076%、0.046%和0.072%，0.039%、0.039%和0.067%，0.046%、0.034%和0.068%，0.048%、0.025%和0.059%，0.041%、0.042%和0.064%，0.029%、0.032%和0.061%，0.030%、0.027%和0.056%。相比于傳統(tǒng)發(fā)酵，經(jīng)過冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理后香草蘭豆莢對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量均增加，其中經(jīng)過纖維素酶-果膠酶-β-葡萄糖苷酶處理后對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量增加最顯著（0.067%、0.046%和0.051%，p<0.05）。

如圖5所示，與未經(jīng)過冷凍-溶解的外源酶處理相比，冷凍-溶解聯(lián)合外源纖維素酶-戊聚糖復合酶、戊聚糖復合酶和纖維素酶對香草蘭中對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量無顯著性影響，然而纖維素酶-果膠酶-β葡萄糖苷酶、果膠酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、果膠酶均顯著增加對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量（p<0.05），增加量分別為0.04%、0.028%和0.029%，0.018%、0.011%和0.032%，0.035%、0.009%和0.005%，0.008%、0.010%和0.007%，0.017%、0.008%和0.014%。β-葡萄糖苷酶對對羥基苯甲酸含量影響顯著（p<0.05），含量增加0.009%，而對對羥基苯甲醛和香蘭酸含量無顯著影響。

3 討論與結論

據(jù)Odoux[4]報道，香草蘭鮮豆莢中香氣成分主要以糖苷類底物存在，其中最重要的香氣成分就是香蘭素，是由前體物質-葡糖香草醛經(jīng)過發(fā)酵過程中內源β-葡萄糖苷酶水解產生。另據(jù)Ranadive[16]報道，除了對香草蘭風味起重要作用的香蘭素，還存在對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸，它們均以葡糖甙的形式存在，香草蘭中這4種成分被稱之為主要香氣成分。

由本試驗的結果可知，相比于傳統(tǒng)發(fā)酵方法，外源纖維素酶-果膠酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-戊聚糖復合酶、果膠酶-β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶-果膠酶、戊聚糖復合酶、纖維素酶處理香草蘭鮮豆莢均可顯著增加香蘭素含量。Ruiz-Terán等[10]研究表明采用戊聚糖復合酶和纖維素酶處理香草蘭鮮豆莢分別得到2.45%和2.70%的香蘭素，此結果與本文所得的2.36%和2.26%相似。Perera和Owen[13]研究表明采用果膠酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和果膠酶-纖維素酶-β-葡萄糖苷酶處理香草蘭鮮豆莢分別得到1.4%、3.7%、4%和7%的香蘭素。本試驗中果膠酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶處理香草蘭鮮豆莢香蘭素含量分別為1.68%、2.26、3.21%。與Ruiz-Terán等[10]的結果差異是由于采用了不同地方的香草蘭豆莢，除產地之外，栽培的氣候和栽培條件也可能對香蘭素含量產生影響。Naidu等[12]采用戊聚糖復合酶輔助提取香草蘭鮮豆莢中的香蘭素，含量為2.59%，與本試驗的戊聚糖復合酶處理所得結果相似。

在外源酶基礎上，本文采用冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理香草蘭鮮豆莢，結果表明冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理香草蘭鮮豆莢可以顯著提高香蘭素轉化率和香蘭素含量，也可以顯著提高對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量。這可能是由于新鮮香草蘭豆莢的細胞是完整的，普通的外源酶因果膠和纖維素等物質的隔離不能完全與底物接觸，經(jīng)過冷凍處理會破壞細胞壁，在果膠酶、纖維素酶水解果膠和纖維素使得β-葡萄糖苷酶與底物可以充分接觸從而提高香蘭素的含量。Perera和Owen[13]表明冷凍-溶解聯(lián)合果膠酶-纖維素酶-β-葡萄糖苷酶處理香草蘭鮮豆莢得到7%的香蘭素。而本試驗冷凍-溶解聯(lián)合果膠酶-纖維素酶-β-葡萄糖苷酶處理香草蘭鮮豆莢得到5.66%的香蘭素。結果的不同是由于采用的是湯加的豆莢，含有超過15%的葡糖香草醛，經(jīng)過全部轉化可產生超過7.2%的香蘭素，而本試驗采用的豆莢是海南產，含有11.8%的葡糖香草醛，經(jīng)過全部轉化可產生5.72%的香蘭素。Naidu等[12]采用茶葉酶輔助提取香草蘭鮮豆莢中的香蘭素，含量為4.2%，與本試驗采用纖維素酶-果膠酶-β-葡萄糖苷酶處理所得結果相似。Odoux等[4]表明通過冷凍-融化聯(lián)合內源β-葡萄糖苷酶處理破壞細胞壁完整性，得到2.3%的香蘭素含量。Waliszewski等[11]采用3種纖維素酶制劑預處理的香草蘭切段豆莢得到的香蘭素含量。Ranadive[16]表明香草蘭鮮豆莢殺青后外源添加β-葡萄糖苷酶提高對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量（22.5‰、2.8‰、8.9‰）。與Ranadive[16]結果相比，本試驗采用冷凍-溶解聯(lián)合外源酶處理得到的對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量更高。這可能由于瞬時微波殺青雖然會破壞細胞完整性，但是沒有本實驗中采用冷凍-溶解破壞香草蘭細胞數(shù)量多，雖然添加β-葡萄糖苷酶，但由于部分細胞未被破壞，加上即使細胞壁被破壞，仍然有果膠和纖維素等物質隔離β-葡萄糖苷酶和底物，而本實驗中添加果膠酶、纖維素酶或其混合處理會顯著增加對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸和香蘭酸含量。

參考文獻

[1] Childers N F， Cibes H R， Hernandez-Medina E. Vanilla-the orchid of commerce. In C. L. Withner（Ed.）， The orchids： A scientific survey[M]. Malabar， FL： Krieger， 1959： 477-508.

[2] Dignum M J， Kerler J， Verpoorte R. Vanilla curing under laboratory conditions[J]. Food Chemistry， 2002， 79（2）： 165-171.

[3] Odoux E， Escoute J， Verdeil J L. The relation between glucovanillin， b-D-glucosidase activity and cellular compartmentation during the senescence， freezing and traditional curing of vanilla beans[J]. Annals of Applied Biology， 2006， 149： 43-52.

[4] Odoux E. Glucosylated aroma precursors and glucosidase（s）in vanilla beans（Vanilla planifoliaG Jackson）[J]. Fruits， 2006， 61： 171-184.

[5] Ansaldi G M， Marseille G G， Aubagne J L P. Process for obtaining natural vanilla flavor by treatment of green vanilla beans， and the flavor obtained[P]. 1990， US Patent no： 4956192.

[6] Mane J， Zucca J. Method for obtaining a natural vanilla aroma by treatment of vanilla beans and aroma thus obtained[P]. 1993， French patent No： 2691880.

[7] Gu F L， Xu F， Tan L H， et al. Optimization of Enzymatic Process for Vanillin Extraction Using Response Surface Methodology[J]. Molecules， 2012， 8 753-8 761.

[8] Brunerie P M. Process of the production of natural vanilla aroma extracts by enzymatic processing of green vanilla pods and extract thereby obtained[P]. 1998， US Patent No： 5705206.

[9] Ovando S L， Waliszewski K N， Pardio V T. The effect of hydration time and ethanol concentration on the rate of hydrolysis of extracted vanilla beans by commercial cellulase preparations[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2005， 40： 1 011-1 018.

[10] Ruiz-Terán F， Perez-Amador I， López-Munguia A. Enzymatic Extraction and Transformation of Glucovanillin toVanillin from Vanilla Green Pod[J]. Journal of Agricultural and food chemistry， 2001， 4： 341-347.

[11] Waliszewski K N， Ovando S L， Pardio V T. Effect of hydration and enzymatic pretreatment of vanilla beans on the kinetics of vanillin extraction[J]. Journal of Food Engineering， 2007， 78： 1 267-1 273.

[12] Naidu M M， Sujith Kumar P V， Shyamala B N， et al. Enzyme-Assisted Process for Production of Superior Quality Vanilla Extracts from Green Vanilla Pods Using Tea Leaf Enzymes[J]. Food and Bioprocess Technology， 2012， 5： 527-532.

[13] Perera C O， Owen E. Effect of Tissue Disruption by Different Methods Followed by Incubation with Hydrolyzing Enzymes on the Production of Vanillin from Tongan Vanilla Beans[J]. Food Bioprocess Technology， 2010， 3： 49-54.

[14]莫麗梅， 張彥軍， 谷風林， 等. 二次回歸中心組合法優(yōu)化外源纖維素酶酶解提取香草蘭鮮豆莢香蘭素工藝[J]. 食品科學， 2013， 34（18）： 18-22.

[15] Zhang Y J， Mo L M， Chen F， et al. Optimized production of vanillin from green vanilla pods by enzyme-assisted extraction combined with pre-freezing and thawing[J]. Molecules， 2014， 19（2）： 2 181-2 198.

[16] Ranadive A S. Vanillin and related flavor compounds in vanilla extracts made from beans of various global origins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1992， 40（10）： 1 922-1 924.