四棱豆肽的分離鑒定及其抗疲勞特性研究

劉晶　王海燕　劉煥云　許冬倩　王子蕭

摘 要 為了探討四棱豆肽組分的抗疲勞效果及對(duì)抗疲勞肽進(jìn)行分離和鑒定，采用堿性蛋白酶對(duì)四棱豆蛋白進(jìn)行酶解，經(jīng)反相液相色譜分離后，得到Sample1、Sample2和Sample3 3個(gè)主要組分，分別以1.5 g/kg體重的劑量灌胃小鼠。結(jié)果表明：經(jīng)游泳耐力實(shí)驗(yàn)，3個(gè)組分都可以延緩小鼠的游泳疲勞，但與四棱豆蛋白組相比，僅Sample3肽成分可以顯著延緩小鼠的游泳疲勞，提高血漿中葡萄糖和游離脂肪酸的含量和肝糖原的水平。通過(guò)氨基酸組成分析，Sample3中富含抗氧化的疏水氨基酸（Leu、Ala、Ile、Pro、Val和Phe），可以有效延緩由自由基引發(fā)的疲勞。經(jīng)過(guò)色譜分離，得到Sample3肽成分中一個(gè)優(yōu)勢(shì)的小肽S1，其氨基酸序列為Gln-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val，符合抗疲勞肽的特點(diǎn)。灌胃小鼠sample3組分和分子量小于1 000的米渣蛋白肽，疲勞前的游泳時(shí)間沒(méi)有顯著性差異，灌胃肽S1后的小鼠疲勞前的游泳時(shí)間顯著增加。說(shuō)明肽S1是一種潛在的天然抗疲勞物質(zhì)。

關(guān)鍵詞 抗疲勞；四棱豆蛋白；四棱豆肽；分離鑒定

中圖分類號(hào) Q493.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Isolation and Characterization of a Peptide from Psophocarpus tetragonolobus（L.）DC. with High Anti-fatigue Activity

LIU Jing1，WANG Haiyan1，LIU Huanyun1，XU Dongqian1，WANG Zixiao2

1 College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang，Hebei 050061，China

2 College of Bioscience and Bioengineering，South West University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621010，China

Abstract In order to explore the effect of a peptide with high anti-fatigue from Psophocarpus tetragonolobus（L.）DC.，the peptide was separates and characterized after alkalase hydrolysis. Three main components， Sample1，Sample2 and Sample3 were separated by RP-HPLC. The swimming fatigue time could extend significantly compared with that in vehicle group in swimming endurance test for the mice orally administered three components a dose of 1.5 g/kg body weight respectively. Compared with the P. tetragonolobus protein group，only the Sample3 group could significantly prolong the swimming fatigue time，and increase the content of glucose and free fatty acids in plasma and the level of hepatic glycogen. By amino acid composition analysis，Sample3 contained abundant antioxidant amino acids，such as Leu， Ala， Ile， Pro， Val and Phe（hydrophobic amino acid），and could effectively delay the fatigue induced by free radicals. After chromatographic separation，a small peptides S1 with mino acid sequence Gln-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val was identified from Sample3，which was in line with the characteristics of anti-fatigue peptide. There were no significant differences in swimming fatigue time in Sample3 group and rice residue peptide group with molecular weight of less than 1 000. The swimming fatigue time of mice in peptide S1 group increased significantly. Peptide S1 could be used as a natural anti-fatigue substance.

Key words Anti-fatigue；Four winged bean protein；Four winged bean peptide；Isolation and identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.018

四棱豆種子的蛋白質(zhì)含量為30%，含多種氨基酸，種類高達(dá)18種，包括各類人體必需氨基酸，其中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的含量豐富，且氨基酸組成合理，其中賴氨酸含量比大豆還高[1-2]。四棱豆中富含的VE、硒元素和豆類黃酮物質(zhì)是抗氧化和緩解脂質(zhì)過(guò)氧化的重要組成部分。四棱豆具有一定的藥用價(jià)值，具有防衰老、抗癌、降壓、補(bǔ)血、明目及清熱解毒等多項(xiàng)功效[3]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)四棱豆的研究主要有吉首大學(xué)研制的四棱豆乳酸發(fā)酵飲料[4]；廣東肇慶學(xué)院在四棱豆葉中提取凝集素并對(duì)凝集活性進(jìn)行研究[5]，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)用四棱豆硒蛋白灌胃大鼠，增加大鼠體內(nèi)的硒含量。四棱豆同其他豆科植物一樣均含有若干抗?fàn)I養(yǎng)因子，其中活性較強(qiáng)的蛋白酶抑制劑與血球凝集素制約了四棱豆的應(yīng)用。在國(guó)外，Wan等[6]制備出具有高血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的四棱豆肽，Alexander等[7]從四棱豆中提取凝集素。

四棱豆蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解，可得到四棱豆肽[8]，消除了抑制劑和凝集素的不良作用。與蛋白相比，低分子的肽更易被人體吸收和利用[9-10]，一些植物動(dòng)物蛋白肽已經(jīng)應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)食品及抗疲勞保健食品[11]。目前，還未見(jiàn)關(guān)于四棱豆蛋白肽具有抗疲勞特性的文獻(xiàn)報(bào)道。研究四棱豆肽抗疲勞性等生物活性，為更好地開(kāi)發(fā)、利用熱帶作物資源及提高四棱豆蛋白的利用提供了理論依據(jù)；分析抗疲勞肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為研究肽的抗疲勞機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 四棱豆購(gòu)自濟(jì)南綠禾野菜種業(yè)有限公司；所有抗疲勞試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程中心；堿性蛋白酶購(gòu)自諾維信；色譜分析試劑為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 實(shí)驗(yàn)所用主要設(shè)備見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 四棱豆肽和四棱豆蛋白制備工藝 四棱豆肽：四棱豆蛋白→配成溶液→調(diào)pH值→酶解（堿性蛋白酶）→滅酶（95 ℃，15 min）→離心（4 000 r/min，20 min）→上清液→四棱豆肽→反相高效液相色譜分離→得到Sample1、Sample2和Sample3 3個(gè)優(yōu)勢(shì)組分→冷凍干燥

四棱豆蛋白制備工藝：四棱豆→脫皮→粉碎→60 ℃乙醚回流脫脂6～8 h→調(diào)至pH10→離心（4 000 r/min，20 min）→上清液→調(diào)至pH4→離心（4 000 r/min， 20 min）→取沉淀→四棱豆粗蛋白→大孔樹(shù)脂的分離純化[12]→冷凍干燥→四棱豆蛋白[13]

1.2.2 樣品和小鼠處理 60只小鼠被分為6組（每組n=10），每組實(shí)驗(yàn)鼠分別給予1.5 g/kg體重的灌胃劑量，各處理如下：（1）對(duì)照組（0.9%生理鹽水）；（2）四棱豆蛋白組（FWBP）；（3）四棱豆肽組（FWBPP）；（4）Sample1組；（5）Sample2組；（6）Sample3組。上述所有樣品都溶解在0.9%的生理鹽水中，給實(shí)驗(yàn)鼠的灌胃劑量為每天200 μL，持續(xù)6周。

1.2.3 抗疲勞試驗(yàn) 采用游泳耐力實(shí)驗(yàn)，利用不同含量的葡萄糖、乳酸、游離脂肪酸（NEFA）和血液中尿氮（BUN）、肝糖原和肌糖原進(jìn)行四棱豆蛋白及其肽的抗疲勞實(shí)驗(yàn)[12]。

1.2.4 氨基酸分析 準(zhǔn)確吸取0.2 mL 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣液，用pH2.2的緩沖液稀釋至氨基酸濃度為5 nmol/50 μL。分別往氨基酸自動(dòng)分析儀中注入氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品，測(cè)定樣品中的氨基酸含量。

樣品的氨基酸組成/（g/kg）=

×1 000

1.2.5 四棱豆肽的分子篩色譜和反相高效液相色譜純化以及肽的氮端測(cè)序 經(jīng)分子篩色譜純化后的峰樣品，經(jīng)反相高效液相色譜進(jìn)一步純化得到肽樣品，再經(jīng)肽的氮端測(cè)序得到純化肽的氨基酸序列[12]。

1.2.6 肽S1與sample3和分子量小于1 000的米渣肽（RSPⅠ）抗疲勞特性的比較 通過(guò)游泳耐力實(shí)驗(yàn)對(duì)純化出的肽S1與sample3和分子量小于1 000的米渣肽[12]進(jìn)行比較，對(duì)肽S1的抗疲勞特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 四棱豆肽的RP-HPLC分離

由圖1可以看出，四棱豆蛋白經(jīng)過(guò)酶解后的水解蛋白組成復(fù)雜。取反相色譜分離后的3個(gè)優(yōu)勢(shì)組分Sample1、Sample2和Sample3作為下一階段抗疲勞作用的試驗(yàn)物質(zhì)。隨著保留時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)組分的疏水性依次提高。

2.2 四棱豆蛋白和四棱豆肽的成分分析

從表2可以看出，四棱豆蛋白和四棱豆肽的組成沒(méi)有顯著性差異，但通過(guò)反相液相色譜分離出的3個(gè)肽組分Sample1、Sample2和Sample3中的蛋白質(zhì)含量高于四棱豆蛋白和四棱豆肽的。為了避免不同組之間由于蛋白含量的差異而造成灌胃小鼠抗疲勞能力的差異，實(shí)驗(yàn)需要灌胃相同蛋白含量的樣品。各組間脂肪和水分含量沒(méi)有顯著差異；雖然Sample1、Sample2和Sample3的灰分含量顯著低于四棱豆蛋白和四棱豆肽的，但灰分不具有抗疲勞特性，因此其它成分不會(huì)對(duì)各組的抗疲勞特性產(chǎn)生影響[7]。

2.3 小鼠疲勞前的游泳時(shí)間比較

由表3可以看出，在第一周和第二周時(shí)，疲勞前不同組之間的游泳時(shí)間沒(méi)有顯著性差異；在第四周和第六周時(shí)，四棱豆肽和其3個(gè)組分組疲勞前的游泳時(shí)間與對(duì)照組之間具有顯著性差異，且Sample3游泳時(shí)間明顯長(zhǎng)于FWBP組；在第六周時(shí)，Sample1、Sample2和Sample3組與對(duì)照組都具有顯著性差異，但僅Sample3組與FWBP組和FWBPP組相比游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)。六周內(nèi)，對(duì)照組和FWBP組游泳時(shí)間沒(méi)有顯著性差異；在第四周和第六周時(shí)，F(xiàn)WBPP、sample1和sample2組與FWBP組相比無(wú)顯著性差異。

2.4 四棱豆肽的抗疲勞作用

在6組小鼠中，Sample3組中血漿葡萄糖值最高，與其它組有顯著性差異。FWBP、FWBPP、 Sample1和Sample2組與對(duì)照組相比也能顯著提高血漿中葡萄糖的含量（表4），但與FWBP組相比，僅Sample3組可以顯著提高血漿中的葡萄糖值。除Sample3組外，各組之間血乳酸含量沒(méi)有顯著性差異。Sample2組和Sample3組顯著提高了NEFA的濃度。各組中BUN含量無(wú)顯著性差異。與對(duì)照組相比，Sample1、Sample2和Sample3組中肝糖原的含量顯著提高，但僅Sample3組中肝糖原的含量顯著高于FWBP組。各組之間肌糖元的含量沒(méi)有顯著性差異。

2.5 四棱豆肽及其組分的氨基酸分析

由表5可以看出，Sample3中Leu、Ala、Ile、Pro、Val和Phe等疏水性氨基酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FWBP組和Sample1、Sample2組。Ren等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肽中含有疏水性氨基酸時(shí)，肽鏈表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，能夠抑制氧自由基、金屬離子等催化的脂類氧化，因而具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)和抗疲勞作用，這是Sample3具有較高的抗疲勞性的原因之一。

2.6 Sample3組分的分子篩色譜和RP-HPLC純化

如圖2-A所示，通過(guò)分子篩高效液相色譜對(duì)Sample3進(jìn)行提純，得到一個(gè)優(yōu)勢(shì)組分P1。將P1進(jìn)行RP-HPLC純化，結(jié)果如圖2-B所示。分子篩高效液相色譜是通過(guò)分子的大小和形狀的不同分離肽物質(zhì)的，因此得到的峰物質(zhì)P1是分子大小和形狀相近的肽，為了保證P1的純度，需要對(duì)P1進(jìn)一步純化。RP-HPLC是根據(jù)分子疏水性的差異進(jìn)行肽的分離。2種色譜的分離原理不同，具有相近分子量及形狀的肽疏水性可能差異很大，因此通過(guò)2種方式的色譜分離可以使分離后的肽純度提高[12]。將S1通過(guò)RP-HPLC分離純化后，得到一個(gè)純化的肽S1。

2.7 組分S1的氮端測(cè)序結(jié)果

通過(guò)蛋白測(cè)序儀測(cè)定組分S1的氨基酸組成，結(jié)果見(jiàn)圖3，S1肽段共有9個(gè)氨基酸，組成為Gln-Ser-Pro-Pro- Glu-Ile-Asn-Thr-Val。

2.8 四棱豆肽和米渣肽耐疲勞游泳實(shí)驗(yàn)的比較研究

已有研究證明，分子量小于1 000的米渣肽具有較高的抗疲勞特性[12]。由表6可以看出，四棱豆肽的組分Sample3和分子量小于1 000的米渣肽相比，疲勞前的游泳時(shí)間沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明具有高疏水性的四棱豆肽的抗疲勞性與分子量小于1 000的米渣肽相當(dāng)。Sample1、Sample2和Sample3 3個(gè)組分的分子量均低于1 000，但僅抗疲勞性高的Sample3與米渣肽沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明四棱豆肽的抗疲勞性低于米渣肽，這在一定程度上限制了四棱豆肽的應(yīng)用。但灌胃從四棱豆中純化出來(lái)的肽S1，4周后小鼠疲勞前的游泳時(shí)間顯著增加，說(shuō)明肽S1可以作為一種潛在的天然抗疲勞物質(zhì)，在四棱豆肽中是否存在其它高抗疲勞肽還需要進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

選取經(jīng)RP-HPLC分離后含量最高的3個(gè)肽成分，通過(guò)游泳耐力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比3個(gè)肽成分都可以延緩小鼠的游泳疲勞。但與四棱豆蛋白組相比，僅Sample3肽成分可以顯著延緩小鼠的游泳疲勞。疲勞前的游泳時(shí)間是評(píng)價(jià)灌胃物質(zhì)抗疲勞效果的直觀指標(biāo)，灌胃小鼠四棱豆蛋白和四棱豆肽后，游泳時(shí)間延長(zhǎng)，Sample3抗疲勞效果優(yōu)于其它組。Yu等[15]發(fā)現(xiàn)灌胃小鼠高劑量的大豆肽，可以使疲勞前的平均游泳時(shí)間增加70%。本研究中，灌胃Sample3后，在第六周時(shí)小鼠疲勞前的游泳時(shí)間比四棱豆蛋白組增加139%。在四棱豆肽3組組分中，sample3富含Leu、Ala、Ile、Pro、Val和Phe等疏水性氨基酸和支鏈氨基酸，可以捕獲自由基，能對(duì)抗運(yùn)動(dòng)所致的自由基損傷，清除或阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，延緩在運(yùn)動(dòng)中產(chǎn)生的自由基引發(fā)的疲勞[16]。Ding等[17]發(fā)現(xiàn)具有較高自由基清除活性的水母膠原蛋白水解物可以顯著延緩小鼠的運(yùn)動(dòng)疲勞。You等[18]發(fā)現(xiàn)用木瓜蛋白酶水解的具較高抗疲勞特性的泥鰍蛋白肽中支鏈氨基酸含量高，這與本研究結(jié)論[Sample3中支鏈氨基酸（亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸）的含量高，具有高抗疲勞特性]一致。

灌胃小鼠Sample3后，小鼠血漿中葡萄糖、NEFA、肝糖原含量顯著提高，血乳酸含量顯著降低。高葡萄糖含量可以保證小鼠在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的能量供應(yīng)，減少由于能量不足而引發(fā)的肌肉疲勞。血乳酸含量的顯著降低可以避免由于肌肉酸痛而造成的疲勞感。NEFA含量的增加，表明脂肪代謝增加，脂肪部分代替葡萄糖成為了能量的利用物質(zhì)[19]。Li等[20]灌胃小鼠中、高劑量的黑豆肽顯著降低了小鼠血乳酸的含量。Sampe3組小鼠肝糖原含量較四棱豆蛋白組高55%以上，有利于小鼠在運(yùn)動(dòng)中的能量補(bǔ)給，提高小鼠的游泳耐力。與蛋白組相比，Wang等[21]制備的鮐魚(yú)肽可以提高33%～35%的肝糖原水平，低于四棱豆肽對(duì)肝糖原的補(bǔ)充水平。BUN 含量可反映體內(nèi)蛋白質(zhì)分解情況，當(dāng)能量供應(yīng)不足時(shí)，可導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)分解以供能，蛋白質(zhì)作為身體的框架結(jié)構(gòu)成分，如果被分解破壞必然會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)功能的正常發(fā)揮受到影響，出現(xiàn)疲勞等癥狀。由于小鼠灌胃的物質(zhì)是肽，其在肌肉組織中氧化脫氨，一方面生成相應(yīng)的 α- 酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化以供能；另一方面，脫下來(lái)的氨基與丙酮酸或谷氨酸偶聯(lián)，形成丙氨酸和谷氨酸酰胺，以提供能量，在特殊的應(yīng)急情況下，可直接向肌肉供能。由于肽易于被吸收及迅速利用，因此抑制或縮短了體內(nèi)“負(fù)N平衡”，尤其是運(yùn)動(dòng)前添加肽，可減少肌蛋白降解，維持體內(nèi)正常蛋白質(zhì)合成，減輕或延緩由運(yùn)動(dòng)引發(fā)的其它生理方面改變，達(dá)到抗疲勞的效果[22]。

經(jīng)過(guò)RP-HPLC和分子篩液相色譜分離得到Sample3肽成分中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)小肽S1，經(jīng)蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定，肽的氨基酸序列為Gln-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn- Thr-Val。肽S1中富含Pro這一抗氧化性氨基酸，碳端具有Val，內(nèi)部具有Ile，這些氨基酸具有較高的抗氧化活性，可以延緩由自由基引發(fā)的疲勞。肽S1符合抗疲勞肽的特點(diǎn)，可以作為一種潛在的天然抗疲勞物質(zhì)。目前，僅有Wan等[6]從四棱豆中制備出了具有高血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的肽，而對(duì)四棱豆抗疲勞肽的制備和鑒定還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此，對(duì)四棱豆肽生物活性的研究及其機(jī)理探討有待深入。

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