白僵菌生產(chǎn)中發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)研究

戈媛媛 趙東容 沈偉清 張建華

摘要：為掌握白僵菌發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)，白僵菌可工業(yè)化生產(chǎn)，以宜昌夷陵區(qū)白僵菌菌種為材料，對(duì)白僵菌液體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基、菌種生長(zhǎng)形態(tài)、生長(zhǎng)環(huán)境的pH值進(jìn)行試驗(yàn)研究，從而確定轉(zhuǎn)罐時(shí)間等液體發(fā)酵罐發(fā)酵技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明：在液體發(fā)酵培養(yǎng)中，碳、氮、磷為白僵菌生長(zhǎng)必需的三要素，不同生長(zhǎng)時(shí)期三要素比例不同，初期加入少量微量元素有助于提高白僵菌孢子生長(zhǎng)速率和增加數(shù)量;在白僵菌液體發(fā)酵生長(zhǎng)史中，初始pH值為6，繼而在pH值4～5的環(huán)境中生長(zhǎng)速率最快;前42～45h在種子罐中主要產(chǎn)菌絲體，在轉(zhuǎn)罐后21～26h發(fā)酵罐中主要產(chǎn)孢子體。

關(guān)鍵詞：白僵菌;液固兩相發(fā)酵技術(shù);發(fā)酵罐;工業(yè)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S476.12文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2015）03-0029-04

TechnologyResearchofLiquidFermentationTankCultureofBeauveriabassiana

GeYuanyuan（1，2）ZhaoDongrong（1，2）ShenWeiqing（2）ZhangJianhua（1）

（1.DangyangCityForestPestControlandQuarantineStationYichang444100;

2.BeauveriaBassianaFactoryofDangyangCityForestPestControlandQuarantineStationYichang444100）

Abstract：InordertomasterthetechnologyoffermentationcultureofBeauveriabassiana，andputthecultureofexpandingBeauveriabassianaintoindustrialproduction，weusedBeauveriabassianastrainofYilingdistrict，YichangasthematerialandfermentationtechnicalparameterssuchastheappropriateliquidfermentationmediumandthegrowthmorphologyofstrainandpHvaluesofgrowthenvironmentwerestudiedbyliquidfermentationtankculturewhichcouldhelpidentifythetimeoftransferringliquidfromseedtanktofermentationtank.TheresultsshowedthatCarbon，NitrogenandPhosphoruswerethreekindsofnecessarynutrientelementsintheliquidfermentation.Besides，thesethreeessentialfactorsforthegrowthofBeauveriabassianahaddifferentproportion，theadditionofasmallamountofmicroelementintheliquidfermentationmediumattheearlystagecouldincreasegrowthrateandthenumberofBeauveriabassianaevidently;Beauveriabassianahasthecyclicgrowthhistorythatismutualtransformationbetweensaprophyteandmyceliuminitsmultistagecontinuousliquidfermentation，andthecomparativeanalysisofsporeformandthenumbersshowedthatthefastestgrowthappearedinthepHvaluebetween4and5whichthegrowthenvironmentofBeauveriabassianaownedbyselfregulationandartificialadjustment，althoughwehadgivenconditionthatthemediumwasapHof6initially;ConsideringthegrowthmorphologyandthenumberandtheactivityofBeauveriabassianaandtheworkshopoperationschedule，wemadethefollowingarrangements，andthefirstprocesswasproducingmyceliumintheseedtankfor42～45hours，andthesecondonewasproducingsaprophytewhichwasthestrainofsolidfermentationproductioninthefermentationtankfor21to26hours.

Keywords：Beauveriabassiana;solidliquidtwophasefermentationtechnology;fermentationtank;industrialization

白僵菌Beauveriabassiana是一種半知菌類(lèi)的蟲(chóng)生真菌，通過(guò)附著于蟲(chóng)體表面，產(chǎn)生脂肪酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶溶解昆蟲(chóng)的表皮，穿透昆蟲(chóng)體壁在昆蟲(chóng)體內(nèi)大量增殖，消耗寄主體內(nèi)養(yǎng)分，并不斷產(chǎn)生白僵素（大環(huán)脂類(lèi)毒素）和草酸鈣結(jié)晶[1]這些物質(zhì)，引起昆蟲(chóng)中毒，使體液機(jī)能發(fā)生變化，打亂新陳代謝以致死亡。從1890年美國(guó)的堪薩斯州將白僵菌供應(yīng)給農(nóng)戶(hù)防治麥長(zhǎng)蝽[2]，到1939年蘇聯(lián)的波斯必洛夫和謝胡里娜利用白僵菌防治森林害蟲(chóng)松尺蠖，至今，由于白僵菌高孢粉無(wú)毒、無(wú)味、無(wú)環(huán)境污染、害蟲(chóng)一經(jīng)感染可持續(xù)傳播等優(yōu)勢(shì)，白僵菌高孢粉已被作為國(guó)家林業(yè)局推廣的高效生物殺蟲(chóng)劑之一，廣泛應(yīng)用于松毛蟲(chóng)、玉米螟、蠐螬等60多種農(nóng)林害蟲(chóng)[1]。而同大多數(shù)應(yīng)用于醫(yī)療、工業(yè)中的真菌生產(chǎn)一樣，白僵菌菌種培養(yǎng)也經(jīng)歷由液體、固體培養(yǎng)基單純性發(fā)酵到液固兩相發(fā)酵的改革。液固兩相發(fā)酵法將液體深層發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種方法相結(jié)合，克服單純液體發(fā)酵生產(chǎn)的芽生孢子穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，盡可能多的避免了由生產(chǎn)周期長(zhǎng)造成的發(fā)酵中毛霉、黃曲霉等雜菌污染，以及隨氣候溫、濕度變化的影響造成“燒盤(pán)”[3]等現(xiàn)象，最大限度地利用了固體表面上產(chǎn)生氣生分生孢子的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)縮短了菌絲生長(zhǎng)周期，生產(chǎn)方法簡(jiǎn)便，原料易得，能耗成本低。因此，利用液固兩相發(fā)酵規(guī)模化、高科技、高效率生產(chǎn)意義重大，更有廣闊前景。在此筆者通過(guò)長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，并同湖北省當(dāng)陽(yáng)市森防站白僵菌廠規(guī)模生產(chǎn)實(shí)踐，于2014年成功進(jìn)行發(fā)酵罐生產(chǎn)高孢粉7t的基礎(chǔ)上，對(duì)液固兩相發(fā)酵技術(shù)中白僵菌發(fā)酵罐培養(yǎng)進(jìn)行初步研究，為白僵菌擴(kuò)大培養(yǎng)從而投入工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種的制備

將選育的優(yōu)良菌種（使用的是從宜昌夷陵區(qū)僵蟲(chóng)身上分離提純的白僵菌菌種）在超凈無(wú)菌工作臺(tái)上進(jìn)行接種。讓母種先在搖瓶或小罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到大罐中發(fā)酵，大型發(fā)酵罐的菌種要經(jīng)過(guò)兩次擴(kuò)大培養(yǎng)才能接入發(fā)酵罐[4]。

搖瓶培養(yǎng)是指在250mL三角瓶中裝入50mL液體培養(yǎng)基，121℃、0.15MPa滅菌0.5h后經(jīng)冷卻接入菌種，置于26℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至發(fā)酵罐準(zhǔn)備工作完畢即可。同時(shí)將種子罐、發(fā)酵罐在121℃、0.1MPa條件下進(jìn)行空罐、實(shí)罐滅菌[5]1h;冷卻至26℃，用微孔壓差法或打開(kāi)接種閥在火焰的保護(hù)下將搖瓶的菌種接入種子罐。

對(duì)搖瓶菌種和種子罐營(yíng)養(yǎng)液接種前、后進(jìn)行取樣鏡檢，以確保上罐的菌種和培養(yǎng)基百分百無(wú)感染，并排除因種子罐接種環(huán)節(jié)的感染等因素，否則后面的生產(chǎn)將無(wú)法繼續(xù)，所以在制備搖瓶菌種時(shí)應(yīng)多制備幾組以備用。

1.2培養(yǎng)基研究

搖瓶培養(yǎng)基、種子罐培養(yǎng)基、發(fā)酵罐培養(yǎng)基均以培養(yǎng)真菌用的液體培養(yǎng)基PDA為基礎(chǔ)，加以部分元素的改進(jìn)。搖瓶培養(yǎng)基：土豆，葡萄糖，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO47·H2O，水;種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基：黃豆水，白砂糖，KH2PO4。

1.3發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)

接種后進(jìn)行種子罐-發(fā)酵罐兩級(jí)連續(xù)發(fā)酵[1]培養(yǎng)：第一罐即種子罐，在給予罐體積的70%的培養(yǎng)液中接種量為5%，發(fā)酵溫度26±1℃，pH6.0，無(wú)菌空氣流量為常壓下8m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速為120～140r/min，第二罐發(fā)酵罐，同樣給予罐體積70%的新的培養(yǎng)液，以種子罐發(fā)酵后液體為菌液，發(fā)酵溫度26±1℃，pH5.8，無(wú)菌空氣流量為常壓下80m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速220～240r/min。根據(jù)上種子罐后不久、種子罐移種至發(fā)酵罐前，幾個(gè)重要時(shí)期及在菌種上種子罐后14，24，34，44h，種子罐移種發(fā)酵罐18，22，26h取樣顯微鏡觀察白僵菌形態(tài)和染色鏡檢、pH值檢測(cè)，判定感染與否以確保種子質(zhì)量和決策生產(chǎn)流程。

1.4數(shù)據(jù)處理

各形態(tài)孢子和代謝產(chǎn)物草酸鈣結(jié)晶以直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)總數(shù)量，部分?jǐn)?shù)據(jù)采用Excel2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄。

2結(jié)果分析

2.1發(fā)酵罐培養(yǎng)基

碳、氮、磷是白僵菌生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，而在白僵菌生長(zhǎng)的不同階段培養(yǎng)基成分又各有不同：產(chǎn)菌絲體時(shí)需要的營(yíng)養(yǎng)豐富一些，氮較產(chǎn)孢期需要的多，而產(chǎn)孢期則需要的碳多，種子罐中碳源氮源比例為2∶3，發(fā)酵罐碳源氮源比例為1∶1;培養(yǎng)初期在營(yíng)養(yǎng)液中加入少量的微量元素，比如錳和鐵[2]，有助于白僵菌孢子生長(zhǎng)速率和數(shù)量的增加。

見(jiàn)以上表1：通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，在給予相同菌種接種量、氮源、磷鹽，不同碳源的培養(yǎng)條件下，26℃水浴恒溫?fù)u床培養(yǎng)，得出以下結(jié)論：白僵菌在對(duì)碳的利用中，對(duì)雙糖中的蔗糖利用效果要優(yōu)于單糖中的葡萄糖。由分生孢子發(fā)芽成芽管進(jìn)而生長(zhǎng)成菌絲的過(guò)程中，利用蔗糖作為碳源的白僵菌要比用葡萄糖作為碳源的白僵菌生長(zhǎng)進(jìn)度快、長(zhǎng)勢(shì)好，節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間。因此在大量生產(chǎn)條件下，粗制白砂糖可作為白僵菌碳源的首選。

氮源：玉米漿或黃豆水為白僵菌發(fā)酵的主要氮源。因?yàn)槭枪I(yè)化生產(chǎn)，考慮到成本問(wèn)題，玉米和黃豆作為菌種培養(yǎng)的氮源比較有優(yōu)勢(shì)。但玉米漿制成的培養(yǎng)基液體比較渾濁，制片不利于鏡檢，所以主要還是選用黃豆熬水作為氮源。

磷鹽：為了維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)穩(wěn)定，讓微生物生長(zhǎng)速度朝著我們工業(yè)化生產(chǎn)有利的方向進(jìn)行，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑。由于白僵菌在偏弱酸的環(huán)境中生長(zhǎng)速度快，因此我們選用水溶液呈酸性的KH2PO4作為磷鹽的主要來(lái)源。

2.2培養(yǎng)時(shí)間和白僵菌形態(tài)

要想縮短周期、擴(kuò)大生產(chǎn)、獲得生理狀態(tài)良好的孢子，掌握白僵菌發(fā)酵罐培養(yǎng)的各時(shí)段形態(tài)具有重要意義。

白僵菌菌種自接入液體培養(yǎng)基后，生活史的一個(gè)循環(huán)周期：分生孢子——發(fā)芽成芽孢子——萌發(fā)成芽管，芽管分枝上斷截產(chǎn)生節(jié)孢子——萌發(fā)成菌絲——繼續(xù)生長(zhǎng)并產(chǎn)生草酸鈣結(jié)晶，部分老化斷裂增殖產(chǎn)生更多節(jié)孢子——老化的菌絲減少至無(wú)，節(jié)孢子萌發(fā)成新菌絲。

白僵菌發(fā)酵罐培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖中，可以看出：在44h的節(jié)點(diǎn)，給予菌種轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐的方式補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，可以使白僵菌繼續(xù)擴(kuò)大繁殖，生長(zhǎng)曲線(xiàn)也直接由穩(wěn)定期跨過(guò)衰亡期進(jìn)入下一個(gè)生長(zhǎng)循環(huán)期，大大減短了培養(yǎng)時(shí)間，擴(kuò)大了菌種繁殖;在66h后，發(fā)酵罐中菌種受代謝產(chǎn)物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏等限制，菌種增量不明顯甚至下滑趨勢(shì)，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間已沒(méi)有太大意義，因此可停止發(fā)酵罐培養(yǎng)。

2.3酸堿度-時(shí)間曲線(xiàn)

每次投罐發(fā)酵培養(yǎng)中，初始給予菌種相同pH值的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。從表4可以看出：白僵菌生長(zhǎng)的適應(yīng)環(huán)境為pH值4～6;總體以白僵菌發(fā)酵培養(yǎng)44h為界點(diǎn)，0～44hpH值由6減至4，為產(chǎn)生第一代新菌絲階段，63h后pH值呈現(xiàn)由4增值的趨勢(shì)，是菌絲逐漸老化代謝產(chǎn)生結(jié)晶和節(jié)孢子演變生成第二代菌絲，以節(jié)孢子為主的過(guò)程，此后就是菌絲與節(jié)孢子之間的循環(huán)演變，白僵菌的擴(kuò)大繁殖。在此，人為的將白僵菌液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分配成種子罐42～45h，發(fā)酵罐21～26h。

3結(jié)論與討論

在生物學(xué)界和農(nóng)林業(yè)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)專(zhuān)家們長(zhǎng)時(shí)間努力，在白僵菌育種方面已取得巨大成就，但同許多其它現(xiàn)代生物技術(shù)類(lèi)似，白僵菌擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的成果在全國(guó)大部分地區(qū)未能產(chǎn)業(yè)化，瓶頸是發(fā)酵罐中穩(wěn)定的控制和順利的后處理不能通過(guò)的問(wèn)題。因此白僵菌工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)仍是良莠不齊，從實(shí)驗(yàn)室菌種選育到車(chē)間發(fā)酵罐大量生產(chǎn)，如何掌握好液體發(fā)酵罐培養(yǎng)中白僵菌多型孢子和菌絲各生長(zhǎng)形態(tài)所適應(yīng)的環(huán)境和所需要的營(yíng)養(yǎng)元素，保障白僵菌菌種發(fā)酵按預(yù)定的最佳動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行，才是做到從量變到質(zhì)變的生產(chǎn)工藝之關(guān)鍵。

筆者通過(guò)以宜昌夷陵區(qū)白僵菌菌種為材料，對(duì)白僵菌液體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基、菌種生長(zhǎng)形態(tài)、生長(zhǎng)環(huán)境的pH值進(jìn)行試驗(yàn)研究，在當(dāng)陽(yáng)白僵菌廠成功投入工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，確定了轉(zhuǎn)罐時(shí)間等液體發(fā)酵罐發(fā)酵技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明：在液體培養(yǎng)基中，碳氮元素比例為種子罐2∶3，發(fā)酵罐1∶1;種子罐初始pH值為6，進(jìn)入發(fā)酵罐生產(chǎn)，pH值在白僵菌自我調(diào)節(jié)與外界調(diào)節(jié)共同作用下維持4～5，孢子增長(zhǎng)速率最大;積極掌握白僵菌液體發(fā)酵中節(jié)孢子與菌絲生長(zhǎng)時(shí)間，從而合理分配種子罐-發(fā)酵罐兩級(jí)連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，前42～45h在種子罐中培養(yǎng)，后21～26h在發(fā)酵罐中補(bǔ)充新料繼續(xù)培養(yǎng)。以最大程度節(jié)約生產(chǎn)成本，進(jìn)行成功生產(chǎn)。另外對(duì)比固體發(fā)酵法生產(chǎn)和液固兩相發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)，雖然后者因?yàn)榭諌簷C(jī)、發(fā)酵罐運(yùn)行耗電較前者多，但綜合考慮，無(wú)論是從生產(chǎn)成本還是產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)量上考量都要較前者優(yōu)秀，因此液固發(fā)酵法生產(chǎn)擁有廣闊前景。

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（責(zé)任編輯：鄭京津）