柞蠶性信息素合成相關(guān)基因的表達(dá)研究

侯洋　張芳　王郡等

摘要[目的]明確與性信息素合成相關(guān)基因的組織分布及其在性腺中的發(fā)育表達(dá)。[方法]利用熒光定量PCR方法，對(duì)柞蠶乙酰輔酶A羧化酶、超長鏈脂肪酸、醇脫氫酶、酯酶、脂肪酶基因在不同組織分布及性腺中的發(fā)育表達(dá)進(jìn)行分析。[結(jié)果] 乙酰輔酶A羧化酶、超長鏈脂肪酸2個(gè)基因在性腺中的表達(dá)量顯著高于其他組織；醇脫氫酶、酯酶和脂肪酶3個(gè)基因在中腸或脂肪體等組織中表達(dá)量高于性腺。乙酰輔酶A羧化酶、超長鏈脂肪酸、醇脫氫酶、脂肪酶4個(gè)基因在羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著高于羽化前2 d。酯酶基因在羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著低于于羽化前2 d。[結(jié)論]明確了柞蠶性信息素合成相關(guān)的5個(gè)基因的組織分布和發(fā)育表達(dá)，為進(jìn)一步研究這些性信息素合成相關(guān)基因的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞柞蠶；性信息素合成相關(guān)基因；表達(dá)

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）16-049-04

The Expression of the Genes Related to the Sex Pheromone Biosynthesis of Antheraea pernyi

HOU Yang， ZHANG Fang， WANG Jun， WEI Zhaojun* et al

（School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）

Abstract[Objective] The distribution and developmental expression in pheromone gland of the genes related to the pheromone biosynthesis were investigated in Antheraea pernyi. [Method] The expression of AcetylCoA carboxylase， very long chain fatty acids， Alcohol dehydrogenase， Lipase， Esterase in different tissues and stages of pheromone gland were analyzed by quantitative PCR. [Result] Two genes showed the highest expression in pheromone gland， including Acetyl CoA Carboxylase， elongation of very longchain fatty acids. The other three genes express highly in midgut or fat body， including Alcohol dehydrogenase， Lipase， Esterase gene. The mRNA of five genes changes significantly with moth eclosion. The mRNA of four genes in the pheromone gland of 2 days after eclosion are higher than those in the gland of 2 days before eclosion， including AcylCoA dehydrogenase gene， elongation of very longchain fatty acids gene， Alcohol dehydrogenase gene， Lipase gene. The Esterase gene shows higher expression level in the pheromone gland of 2 days before eclosion than those in the gland of 2 days after eclosion. [Conclusion] The tissue distribution and development expression of 5 genes related to the pheromone biosynthesis was determined， which will lay a basis for study on these related genes.

Key wordsAntheraea pernyi； Genes related to pheromone biosynthesis； Expression

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31072091；31272111）。

作者簡介

侯洋（1989-），女，遼寧沈陽人，碩士研究生，研究方向：昆蟲分子生物學(xué)。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事昆蟲分子生物學(xué)研究。

收稿日期20150414

柞蠶（Antheraea pernyi）屬于大型經(jīng)濟(jì)昆蟲，起源于我國，由于其蠶體較大、易于操作、對(duì)光照敏感，長期以來一直是研究光周期、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控等方面很好的模式昆蟲。性信息素首先在家蠶中被鑒定出來[1]，大約1 600種蛾的性信息素和引誘劑被化學(xué)鑒定出來[2]。目前已經(jīng)明確部分性信息素的生物合成路徑[3-5]。Vogel等[6]從煙芽夜蛾性腺的cDNA文庫中鑒定70個(gè)在性信息素生物合成路徑中起作用的候選基因，包括乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、去飽和酶、脂肪?；€原酶、醛還原酶、醇氧化酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、?；ッ?、脂肪酶等基因。乙酰輔酶A羧化酶屬于類型Ⅰ生物素包含酶，在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A[7]。超長鏈脂肪酸是指生物體內(nèi)碳鏈中碳原子數(shù)超過18個(gè)，在生物體中具有廣泛的生理功能，參與甘油酯、生物膜膜脂及鞘脂的合成[8]。醇脫氫酶是生物體內(nèi)重要的氧化還原催化劑之一，在生物體內(nèi)，很多醇類代謝都通過醇脫氫酶催化完成[9]。脂肪酶隸屬于羧基酯水解酶類，能夠?qū)⒏视腿ニ獬筛视秃椭舅帷Ｖ舅岽嬖谟诤兄镜膭?dòng)物、植物和微生物組織中。酯酶是水解酶，在信息素合成和消化過程中水解酯類。羧酸酯酶與多種藥物的解毒和代謝有關(guān)，并參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝[10]。

筆者在前期利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，明確了柞蠶性信息素合成相關(guān)的基因序列。筆者利用定量PCR的方法，明確柞蠶性信息素合成相關(guān)的5個(gè)基因的組織分布和發(fā)育表達(dá)。

1材料與方法

1.1材料

柞蠶由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。在冰上解剖柞蠶不同組織，包括性腺、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中腸、脂肪體和卵巢，不同發(fā)育時(shí)期的性腺分別是羽化前2 d、羽化當(dāng)天、羽化后2 d，5個(gè)個(gè)體作為一個(gè)樣品。解剖后的樣品迅速放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2柞蠶組織總RNA的提取

抽提RNA使用RNAiso Plus試劑盒，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行?？俁NA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。

1.3基因組DNA的去除

去除總RNA中的基因組DNA，使用TaKaRa的Recombinant Dnase Ⅰ試劑盒，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行。去除基因組DNA后的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。

1.4cDNA的合成

分別以柞蠶性腺、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中腸、脂肪體和卵巢以及不同時(shí)期性腺中去除基因組DNA后的RNA為模板，使用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA合成反應(yīng)體系25 μl包括：PrimeScriptTM Buffer 5 μl，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 1.25 μl，Oligo dT Primer（50 μmol/L）1.25 μl，Random 6 mers（100 μmol/L）1.25 μl，RNA 1 μg，加RNase Free ddH2O到25 μl。于37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃ 5 s使酶失活。

1.5引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)前期測(cè)定的柞蠶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，明確與性信息素合成通路相關(guān)的主要基因，設(shè)計(jì)柞蠶與性信息素合成相關(guān)基因的定量PCR引物，引物序列見表1。引物設(shè)計(jì)后交上海生物工程公司合成。

表1定量PCR引物

基因名稱引物名稱引物序列（5-3）序列長度bp

乙酰輔酶AAAceCCFCCAGGCGGCCCATAAGATTG90

羧化酶AAceCCRTCGGGACTTTCAACTTTCCTGA

延長的長鏈ALFAFGATGTCAGTGTGGTTCGGTGTT110

脂肪防酸ALFARCTGCCAGCATATAGTACGTGTA

醇脫氫酶AAlcoholDFCCGAAGATGCAGGAATCAAGCT131

AAlcoholDRTTCAGCAGCCACAGTTTCGAAT

酯酶AesteraseFGTAACGACAACTACTACGGTCCC149

AesteraseRTGCGGCTACTTGGTCTTTCAAA

脂肪酶AlipaseFACTTTGGAACCACACAACGAAA106

AlipaseRGCACTTGTGATGTGGTTGGATTA

1.6定量PCR

稀釋cDNA樣品，取10 μl樣品cDNA溶解到30 μl ddH2O中，即將樣品稀釋4倍。用熒光染料SYBR Premix Ex Taq Ⅱ配制20 μl反應(yīng)體系，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RnaseH Plus）10 μl，primer1（10 pmol）1 μl，primer2（10 pmol）1 μl，模板cDNA 1 μl，ddH2O 7 μl。在BioRAD Two Color RealTime PCR Detection System熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化。

2結(jié)果與分析

2.1柞蠶乙酰輔酶A羧化酶基因的表達(dá)

柞蠶乙酰輔酶A羧化酶（AcetylCoA carboxylase）基因在不同組織以及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)變化見圖1。由圖1a可知，乙酰輔酶A羧化酶基因的表達(dá)量在性腺中最高，與其他組織均有顯著性差異，中腸和脂肪體中的表達(dá)量均顯著高于腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢，腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢中的表達(dá)量三者之間無顯著性差異。由圖1b可知，性腺中乙酰輔酶A羧化酶基因的表達(dá)量隨著雌蛾羽化時(shí)間的增加，其表達(dá)量顯著增大，其中，羽化當(dāng)天性腺中的表達(dá)量是羽化前2 d的15倍，羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著高于羽化當(dāng)天，是其3倍。

圖1柞蠶乙酰輔酶A羧化酶基因在不同組織及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)

2.2柞蠶超長鏈脂肪酸基因的表達(dá)

柞蠶超長鏈脂肪酸（very long chain fatty acids）基因在不同組織以及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)變化見圖2。由圖2可知，超長鏈脂肪酸基因的表達(dá)量在性腺中最高，顯著高于腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中腸、脂肪體和卵巢，其中，卵巢中的表達(dá)量顯著高于中腸，是其表達(dá)量的1.6倍，而中腸中的表達(dá)量顯著高于腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脂肪體。由圖2b可知，性腺中超長鏈脂肪酸基因的表達(dá)量隨著雌蛾羽化的進(jìn)行，其表達(dá)量顯著增大，其中，羽化當(dāng)天性腺中的表達(dá)量是羽化前2 d的4倍，羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著高于羽化當(dāng)天，是其3倍。超長鏈脂肪酸基因在性腺中高表達(dá)，且隨著羽化過程含量顯著提高，可能是因?yàn)樾韵僦袦p數(shù)分裂形成大量配子，需要大量的生物膜，超長脂肪酸能夠參與合成生物膜。

圖2柞蠶超長鏈脂肪酸基因在不同組織及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)

2.3柞蠶醇脫氫酶基因的表達(dá)

柞蠶醇脫氫酶基因（Alcohol dehydrogenase）在脂肪體中表達(dá)量最高（圖3），與其他組織有顯著性差異，腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、性腺、中腸、卵巢之間無顯著性差異。性腺中醇脫氫酶基因的表達(dá)量在羽化后2 d表達(dá)量最高，顯著高于羽化前2 d和羽化當(dāng)天的表達(dá)量，其中羽化后2 d性腺中的表達(dá)量約是羽化前2 d的3倍、羽化當(dāng)天的23倍；羽化前2 d和羽化當(dāng)天的表達(dá)量之間無顯著性差異。雖然在性腺中表達(dá)量與其他組織無顯著性差異，但羽化后2 d性腺顯著高于羽化當(dāng)天，說明醇脫氫酶基因與性信息素的合成密切相關(guān)。

圖3柞蠶醇脫氫酶基因在不同組織及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)

2.4柞蠶脂肪酶基因的表達(dá)

柞蠶脂肪酶（Lipase）基因的表達(dá)量在中腸中最高，分別是腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、性腺、脂肪體、卵巢的173、138、21、69和67倍；其余5個(gè)組織之間均無顯著性差異（圖4）。性腺中脂肪酶基因的表達(dá)量隨著羽化時(shí)間的增加，表達(dá)量顯著增大，其中，羽化當(dāng)天和羽化后2 d性腺中的表達(dá)量是羽化前2 d的5倍，但羽化當(dāng)天和羽化后2 d性腺中的表達(dá)量無顯著性差異。

43卷16期

侯 洋等柞蠶性信息素合成相關(guān)基因的表達(dá)研究

2.5柞蠶酯酶基因的表達(dá)

柞蠶酯酶（Esterase）基因的表達(dá)

圖4柞蠶脂肪酶基因在不同組織及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)

量在中腸中最高，分別是腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、性腺、脂肪體、卵巢的85、9、99、6和21倍；其余5個(gè)組織之間均無顯著性差異（圖5）。中腸中的表達(dá)量較高可能與酯酶是一種水解酶有關(guān)，能夠參與柞蠶中腸中食物的消化和吸收過程。性腺中酯酶基因的表達(dá)量在羽化前2 d最高，顯著高于羽化當(dāng)天和羽化后2 d性腺中的表達(dá)量，兩者之間無顯著性差異。其中，羽化前2 d性腺中的表達(dá)量是羽化當(dāng)天表達(dá)量的80倍，是羽化后2 d表達(dá)量的3倍。

圖5柞蠶酯酶基因在不同組織及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)

3結(jié)論與討論

該研究采用熒光定量PCR法對(duì)柞蠶與性信息素合成相關(guān)基因在不同組織以及不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)量進(jìn)行分析，其中，乙酰輔酶A羧化酶、超長鏈脂肪酸2個(gè)基因在性腺中的表達(dá)量顯著高于其他組織；醇脫氫酶、酯酶和脂肪酶3個(gè)基因在中腸或脂肪體等組織中的表達(dá)量高于性腺。乙酰輔酶A羧化酶基因、超長鏈脂肪酸基因、醇脫氫酶基因、脂肪酶基因4個(gè)基因在羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著高于羽化前2 d。酯酶基因在羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著低于羽化前2 d。與性信息素合成相關(guān)的基因，需要今后對(duì)其功能進(jìn)行鑒定。下一步擬打算采取RNA干擾等方法，調(diào)查這些性信息素合成相關(guān)基因的功能。

參考文獻(xiàn)

[1] BUTENANDT A，BECKMANN R，STAMM D，et al.Uber den sexuallockstoff des seidenspinners Bombyx morireindarstellung und konstitution[J].Zeischrift Fur Naturforschung Part BChemie Biochemie Biophysik Biologie Und Verwandten Gebiete，1959，14（4）：283-284.

[2] ELSAYED A M.The Pherobase：Database of insect pheromones and semiochemicals [J/OL]. 2008http：//www.pherobase.com.

[3] JURENKA R.Insect pheromone biosynthesis[J].Chemistry of Pheromones and Other Semiochemicals I，2004，239：97-131.

[4] RAFAELI A.Mechanisms involved in the control of pheromone production in female moths：Recent developments[J].Entomologia Experimentalis Et Applicata，2005，115（1）：7-15.

[5] TILLMAN J A，SEYBOLD S J，JURENKA R A，et al.Insect pheromones—An overview of biosynthesis and endocrine regulation[J].Insect Biochemistry And Molecular Biology，1999，29（6）：481-514.

[6] VOGEL H，HEIDEL A J，HECKEL D G，et al.Transcriptome analysis of the sex pheromone gland of the noctuid moth Heliothis virescens[J].BMC Genomics，2010，11（2）：206-213.

[7] 龔瑩，彭少丹，汪騫，等.乙酰輔酶A羧化酶的結(jié)構(gòu)·功能及基因的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（35）：19893-19896.

[8] 倪郁，郭彥軍.植物超長鏈脂肪酸及角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成相關(guān)酶基因研究現(xiàn)狀[J].遺傳，2008，30（5）：561-567.

[9] 許松偉，姜忠義，吳洪.醇脫氫酶結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué)，2005，25（6）：629-633.

[10] 滕霞，孫曼霽.羧酸酯酶研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2003，15（1）：31-35.