口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白VP1H2d限制性CTL表位預(yù)測(cè)

尚延麗　馮霞　靳野等

摘要[目的] 預(yù)測(cè)A型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的H2d限制性T細(xì)胞表位。[方法] 使用多種在線表位預(yù)測(cè)軟件，包括Syfpeithi 、IEDB、NetMHC3.2、IMTECH和BIMAS預(yù)測(cè)A型口蹄疫病毒VP1上可能有的H2d限制性T細(xì)胞表位，然后用ProtParam軟件分析預(yù)測(cè)出的候選表位。[結(jié)果] 綜合比較5個(gè)表位預(yù)測(cè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，遴選出10個(gè)候選表位；再結(jié)合ProtParam軟件分析結(jié)果，最后共預(yù)測(cè)出5個(gè)表位：其中H2Kd限制性表位有第27～35、118～126位，H2Ld 限制性表位有第43～51位，H2Dd 限制性表位有第45～53、146～154位。[結(jié)論] 預(yù)測(cè)出5條口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1 H2d限制性CTL表位，為進(jìn)一步鑒定口蹄疫病毒CTL表位提供數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞口蹄疫病毒；結(jié)構(gòu)蛋白VP1；H2d限制性T細(xì)胞表位；生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)S855.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2015）16-146-04

Prediction of H2d Restricted CTL Epitope of Structural Protein VP1 of FMDV A/GDMM/CHA/2013 Strains

SHANG Yanli， FENG Xia， JIN Ye， MA Junwu* et al （State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology， National Foodandmouth Disease Reference Laboratory， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou， Gansu 730046）

Abstract [Objective] To predict the H2d restricted T cell epitopes of structural protein VP1 in FMDV. [Method] H2d restricted T cell epitopes of structural protein VP1 in FMDV were predicted by use of five Internet website Syfpeithi， IEDB， NetMHC3.2， IMTECH and BIMAS and analyzed by ProtParam. [Result] The result showed that there are 10 candicate epitopes on the basis of the result of the five website Syfpeithi， IEDB， NetMHC3.2， IMTECH and BIMAS. Then， taking the result of ProtParam into consideration， there are 5 candicate epitopes. The H2Kd restricted T cell epitopes are in the regions of 27-35 and 118-126； the H2Ld restricted T cell epitopes is in the regions of 43-51； the H2Dd restricted T cell epitopes are in the regions of 45-53 and 146-154. [Conclusion] Five H2d restricted epitopes of structural protein VP1 in FMDV were predicted， which will be helpful for identification of CTL epitopes.

Key words FMDV； Structural protein VP1； H2d restricted T cell epitopes； Bioinformatics

口蹄疫（Footandmouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引發(fā)的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，其嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和國(guó)家的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易。在我國(guó)，口蹄疫的防制主要依賴(lài)于以強(qiáng)制免疫為主的綜合免疫措施，但目前使用的滅活疫苗[1]存在著許多缺點(diǎn)，研究、開(kāi)發(fā)安全、高效的新型疫苗[2-3]是大勢(shì)所趨，而表位肽疫苗正是其研究熱點(diǎn)之一。表位肽疫苗是指同時(shí)含有多個(gè)目標(biāo)抗原表位和相應(yīng)的輔助性表位的一種新型疫苗?？乖砦皇侵缚乖肿颖砻嫔嫌刑厥饨Y(jié)構(gòu)與免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，它代表抗原分子的一個(gè)免疫活性區(qū)，是能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞并且能夠被其識(shí)別的部位。免疫細(xì)胞不是對(duì)完整的抗原分子進(jìn)行識(shí)別，而是僅識(shí)別抗原肽上的表位。抗原表位按照與不同的抗原受體細(xì)胞結(jié)合，可分為 B細(xì)胞抗原表位與 T細(xì)胞抗原表位，而 T細(xì)胞表位可分為CTL表位和輔助性 Th 表位。

傳統(tǒng)的表位篩選方法（如合成肽庫(kù)法、步移重疊多肽法、酸洗脫法等）工作量大、試驗(yàn)成本高、試驗(yàn)周期長(zhǎng)，也可能遺漏一些細(xì)胞表位。目前，細(xì)胞表位篩選方法主要是采用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)法鑒定相結(jié)合來(lái)篩選細(xì)胞表位。計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)是在已知抗原蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上或者已知氨基酸序列的基礎(chǔ)上根據(jù)氨基酸的理化數(shù)據(jù)特質(zhì)或者肽片段與MHC 分子結(jié)合、TAP 轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、蛋白酶體裂解等抗原遞呈過(guò)程的規(guī)律，將它們編入計(jì)算機(jī)的算法中，然后用計(jì)算機(jī)軟件來(lái)預(yù)測(cè)可能含有表位的區(qū)域。筆者通過(guò)多種計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上可能的CTL T細(xì)胞表位，綜合分析各軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，篩選出最有可能T細(xì)胞表位的候選表位，旨在為鑒定口蹄疫病毒CTL細(xì)胞表位、研發(fā)表位肽疫苗提供數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1FMDV A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白 VP1 的核苷酸和氨基酸序列從GenBank中查詢(xún)到FMDV A/GDMM/2013株結(jié)構(gòu)蛋白 VP1 的序列，并與國(guó)內(nèi)外口蹄疫參考毒株進(jìn)行比較分析。

1.2CTL T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

應(yīng)用Syfpeithi 、IEDB、NetMHC3.2、IMTECH和BIMAS等多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)FMDV A/GDMM/2013株結(jié)構(gòu)蛋白 VP1上的T細(xì)胞表位（表1）。將FMDV A/GDMM/2013 VP1的氨基酸序列輸入各個(gè)網(wǎng)站，分別預(yù)測(cè)了其H2Dd、H2Kd、H2Ld限制性T細(xì)胞表位。候選表位氨基酸長(zhǎng)度參數(shù)為9 mer。選取在各預(yù)測(cè)軟件上分值在前10位，并且在其他軟件前10位重復(fù)率高的肽段做為候選表位。

表1試驗(yàn)所用的CTL表位預(yù)測(cè)軟件

預(yù)測(cè)軟件網(wǎng)址

IMTECHhttp：//www.imtech.res.in/raghava/propred1/

BIMAS http：//wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/

Syfpeithi http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm

IEDBhttp：//tools.iedb.org/mhcii/

NetMHC3.2http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC3.2/

1.3候選表位穩(wěn)定性預(yù)測(cè)使用在線分析軟件ProtParam，分析候選表位的理化性質(zhì)及其穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1VP1基因序列分析

FMDV A/GDMM/2013株結(jié)構(gòu)蛋白 VP1 基因（KF450794.1）全長(zhǎng) 636個(gè)核苷酸，編碼 212個(gè)氨基酸（圖1～2）。通過(guò)GenBank 同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白 VP1 基因與A/HuBWH/CHA/2009 VP1 protein （VP1） gene（JF792355.1） 同源性為91%，與 A/VIT/11/2004 VP1 （1D） gene（HQ116363.1）、A/TAI/7/2003 VP1 （1D） gene（HQ116312.1）、/MAY/3/2003 VP1 （1D） gene（HQ116297.1）同源性為94%。

圖1FMDV A/GDMM/CHA/2013 結(jié)構(gòu)蛋白VP1核苷酸

圖2FMDV A/GDMM/CHA/2013結(jié)構(gòu)蛋白VP1的氨基酸序列

2.2VP1蛋白CTL細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

將FMDV A/GDMM/ /CHA/2013結(jié)構(gòu)蛋白VP1蛋白序列輸入到預(yù)測(cè)軟件，選好MHC的類(lèi)型及候選表位的長(zhǎng)度。每個(gè)軟件均選取排名的前10位，然后在每個(gè)軟件、每種MHC類(lèi)型的前10中交叉比較選擇排名靠前且重復(fù)率高的10個(gè)肽段為候選CTL表位（表2～3）。

表2預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的 VP1 蛋白的 CTL表位氨基酸序列

MHC類(lèi)型編號(hào)子序列位置

H2Kd pK1TYYFSDLEI 70～78

H2Kd pK2 RYHTDVGFL 27～35

H2Kd pK3 PYTAPHRVL 118～126

H2Kd pK4 KIIAPAKQL 203～211

H2Ld pL1 KPVGPTHVI 43～51

H2Dd pD1 VGPTHVIDL 45～53

H2Dd pD2 FGAIRATEI 163～171

H2Dd pD3 SGPLAARLA 146～154

H2Dd pD4 KAPFTRLAL 109～117

H2Dd pD5 YCPRPLLAV 184～192

表3篩選出的候選表位在各個(gè)軟件中的排名

侯選表位SyfpeithiIEDBNetMHC3.2IMTECHBIMAS

pK111222

pK226112

pK352955

pK498*87

pL127666

pD1 #1211

pD2#2311

pD3#3433

pD4#5555

pD5#9677

注：*表示pK4不在NetMHC3.2預(yù)測(cè)結(jié)果的前10位；#表示Syfpeithi MHC類(lèi)型沒(méi)有H2Dd。

2.3候選表位穩(wěn)定性預(yù)測(cè)

采用在線分析軟件ProtParam，分析篩選出的10條候選表位。由表4可知，pK1、pK4、pD2、pD4 和pD5的不穩(wěn)定指數(shù)分別為44.00、68.57、42.26、51.69和43.31。這5個(gè)表位不穩(wěn)定指數(shù)較高，穩(wěn)定性差，可能不是CTL表位。

表4ProtParam分析結(jié)果

候選表位半衰期∥h不穩(wěn)定指數(shù)脂溶指數(shù)疏水性平均值

pK17.244.0086.670

pK21.0-3.5975.56-0.311

pK3>20.020.8686.67-0.344

pK41.368.57152.220.389

pL11.312.48107.780.167

pD1 100.0-0.54151.110.811

pD21.142.26108.890.700

pD31.98.89120.000.633

pD41.351.69108.890.367

pD52.843.31130.000.789

3討論與結(jié)論

CTL 細(xì)胞表面的TCR能夠識(shí)別細(xì)胞表面展示出的MHC I抗原肽（CTL細(xì)胞表位）復(fù)合物，并與之結(jié)合，然后殺傷靶細(xì)胞。CTL在抗腫瘤和抗病毒感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)內(nèi)源性抗原通過(guò)MHCⅠ類(lèi)分子展示于細(xì)胞表面后，被CD8T細(xì)胞受體識(shí)別，在共刺激因子作用下CD8T被活化、增殖產(chǎn)生細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）。CTL具有強(qiáng)大的殺傷靶細(xì)胞的能力。CTL通過(guò)殺傷介質(zhì)（Perforin、Granayme、Fasl、TRAIL、TNF、IFNγ等）來(lái)殺傷靶細(xì)胞。CTL在發(fā)揮效應(yīng)時(shí)（識(shí)別靶細(xì)胞和攻擊靶細(xì)胞）受MHCⅠ類(lèi)分子的限制，即CTL只殺傷自身MHC遞呈抗原的靶細(xì)胞。由于抗體只能直接結(jié)合體液中的抗原，不能通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)殺傷病原，因此細(xì)胞免疫對(duì)清除病毒和胞內(nèi)寄生菌十分重要，CTL通過(guò)殺傷靶細(xì)胞破壞胞內(nèi)病原賴(lài)以生存的環(huán)境，在抗體和吞噬細(xì)胞的配合下將病原徹底清除。MHCⅠ類(lèi)分子僅識(shí)別和結(jié)合內(nèi)源性抗原表位，而CTL發(fā)揮效應(yīng)時(shí)受MHCⅠ的限制，因此僅由MHCⅠ類(lèi)分子轉(zhuǎn)運(yùn)的抗原表位才能夠誘發(fā)CTL效應(yīng)，這類(lèi)抗原表位就是CTL表位。

研究表明，自然宿主抗口蹄疫病毒感染的能力與高水平的中和抗體水平有重要相關(guān)性。此外，中和抗體的產(chǎn)生離不開(kāi)Th細(xì)胞的輔助作用，因此以前對(duì)口蹄疫病毒抗原表位的研究主要是針對(duì)B細(xì)胞表位和Th細(xì)胞表位。但是，有研究表明細(xì)胞免疫在FMDV免疫應(yīng)答中也扮演著非常重要的角色[47]。因此，研究口蹄疫病毒的CTL表位具有重要意義，進(jìn)一步充實(shí)了口蹄疫病毒表位數(shù)據(jù)庫(kù)資料，也為深入了解細(xì)胞介導(dǎo)的抗口蹄疫病毒免疫鋪墊了基礎(chǔ)。

該研究的口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株是2013年從我國(guó)廣東省茂名市分離的豬源毒，由國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室保存。該毒株屬于A型ASIA拓?fù)湫裕|南亞）97毒株，其基因與A/HuBWH/CHA/2009（JF792355）同源性小于91.5%，其基因與我國(guó)歷史毒株AF/72的同源性小于81.6%，而其基因與2004年越南毒株A/VIT/11/2004大于93.7%。這表明它同我國(guó)歷史毒株AF/72無(wú)直接遺傳衍化關(guān)系，考慮到時(shí)間因素，其與2009年流行毒株A/HuB/WH/09應(yīng)該也無(wú)直接遺傳衍化關(guān)系，很可能是由境外傳入。初步推測(cè)，我國(guó)現(xiàn)有疫苗可能對(duì)該毒株保護(hù)力有限。因此，研究該毒株的細(xì)胞表位、發(fā)展相應(yīng)疫苗具有重要意義。

該研究采用多種在線表位預(yù)測(cè)軟件來(lái)預(yù)測(cè)CTL表位。其中，BIMAS[8]和SYFPEITHI正是采用矩陣方法開(kāi)發(fā)的。IEDB中，MHC I類(lèi)結(jié)合預(yù)測(cè)工具則是綜合了ANNS（人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）[9-12]、SMM（穩(wěn)定矩陣法）[13]、AMMPMBEC（肽段MHC結(jié)合能力與穩(wěn)定矩陣法）[14]、CombLib（組合庫(kù)矩陣法）[15]、Consensus（共識(shí)表位預(yù)測(cè)方法）[16]、NeMHCpan[17-18]、PickPocket（結(jié)合槽選擇法）[19]、NetMHCcons（肽段MHC結(jié)合預(yù)測(cè)綜合算法）[20]等多種肽段結(jié)合預(yù)測(cè)方法，而NetMHC3.2則是結(jié)合了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和權(quán)重矩陣2種方法。計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)在CTL抗原表位預(yù)測(cè)方面取得了很多成果。Gao 等使用SYFPEITHI 和 GENETXY 軟件預(yù)測(cè)O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1上表位，然后將預(yù)測(cè)的候選表位同重組、表達(dá)SLA2（G4S）3β2m蛋白復(fù)合體結(jié)合，分析候選表位同SLA2（G4S）3β2m蛋白復(fù)合體的結(jié)合能力，結(jié)果表明表位26–34（RRQHTDVSF）和157-165 （RTLPTSFNY）為FMDV CTL表位[21]。Barfoed 等用SYFPEITHI和BIMAS軟件預(yù)測(cè)候選表位，然后構(gòu)建了可表達(dá)2C蛋白和預(yù)測(cè)出的候選表位的質(zhì)粒的DNA疫苗來(lái)免疫小鼠，通過(guò)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法來(lái)檢測(cè)免疫后小鼠CD8+細(xì)胞IFNγ的合成，結(jié)果表明FMDV CS8c1株 2C蛋白上的第63～71 位（KYKDAKEWL）是H2Kd限制性CTL表位[22]。Liu等利用BIMAS軟件預(yù)測(cè)FMDV AF/72結(jié)構(gòu)蛋白VP1的H2d限制性T細(xì)胞候選表位，并且化學(xué)合成這些候選表位，然后用表達(dá)FMDV AF/72結(jié)構(gòu)蛋白VP1免疫小鼠，將分離的免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞與候選表位體外共培養(yǎng)，采用T細(xì)胞增殖試驗(yàn)和IFN ELISPOT試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明pK1 （AYHKGPFTRL）是H2Kd限制性T細(xì)胞表位pD7 （GFIMDRFVKI）是H2Dd限制性T細(xì)胞表位[23]。Gao等使用MetMHCpan2.0和GENETYX預(yù)軟件預(yù)測(cè)的O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的T細(xì)胞候選表位化學(xué)合成后，用脂質(zhì)體包裹來(lái)免疫小鼠，并進(jìn)行T細(xì)胞增殖試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、IFN ELISA、CTL 試驗(yàn)、豚鼠免疫保護(hù)力試驗(yàn)及組織病理學(xué)觀察，結(jié)果表明肽段VP126–34（ RRQHTDVSF）和VP157–165（RTLPTSFNY）是O型FMDV的CTL表位，并且用其免疫動(dòng)物可在一定程度上抵御口蹄疫病毒的攻擊[24]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

但是，計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)表位也有諸多局限性，比如預(yù)測(cè)蛋白構(gòu)象及表位遞呈過(guò)程等都是極其復(fù)雜的問(wèn)題，需要累積大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且理論預(yù)測(cè)和實(shí)際情況總有一定差距。這就需要將2種或者多種以上的預(yù)測(cè)方法結(jié)合起來(lái)，以提高表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率。該研究使用了5種預(yù)測(cè)軟件，結(jié)合多種算法，綜合考慮各個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，最終選出10條候選表位。

CTL表位主要是由8～11個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的線性表位。CTL表位是由內(nèi)源性抗原在胞漿加工產(chǎn)生。內(nèi)源性抗原是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和加工的蛋白，主要是細(xì)胞自身產(chǎn)生的蛋白、感染病毒或者細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的非細(xì)胞自身的蛋白和腫瘤蛋白等。蛋白酶體處理經(jīng)泛素化后的內(nèi)源性抗原，將其裂解成8～11個(gè)左右氨基酸殘基的肽段，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TAP）的作用進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的MHCⅠ類(lèi)分子上的抗原結(jié)合槽結(jié)合形成MHCⅠ抗原肽復(fù)合物。然后，通過(guò)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，同CD8+T細(xì)胞上的TCR識(shí)別與結(jié)合，從而誘發(fā)CTL效應(yīng)。因此CTL表位要有一定的穩(wěn)定性，才能保證在整個(gè)加工、結(jié)合、遞呈和識(shí)別過(guò)程的順利進(jìn)行，起到誘發(fā)細(xì)胞免疫的效應(yīng)。因此，采用ProtParam軟件對(duì)候選表位進(jìn)行穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，pK1、pK4、pD2、pD4和pD5 的不穩(wěn)定指數(shù)較高，分別為44.00、68.57、42.26、51.69和43.31。因此，這5個(gè)候選表位可能不是CTL表位。

動(dòng)物機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的、受多因素影響的、不斷變化著的環(huán)境。筆者對(duì)候選表位所進(jìn)行預(yù)測(cè)是在體外根據(jù)已知的細(xì)胞表位的各種理化數(shù)據(jù)、氨基酸殘基出現(xiàn)的頻率等多種因素來(lái)進(jìn)行分析，其穩(wěn)定性則是根據(jù)各個(gè)氨基酸殘基理化性質(zhì)來(lái)分析。因此，預(yù)測(cè)分析的候選表位可能與實(shí)際情況存在差異，還需要進(jìn)行體內(nèi)外試驗(yàn)來(lái)鑒定。

該研究借助于計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)軟件和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析軟件來(lái)預(yù)測(cè)和分析口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上可能存在的H2d限制性T表位，結(jié)果表明有5條候選表位可能是CTL 表位，包括H2Kd限制性表位2條（第2735、118126位）、 H2Ld 限制性表位1條（第4351位），以及H2Dd 限制性表位2條（第4553、146154位）。當(dāng)然，該研究預(yù)測(cè)的表位還需要體內(nèi)外試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]

DOEL T R.FMD vaccines.[J].Virus Res，2003，91（1）：81-99.

[2] BERGMANN I E，MALIRAT V，NEITZER T E，et al.Improvement of a serodiagnostic strategy for foot-and-mouth disease virus surveillance in cattle under systematic vaccination：a combined system of an indirect ELISA-3ABC with an enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay[J].Arch Virol，2000，145（3）：473-489.

[3] DE DIEGO M，BROCCHI E，MACKAY D，et al.The non-structural polyprotein 3ABC of foot-and-mouth disease virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle[J].Arch Virol，1997，142（10）：2021-2033.

[4] SANZPARRA A，JIMENEZCLAVERO M A，GARCIABRIONES M M，et al.Recombinant viruses expressing the foot-and-mouth disease virus capsid precursor polypeptide （P1） induce cellular but not humoral antiviral immunity and partial protection in pigs[J].Virology，1999，259（1）：129-134.

[5] MAYR G A，CHINSANGARAM J，GRUBAN M J.Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing the capsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate J].Virology，1999，263（2）：496-506.

[6] SANZPARRA A，VAZQUEZ B，SOBRINO F，et al.Evidence of partial protection against foot-and-mouth disease in cattle immunized with a recombinant adenovirus vector expressing the precursor polypeptide （P1） of foot-and-mouth disease virus capsid proteins[J].J Gen Virol，1999，80 （Pt3）：671-679.

[7] MORAES M P，MAYR G A，MASON P W，et al.Early protection against homologous challenge after a single dose of replicationdefective human adenovirus type 5 expressing capsid proteins of foot-and-mouth disease virus （FMDV） strain A24[J].Vaccine，2002，20（11/12）：1631-1639.

[8] BHASIN M，LATA S，RRAGHAVA G P.Searching and mapping of T-cell epitopes，MHC binders，and TAP binders[J].Methods Mol Biol，2007，409：95-112.

[9] LUNDEGAARD C，LAMBERTH K，HARNDAHL M，et al.NetMHC-3.0：accurate web accessible predictions of human，mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11[J].Nucleic Acids Res，2008，36：509-512.

[10] LUNDEGAARD C，NIELSEN M，LUND O.The validity of predicted T-cell epitopes[J].Trends Biotechnol，2006，24（12）：537-538.

[11] NIELSEN M，LUNDEGAARD C，BLICHER T，et al.Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations[J].Protein Sci，2003，12（5）：1007-1017.

[12] BUUS S，LAUEMOLLER S L，WORNING P，et al.Sensitive quantitative predictions of peptide-MHC binding by a ‘Query by Committee artificial neural network approach[J].Tissue Antigens，2003，62（5）：378-384.

[13] PETERS B，SETTE A.Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method[J].BMC Bioinformatics，2005，6： 132.

[14] KIM Y，SIDNEY J，PINILLA C，et al.Derivation of an amino acid similarity matrix for peptide：MHC binding and its application as a Bayesian prior.[J].BMC Bioinformatics，2009，10：394.

[15] SIDNEY J，ASSARSSON E，MOORE C，et al.Quantitative peptide binding motifs for 19 human and mouse MHC class I molecules derived using positional scanning combinatorial peptide libraries[J].Immunome Res，2008，4：2.

[16] MOUTAFTSI M，PETERS B，PASQUETTO V，et al.A consensus epitope prediction approach identifies the breadth of murine T（CD8+）-cell responses to vaccinia virus[J].Nat Biotechnol，2006，24（7）：817-819.

[17] HOOF I，PETERS B，SIDNEY J，et al.NetMHCpan，a method for MHC class I binding prediction beyond humans[J].Immunogenetics，2009，61（1）：1-13.

[18] NIELSEN M，LUNDEGAARD C，BLICHER T，et al.NetMHCpan，a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and-B locus protein of known sequence[J].PLoS One，2007，2（8）：796.

[19] ZHANG H，LUND O，NIELSEN M.The PickPocket method for predicting binding specificities for receptors based on receptor pocket similarities：application to MHC-peptide binding[J].Bioinformatics，2009，25（10）：1293-1299.

[20] KAROSIENE E，LUNDEGAARD C，LUND O，et al.NetMHCcons：A consensus method for the major histocompatibility complex class I predictions[J].Immunogenetics，2012，64（3）：177-186.

[21] GAO F S，F(xiàn)ANG Q M，LI Y G，et al.Reconstruction of a swine SLA-I protein complex and determination of binding nonameric peptides derived from the foot-and-mouth disease virus[J].Vet Immunol Immunopathol，2006，113（3/4）：328-338.

[22] BARFOED A M，RODRIGUEZ F，THERRIEN D，et al.DNA immunization with 2C FMDV non-structural protein reveals the presence of an immunodominant CD8+，CTL epitope for Balb/c mice[J].Antiviral Res，2006，72（3）：178-189.

[23] LIU X S，WANG Y L，ZHANG Y G，et al.Identification of H-2d restricted T cell epitope of foot-and-mouth disease virus structural protein VP1[J].Virol J，2011（8）：426.

[24] GAO F S，F(xiàn)ENG L，ZHANG Q，et al.Immunogenicity of two FMDV nonameric peptides encapsulated in liposomes in mice and the protective efficacy in guinea pigs[J].PLoS One，2013，8（7）：68658.