大苞鞘石斛與鐵皮石斛主要活性成分比較分析

章金輝　王再花　李杰　葉慶生　朱根發(fā)

摘 要 石斛（Dendrobium）是一類名貴中藥材，活性成分的構(gòu)成也直接影響著石斛屬植物的藥用價值。為了探明大苞鞘石斛（Dendrobium warkianum Warner.）的藥用價值，比較了其與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum Lindl.）多糖、生物堿、氨基酸及微量元素含量的異同。結(jié)果表明，大苞鞘石斛多糖含量較高（p<0.001）；2種石斛生物堿含量都較低；2種石斛都含有所測的19種氨基酸（包含8種必需氨基酸），大苞鞘石斛中的苯丙氨酸（0.111%）、氨基丁酸（0.152%）、天冬氨酸和天冬酰胺（0.115%）等含量較高，而鐵皮石斛只有組氨酸（0.070%）較高；2種石斛都含有所測的8種微量元素，大苞鞘石斛鎂元素（4.06×103 mg/kg）、錳元素（359.33 mg/kg）、鐵（87.80 mg/kg）和硼（16.85 mg/kg）含量較高，而鐵皮石斛鋅含量（34.60 mg/kg）較高。以上研究結(jié)果對大苞鞘石斛的開發(fā)利用具有一定的參考價值。

關(guān)鍵詞 石斛；多糖；生物堿；氨基酸；微量元素

中圖分類號 S682.31 文獻標(biāo)識碼 A

Comparative Analysis of Main Active Ingredient Contents Between Dendrobium warkianum Warner. and Dendrobium catenatum Lindl.

ZHANG Jinhui1，WANG Zaihua1*，LI Jie1，YE Qingsheng2，ZHU Genfa1**

1 Guangdong Key Lab of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization/Environmental Horticulture Research

Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510640，China

2 College of Life Science，South China Normal University，Guangzhou，Guangdong 510631，China

Abstract Dendrobium is a valuable Chinese herbal medicine， and the medicinal value depends on their active constituents. To learn the medicinal value of D. warkianum Warner，we determined the content of polysaccharides，total alkaloids，amino acids and trace elements in both D.warkianum Warner. and D. catenatum Lindl. The results showed that the content of polysaccharides were higher in D. warkianum Warner（p<0.001）. Total alkaloids content were poor in both kinds of Dendrobiums. There were nineteen kinds of amino acids in both kinds of Dendrobiums，including eight kinds of essential amino acids，the content of phenylalanine（0.111%），GABA（0.152%），leucine and isoleucine（0.115%）were significantly higher in D. warkianum Warner and histidine（0.070%）were significantly higher in D. catenatum Lindl respectively. There were eight kinds of trace elements in both kinds of Dendrobiums. The content of Mg（4.06×103 mg/kg，Mn（359.33 mg/kg），F(xiàn)e（87.80 mg/kg），B（16.85 mg/kg） were significantly higher in D. warkianum Warner and Zn（34.60 mg/kg）were significantly higher in D. catenatum Lindl respectively. Taken together，these results showed a certain reference value for the development of D. warkianum Warner.

Key words Dendrobium；Polysaccharides；Total alkaloids；Amino acid；Trace element

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.014

大苞鞘石斛（Dendrobium warkianum Warner.）和鐵皮石斛（Dendrobium catenatum Lindl.）均為蘭科（Orchidaceae）石斛屬植物。2010版《中國藥典》中對于“石斛”的描述是一類中藥的統(tǒng)稱，其基原植物是金釵石斛、鼓槌石斛或流蘇石斛的栽培品或其同屬植物的近似種，而鐵皮石斛是一種中藥，基原植物是鐵皮石斛。雖然都有益胃生津、滋陰清熱的功效，但二者的活性成分卻不相同。鐵皮石斛的主要藥效成分是多糖，并含有豐富的氨基酸[1]和微量元素[2]?？茖W(xué)研究證明鐵皮石斛具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、降血壓[5]、降血糖[3]、鎮(zhèn)痛消炎[6]和增強免疫力[7-8]等作用。雖然鐵皮石斛藥效較好，但由于其植株個體較小、野生資源匱乏、栽培成本高、市場價格昂貴等，在一定程度上限制了鐵皮石斛的大眾消費和銷售市場的快速發(fā)展。為有效保護鐵皮石斛野生資源，降低其生產(chǎn)成本，亟待尋找一種新的可利用開發(fā)的藥用石斛。

大苞鞘石斛又名騰沖石斛，在云南民間一些地方被當(dāng)做“扁黃草”作為藥用，大苞鞘植株個體粗壯、高大，花瓣呈白色并具紫色先端，花色淡雅，在華南地區(qū)能應(yīng)春節(jié)開放，具有極高的觀賞價值。關(guān)于大苞鞘石斛的研究主要集中在化學(xué)成分[9]、種子萌發(fā)[10]、組培快繁[11]和低溫保存[12]等方面，而關(guān)于其活性成分的研究還鮮見報道。本研究通過大苞鞘石斛和鐵皮石斛活性成分的比較分析，探究大苞鞘石斛與鐵皮石斛的異同，為大苞鞘石斛的產(chǎn)業(yè)開發(fā)及研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為大苞鞘石斛（Dendrobium warkianum Warner.）（云南野生種）和鐵皮石斛（Dendrobium catenatum Lindl.）（為云南野生種組培出的實生苗），上述材料栽培于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所溫室大棚內(nèi)。各取一份2.5年生9月-次年1月份成熟的2種石斛莖切成小段，經(jīng)105 ℃殺青15 min，以60 ℃烘干至恒重，再制成粉末，過60目篩，備多糖測定用；另取一份同年齡段及時期的2種石斛莖材料用蒸餾水洗凈，切成小段，以60 ℃烘干至恒重，再制成粉末，過60目篩，用于生物堿、氨基酸、微量元素測定。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量比較 （1）多糖的提取。分別稱取大苞鞘石斛和鐵皮石斛干燥粉末各50 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入石油醚（沸點60～90 ℃）500 mL，80 ℃回流提取1 h，抽濾、揮干、溶媒，重復(fù)上述操作1次；分別往所得2種石斛濾渣中加500 mL 80%的乙醇水溶液按上述操作步驟重復(fù)1次，得2種石斛脫脂干粉；分別往2種石斛脫脂干粉中加入500 mL蒸餾水，80 ℃浸提1 h，抽濾，收集濾液，重復(fù)1次；合并2次濾液，減壓濃縮，加入預(yù)冷無水乙醇使溶液含醇量至80%，于4 ℃靜置過夜，離心，收集沉淀，冷凍干燥得2種石斛粗多糖；分別稱取石斛粗多糖配制成40 mg/mL的水溶液，加入一定量的1 mg/mL的胰蛋白酶（胰酶液和粗多糖溶液的體積比為0.4 ∶ 1），于37 ℃恒溫處理5 h，升溫滅酶，加1/3體積的Sevag溶液，劇烈震蕩5 min，離心，棄下層有機相，于上層水相加入1/3體積的Sevag溶液，重復(fù)以上操作2次，合并上層水相，用蒸餾水透析3 d（透析袋截留分子量為7 500 u）；透析完以后，加入預(yù)冷無水乙醇使溶液含醇量至80%，于4 ℃靜置過夜，離心，收集沉淀，用無水乙醇、丙酮各洗2遍，冷凍干燥得2種石斛精多糖。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL的0.05 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，各加蒸餾水補至2.0 mL，然后各加6%重蒸苯酚1.0 mL，搖勻后加入98%濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min后置沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度（UV-2405型紫外可見分光光度計，日本島津公司）；以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.058 6x+0.033 8 （R2=0.997）。

（3）多糖與葡萄糖換算因子的測定。分別稱取2種石斛精多糖10 mg溶于10 mL蒸餾水，取其中的5 mL配制濃度為50 μg/mL的多糖溶液，吸取樣品溶液0.1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下所述方法測定吸光度，計算樣品中葡萄糖的濃度，由下列公式計算換算因子f。

f=Cs/C

式中：Cs為石斛精多糖溶液的實際濃度；C為回歸方程計算石斛精多糖溶液中葡萄糖的濃度；f為校正系數(shù)。依公式計算得大苞鞘石斛多糖與葡萄糖的換算因子f=2.625，鐵皮石斛多糖與葡萄糖的換算因子f=2.7。

（4）樣品溶液的測定。采用改良的苯酚-硫酸比色法[13-14]測定石斛多糖含量。分別稱取3份大苞鞘石斛和鐵皮石斛9月-次年1月份的干燥粉末各1 g，分別加入100 mL 80%的乙醇，于80 ℃回流提取1 h，抽濾、揮干、溶媒，重復(fù)上述操作1次；往所得濾渣中加入100 mL純水，于80 ℃回流提取1 h后抽濾，重復(fù)上述操作1次，合并濾液，用純水定容至250 mL，搖勻，得到樣品溶液。由下列方公式計算樣品中多糖的含量。

X=f×C×D×100%/W

式中：X為多糖含量；f為石斛多糖與葡萄糖換算因子；C為各石斛樣品溶液中葡萄糖含量；D為樣品稀釋倍數(shù)；W為石斛干粉重量。

1.2.2 生物堿含量比較 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 濃度為10 μg/mL的石斛堿標(biāo)準(zhǔn)液于燒杯中，加入氯仿稀釋至10.0 mL，加入pH 4.5緩沖液5.0 mL和4%溴甲酚綠溶液2.0 mL，劇烈震蕩5 min，靜置30 min，使溶液分層；取下層氯仿液5.0 mL，加入0.01 mol/L NaOH-無水乙醇溶液1.0 mL，充分搖勻；以氯仿作空白對照。分別于620 nm處測吸光度（UV-2405型紫外可見分光光度計，日本島津公司），得回歸方程為：y=0.016x+0.036 2（R2=0.995 7）。

（2）樣品總生物堿含量的測定。參照金蓉鸞等[15]方法稍作改進。分別精密稱取3份大苞鞘石斛和鐵皮石斛9月—次年1月份的干燥莖粉末0.5 g，置于25 mL具塞錐形瓶中，加濃氨水適量，潤濕，密閉放置30 min；加氯仿10 mL，于60 ℃回流提取2 h，冷卻后補充氯仿至原重，抽濾得到生物堿提取液；將提取液用氯仿稀釋相應(yīng)的倍數(shù)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程，計算總生物堿的含量。

1.2.3 氨基酸含量比較 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：準(zhǔn)確稱取10 mg 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至50 mL，得到200 mg/L的游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，臨用時用空白溶劑稀釋得到1.0、 5.0、10.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品制備。取3份0.25 g樣品分別置于250 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸超聲處理30 min，過濾，再取2 mL水解處理，取水解前后的溶液各100 μL于液相色譜樣品小瓶中，以60 ℃加熱并用氮氣吹干，取出后，加入100 μL 3.5 mol/L的鹽酸正丁醇， 用鉗口鋁蓋密封樣品瓶，置于60 ℃烘箱中衍生化反應(yīng)30 min；然后開啟密封蓋，以60 ℃加熱并用氮氣吹干，往殘渣中加1 mL 80%的乙腈并振蕩1 min，溶解，并用0.45 μm 針筒式濾器過濾，于LC-MS/MS中（Agilent 1200 SL Series RRLC /6410B Triple Quard MS）測定。

色譜條件。色譜柱：BDS HYPERSIL C18（2.1 mm×150 mm，2.4 μm）；流動相：乙腈-水（0.2%的甲酸，10 mmol/L甲酸銨）梯度洗脫（梯度洗脫程序：乙腈比例變化為0min，0%；5 min，40%；7 min，80%；8～12 min，0%）；流速：0.2 mL/min，進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧（ESI），正離子電離模式；干燥氣（N2）流量：9.0 L/min；溫度：350 ℃，霧化氣（N2）壓力：275.8 kPa；電噴霧電壓：4 000 V；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。

1.2.4 微量元素含量比較 測試液制備：取3份0.50 g樣品分別置于50 mL三角瓶中，加入10 mL混合酸（9 mL硝酸+1 mL高氯酸），加蓋浸泡過夜，于電熱板上消煮，溫度不高于180 ℃，直至冒白煙、消化液呈無色透明為止；于25 mL容量瓶中用超純水定容，混勻備用，得待測試液，用石墨爐原子吸收分光光度計240ZAA（GTA120Z）測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種石斛莖段多糖與生物堿含量的比較

由圖1（A1，A2）和SPSS統(tǒng)計學(xué)分析可知，按月份比較，9月份大苞鞘石斛多糖含量最高，達41.5%；隨著時間的推移，多糖含量逐漸降低，到12月份多糖含量顯著降低，為34.1%，但到次年1月份多糖含量（37.1%）又出現(xiàn)升高趨勢。鐵皮石斛多糖含量12月份最高（38.9%），以9月份最低（20.9%），呈現(xiàn)顯著差異。至次年1月份多糖含量又開始降低。

2種石斛比較可知，除了12月份大苞鞘石斛多糖含量極顯著低于鐵皮石斛外，9～11月份和次年1月份，大苞鞘石斛多糖含量均要極顯著高于鐵皮石斛。

由圖1（B1，B2）和SPSS 統(tǒng)計學(xué)分析可知，按月份比較，9月份大苞鞘石斛生物堿含量最高，達0.088%，12月份生物堿含量降至最低，為0.032%，呈現(xiàn)顯著性差異；不同月份，生物堿含量高低未呈現(xiàn)一定的規(guī)律。鐵皮石斛11月份生物堿含量最高，達0.073%，而10月份生物堿顯著降低，為0.026%，不同月份，生物堿含量高低也未呈現(xiàn)一定的規(guī)律。

2種石斛比較可知，大苞鞘石斛 9月份和10月份生物堿含量，分別高出鐵皮石斛0.44倍和1.31倍，且具有極顯著性差異；12月份大苞鞘石斛生物堿含量要極顯著低于鐵皮石斛，其它月份，2種石斛差異不顯著。

2.2 2種石斛莖段氨基酸含量的比較

由表1可知，大苞鞘石斛和鐵皮石斛均含有所測的19種氨基酸（包括人體所必需的8種氨基酸），在必需氨基酸中，大苞鞘石斛賴氨酸（0.048%）、苯丙氨酸（0.111%）含量顯著高于鐵皮石斛；在其它氨基酸中，大苞鞘石斛精氨酸（0.068%）、氨基丁酸（0.152%）天冬氨酸和天冬酰胺（0.115%）含量顯著高于鐵皮石斛，而鐵皮石斛只有組氨酸（0.07%）含量顯著高于大苞鞘石斛，但2種石斛在總氨基酸（游離和水解氨基酸）含量方面無顯著差異。說明2種石斛在氨基酸種類上沒有差別，但在一些氨基酸含量方面有所差異。

2.3 2種石斛莖段微量元素含量的比較

從表2可知，2種石斛都含有所測的8種微量元素，與鐵皮石斛相比，大苞鞘石斛莖段所含鎂元素（4.06×103 mg/kg）、錳元素（359.33 mg/kg）、鐵（87.80 mg/kg）和硼（16.85 mg/kg）極顯著高于鐵皮石斛，而鐵皮石斛的鋅含量（34.6 mg/kg）極顯著高于大苞鞘石斛。說明2種石斛都含有所測的8種微量元素，但在一些微量元素含量方面有所差異。 此外， 2種石斛的重金屬銅的含量要遠低于藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WM/T2-2004）（20.00 mg/kg）。

3 討論與結(jié)論

3.1 2種石斛莖段多糖與生物堿含量的比較分析

多糖是鐵皮石斛的主要藥效成分，近年來關(guān)于鐵皮石斛多糖的研究越來越多，其多糖含量要高于金釵石斛，具有抗氧化、降血壓、降血糖和抗腫瘤等作用[16][3]。本研究測得鐵皮石斛多糖含量在12月份最高，這與李彩霞等[17]測定的結(jié)果相一致，說明鐵皮石斛若以多糖含量為評價標(biāo)準(zhǔn)，12月份為最佳采收季節(jié)。9～12月份大苞鞘石斛多糖含量呈現(xiàn)依次遞減的趨勢，這說明大苞鞘的最佳采收季節(jié)為9月份，這可能是因為大苞鞘石斛花期比鐵皮石斛早幾個月所致。此外，在最佳采收季節(jié)，大苞鞘石斛多糖含量要顯著高于鐵皮石斛，說明大苞鞘石斛在多糖藥理藥效開發(fā)方面具有一定的潛力。

生物堿類成分是金釵石斛的一類主要成分，但不是鐵皮石斛的主要成分，在鐵皮石斛中含量較低[18]。石斛堿具有抑制心血管和腸道疾病和抗腫瘤等作用[19]，研究結(jié)果表明大苞鞘石斛和鐵皮石斛均較金釵石斛生物堿含量低[20]。本研究中，鐵皮石斛生物堿含量較諸燕等[21]所測得的鐵皮石斛生物堿含量高；9～11月份大苞鞘總生物堿含量要明顯高于鐵皮石斛，12月份明顯低之，而1月份兩者沒有明顯差別；2種石斛的生物堿在月份的積累上沒有呈現(xiàn)一定的規(guī)律，與多糖的積累沒有呈現(xiàn)正相關(guān)或負相關(guān)。

3.2 2種石斛莖段氨基酸含量的比較分析

氨基酸是人體的生理活性所需物質(zhì)，近年來研究表明氨基酸與藥效存在著一定的關(guān)系[22]。黃民權(quán)等[23]測定了鐵皮石斛的17種氨基酸，發(fā)現(xiàn)其含有除色氨酸以外的所有人體必需的氨基酸，何鐵光等[24]測定了鐵皮石斛原球莖17種氨基酸，其中7 種是人體必需氨基酸，而本研究測定了2種石斛的19種氨基酸，除了以上所有的氨基酸外，還含有色氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、氨基丁酸。黃民權(quán)等[23]在測定氨基酸時采用的是酸水解法，色氨酸遭到破壞，所以無法被檢測出。本研究所測的鐵皮石斛必需氨基酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)較張愛蓮等[1]所測的鐵皮石斛中必需氨基酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍小，這可能與鐵皮石斛的品質(zhì)、生長環(huán)境等有關(guān)。大苞鞘石斛的苯丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺含量較高，這些氨基酸具有提高機體免疫力[25]、促進傷口復(fù)原及恢復(fù)創(chuàng)傷[26-27]、降血壓、平喘、降低藥物毒副作用等。2種石斛的氨基丁酸含量較高，但大苞鞘石斛含量更高，氨基丁酸是哺乳動物中樞的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠參與細胞間的信息傳遞，與細胞分化成熟相關(guān)，而且具有抑制癌細胞增殖[28]、降血壓、增強免疫力等功效[29]。根據(jù)以上分析推測大苞鞘石斛在維護人體機理功能方面的作用可能更突出，但2種石斛藥效氨基酸含量是否與上述活性存在一定關(guān)聯(lián)，還需要進一步實驗論證。

3.3 2種石斛莖段微量元素含量的比較分析

人體雖然對微量元素的需求量低，但其在維持人體正常生理功能和生長發(fā)育方面起著非常重要的作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)，鐵、錳、鉻、鋅、鈣、鎂、銅等元素在造血、保持人體機體免疫力、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、生長、生殖發(fā)育等方面起著重要作用，也對糖尿病、尿毒癥等疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定的影響[31-32]。本研究材料鐵皮石斛所含的8種微量元素與丁亞平等[33]研究結(jié)果一致，但各種含量指標(biāo)有所不同，其中的鎂、錳、鋅元素較諸燕等[2]所測的鐵皮石斛中相應(yīng)的微量元素含量要高。由于微量元素在維持生命活動中起著重要作用，所以，通過微量元素含量的差異比較可推斷2種石斛的功效各有側(cè)重點，鐵皮石斛鋅的含量要遠高于大苞鞘石斛，這可能說明鐵皮石斛在促進人體免疫、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育功能方面要優(yōu)于大苞鞘石斛；而大苞鞘石斛中長壽錳元素、鐵等元素的含量要顯著高于鐵皮石斛，這可能說明大苞鞘石斛在促進骨骼發(fā)育和繁殖、造血功能方面的功效要優(yōu)于鐵皮石斛。但是，2種石斛微量元素含量是否與上述活性存在一定關(guān)聯(lián)，還需要進一步實驗論證。

因此，通過與鐵皮石斛活性成分含量的比較，筆者認為，大苞鞘石斛是一種具有自身開發(fā)潛力的石斛，為得到更多有力的實驗證據(jù)，其活性成分的藥理作用及機理方面的研究正在進一步開展。

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