葡萄糖氧化酶在水溶性CdTe量子點(diǎn)上的直接電化學(xué)研究

余 祎，喻玖宏

(武漢輕工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

葡萄糖氧化酶在水溶性CdTe量子點(diǎn)上的直接電化學(xué)研究

余 祎，喻玖宏*

(武漢輕工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

利用合成的CdTe量子點(diǎn)(QDs)作修飾材料，將葡萄糖氧化酶(GOD)固定在水溶性CdTe量子點(diǎn)表面，制備了葡萄糖氧化酶CdTe量子點(diǎn)修飾碳糊電極(GOD/CdTe/CPE)，實(shí)現(xiàn)了GOD在電極表面的直接電化學(xué)。CdTe QDs能有效地加速葡萄糖氧化酶(GOD)與電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移，電子傳遞效率比無(wú)QDs CdTe存在時(shí)提高約8倍；電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)(K)為0.14 s-1，傳遞系數(shù)(α)為0.60，GOD在GOD/CdTe/CPE表面的平均覆蓋量(Γ)為7.9×10-8mol/cm2。GOD/CdTe/CPE電極作為第三代葡萄糖電化學(xué)生物傳感器，成功應(yīng)用于葡萄糖濃度的檢測(cè)，其線性范圍為0.050～0.32 mmol/L，檢出限為0.020 mmol/L。GOD/CdTe/CPE的制備方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性強(qiáng)，具有優(yōu)良的選擇性和重現(xiàn)性，且響應(yīng)速度快。

CdTe量子點(diǎn)；葡萄糖氧化酶；電化學(xué)生物傳感器；循環(huán)伏安；直接電化學(xué)

近年來(lái)，在生物電化學(xué)領(lǐng)域，對(duì)蛋白質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)研究引起了廣泛的興趣和重視[1-2]。蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)研究，對(duì)于理解和認(rèn)識(shí)其在生命體內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制和生理作用具有重要意義。對(duì)電極表面進(jìn)行化學(xué)修飾，可以改善電極與蛋白質(zhì)分子電活性中心之間的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子在電極表面的直接電子傳遞。

葡萄糖氧化酶(β-D-吡喃型葡萄糖脫氫酶，GOD)是食品工業(yè)和醫(yī)療診斷中常用的一種酶，同時(shí)在傳感器的研制方面也有許多相關(guān)報(bào)道[3-4]。高先娟等[5]采用殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合膜固定葡萄糖氧化酶構(gòu)建電流型葡萄糖生物傳感器，發(fā)現(xiàn)殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合膜可以輔助電子傳遞，有效提高電極的電流響應(yīng)。黃小梅等[6]制備了核-殼結(jié)構(gòu)的TiO2@Pt復(fù)合納米顆粒，并成功修飾于恒電位沉積的普魯士藍(lán)-殼聚糖(PB-CS)雜化膜表面，得到的傳感器對(duì)葡萄糖有良好的催化作用。量子點(diǎn)是一種特殊的納米微粒，因其獨(dú)特的物化性質(zhì)而得到廣泛應(yīng)用。自Alivisatos小組和Nie小組[7-8]初步解決量子點(diǎn)(QDs)的水溶性以及生物相容性問(wèn)題后，量子點(diǎn)在DNA及蛋白質(zhì)標(biāo)記、活體細(xì)胞染色和生物芯片等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[9-10]。將量子點(diǎn)應(yīng)用于氧化還原蛋白直接電化學(xué)的研究也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一[8]。Wang等[11]將CdTe量子點(diǎn)(QD CdTe)固定在血清蛋白修飾玻碳電極上，結(jié)果顯示QD CdTe能夠促進(jìn)電極與血清蛋白之間的直接電子傳遞。Lu等[12]將血紅蛋白(Hb)滴涂在用水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)復(fù)合物薄膜修飾的玻碳電極表面，量子點(diǎn)膜上的Hb不僅能很好地保持其生物活性，而且在CdSe/ZnS的作用下，Hb能夠在電極表面發(fā)生直接電子傳遞。

本文將GOD固定在水溶性CdTe量子點(diǎn)表面，制成碳糊修飾電極，基于納米CdTe量子點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的高固載率、高催化活性，研究了GOD在電極表面的直接電化學(xué)行為。并在此基礎(chǔ)上，制備了一種CdTe量子點(diǎn)納米復(fù)合物葡萄糖電化學(xué)生物傳感器，進(jìn)行葡萄糖的電化學(xué)測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

葡萄糖氧化酶(GOD，5 500 U/g，Amresco公司)；石墨粉(光譜純)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)由0.20 mol/L NaH2PO4和0.20 mol/L Na2HPO4按一定比例混合而成，并用NaOH或H3PO4調(diào)節(jié)至所需的pH值；其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為三重石英蒸餾水。

CHI 600C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，修飾電極為工作電極，鉑絲作對(duì)電極，Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極作參比電極。除特別說(shuō)明外，所有測(cè)試底液均為室溫下0.20 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。

紅外光譜為水平衰減全反射紅外光譜，將GOD溶液和GOD/CdTe混和溶液滴涂到載玻片上，自然晾干分別制成GOD膜和GOD/CdTe膜，用干凈的載玻片作為空白，用Vertex 70傅立葉變換紅外光譜儀(Bruker，德國(guó))檢測(cè)水平衰減全反射紅外光譜。將GOD溶液和GOD/CdTe混合溶液分裝在樣品管中，并使用Shimadzu UV-2500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Tokyo,Japan)分別檢測(cè)其紫外-可見(jiàn)吸收光譜。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 CdTe量子點(diǎn)的制備 參考文獻(xiàn)[13-14]，將0.47 g Te粉和0.50 g NaHB4加入密閉反應(yīng)器中，通N210 min排除其中的空氣，于40 ℃水浴中攪拌條件下緩慢滴加乙醇水溶液，于N2氣氛下反應(yīng)至Te粉完全消失。反應(yīng)結(jié)束后，冰水浴10 min，將8.0 mL 0.50 mol/L H2SO4快速注入上述反應(yīng)液中，通N2將反應(yīng)器中產(chǎn)生的H2Te氣體導(dǎo)入另一反應(yīng)器，用0.050 mol/L NaOH溶液吸收H2Te，即制得澄清NaHTe溶液；調(diào)節(jié)含有巰基乙酸(TGA)的CdCl2溶液(Cd-SR)至pH 11.2，在N2保護(hù)下劇烈攪拌，并加入新制的NaHTe溶液，摩爾比n(Cd2+)∶n(Te)∶n(TGA)= 1∶0.5∶2.4，攪拌反應(yīng)20 min，濃度以HTe-計(jì)為276 mmol/L。將體系加熱至100 ℃并回流4 h，得水溶性CdTe量子點(diǎn)。待體系冷卻后，于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 空白碳糊電極的制備 將石墨粉在700 ℃下灼燒4 min，備用。將5.0 μL液體石蠟加入20 mg石墨粉中，充分研磨混合均勻，所得碳糊填入內(nèi)徑2 mm的塑料管一端并拋光成鏡面，另一端用銅線引出，即制成空白碳糊電極(CPE)，于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 GOD/CdTe/CPE的制備 將GOD溶于水中配成0.050 mg/μL的儲(chǔ)備液備用，用微量移液器取120 μL GOD儲(chǔ)備液，與300 μL QDs CdTe溶液混合，得到GOD/CdTe混合溶液，向其中加入20 mg石墨粉，并超聲使其分散均勻，待水分完全蒸發(fā)后加入5.0 μL液體石蠟，經(jīng)碾磨混合均勻，得內(nèi)含GOD和QDs CdTe的修飾碳糊；將修飾碳糊填入內(nèi)徑為2 mm的塑料管中，按照制備CPE的方法，制成GOD/CdTe/CPE，于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 GOD/CPE與CdTe/CPE的制備 參照GOD/CdTe/CPE的制備方法，制備GOD修飾碳糊電極(GOD/CPE)、QDs CdTe修飾碳糊電極(CdTe/CPE)，但在制備過(guò)程中不加QDs CdTe或GOD，于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 電化學(xué)檢測(cè) 以上述制備的電極作為工作電極，鉑絲作對(duì)電極，Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極作參比電極，在0.20 mol/L pH 7.0 PBS中，于-0.90～-0.20 V電位區(qū)間掃描獲得CV圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 GOD在QDs CdTe上的直接電化學(xué)

圖1中a～d分別為CPE，CdTe/CPE，GOD/CPE，GOD/CdTe/CPE在0.20 mol/L PBS中的CV曲線。從圖中可看出，CPE和CdTe/CPE的CV圖(曲線a，b)上未出現(xiàn)氧化還原峰，只反映出很低的背景電流，說(shuō)明在此電位范圍內(nèi)，空白碳糊(CP)和QDs CdTe均不存在電化學(xué)活性，而GOD/CdTe/CPE(曲線d)CV曲線分別在-0.42 V和-0.60 V呈現(xiàn)1對(duì)氧化還原峰。由此證明，GOD/CdTe/CPE的CV曲線上的氧化還原峰是由GOD在電極上的直接電化學(xué)過(guò)程所產(chǎn)生，反應(yīng)如下：

GOD(FAD) +2e+2H+? GOD(FADH2)

根據(jù)兩峰電位可以得到葡萄糖氧化酶的式量電位：

E0’=(Epa+Epc)/2 =-0.51 V

圖1 不同電極在0.20 mol/L pH 7.0 PBS中的CV圖

圖2 GOD/CdTe/CPE在0.20 mol/L pH 7.0 PBS 中不同掃速下的CV圖

氧化峰和還原峰電位之差ΔEp=180 mV，兩峰電流的比值接近于1，表明GOD在CdTe/CPE上的直接電化學(xué)行為是一個(gè)準(zhǔn)可逆過(guò)程。

碳糊電極中不存在CdTe量子點(diǎn)時(shí)，GOD/CPE也有1對(duì)氧化還原峰(曲線c)，但相比較而言，其峰電流的大小不及GOD/CdTe/CPE循環(huán)伏安峰的1/8，這充分表明，由于CdTe量子點(diǎn)存在，GOD與電極之間的直接電子傳遞被顯著加速，進(jìn)一步說(shuō)明CdTe量子點(diǎn)對(duì)GOD的直接電化學(xué)過(guò)程具有良好的催化作用；同時(shí)CdTe量子點(diǎn)具有大的比表面積，可以提高GOD的固載量且有助于GOD分子獲得更好的空間取向以利于與電極表面進(jìn)行直接電子傳遞。

2.2 GOD/CdTe/CPE的循環(huán)伏安特性

GOD/CdTe/CPE在0.20 mol/L pH 7.0的PBS中以不同掃描速率(v)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(見(jiàn)圖2)，結(jié)果表明，隨著v的增加，峰電流逐漸增大，氧化、還原峰電位分別向正電位和負(fù)電位方向移動(dòng)，且峰電位差ΔEp也隨之增大，其式電位為-0.44 V，接近于25 ℃下pH 7.0 PBS溶液中GOD的式電位-0.46 V[15]，表明經(jīng)CdTe修飾后大部分GOD分子保持其原有的結(jié)構(gòu)。當(dāng)v在0.02 ～ 0.10 V/s范圍內(nèi)時(shí)，峰電流與v呈良好的線性關(guān)系(圖2插圖A)，相關(guān)系數(shù)(r)為0.991 1，因此該電化學(xué)反應(yīng)是一表面控制過(guò)程或者薄膜電化學(xué)行為，GOD的表面覆蓋量(Γ)和電子傳遞數(shù)(n)的關(guān)系可用Lavrion’s方程[16]表示：Ip=n2F2vAΓ/(4RT)=nFQv/(4RT)，式中Q為電化學(xué)反應(yīng)的電量；A為電極面積；

Ip為氧化還原峰電流，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，R為理想氣體常數(shù)，T為溫度。

由圖2(插圖A)可算出Q為1.0×10-4C，根據(jù)其斜率8.6×10-4A·V-1.s，可得n為1.9，說(shuō)明電極表面進(jìn)行的是雙電子反應(yīng)。因此可求得GOD在電極表面的平均覆蓋量(Γ)為7.9×10-8mol/cm2，說(shuō)明CdTe量子點(diǎn)對(duì)葡萄糖氧化酶的固定化有較好的效果。當(dāng)v從0.15 V/s變化到0.50 V/s時(shí)，峰電流與v1/2呈良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)(r)為0.986 3，說(shuō)明在此掃速范圍內(nèi)，該電化學(xué)反應(yīng)為一擴(kuò)散控制過(guò)程。當(dāng)掃描速率低于0.10 V/s時(shí)，峰電位與lgv呈一定線性關(guān)系(圖2插圖B)，對(duì)于氧化還原單分子膜修飾的電極[17]，峰電位存在如下關(guān)系：

可算出電子傳遞系數(shù)α=0.6，由以上公式可得：

進(jìn)一步根據(jù)E～lgv的斜率可計(jì)算出電子傳遞速率常數(shù)(K)為0.14 s-1，說(shuō)明葡萄糖氧化酶在電極表面上的電子傳遞速度較快，也進(jìn)一步證明該電化學(xué)反應(yīng)為一擴(kuò)散控制過(guò)程。

圖3 GOD溶液(a)和GOD/CdTe復(fù)合 物溶液(b)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

圖4 GOD(a)和GOD/CdTe復(fù)合物(b)的紅外光譜

2.3 修飾膜的光譜表征

GOD溶液和GOD/CdTe復(fù)合物溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜如圖3所示。GOD/CdTe復(fù)合物溶液的吸收帶(曲線b)位于450 nm，與GOD溶液的吸收帶(曲線a)十分相似，吸收帶輪廓基本保持不變。說(shuō)明GOD/CdTe復(fù)合物中的GOD結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，能保持GOD自身的性質(zhì)。

粉末狀GOD和GOD/CdTe復(fù)合物的紅外吸收光譜如圖4所示。GOD的FTIR光譜中吸收帶位置分別在1 576 cm-1和1 398 cm-1(曲線a)，GOD/CdTe復(fù)合物的特征吸收帶分別出現(xiàn)在1 577 cm-1和1 401 cm-1(曲線b)，兩FTIR光譜圖的輪廓基本相同，這表明復(fù)合物GOD并未發(fā)生變性。

2.4 GOD/CdTe/CPE對(duì)葡萄糖的響應(yīng)

2.4.1 GOD/CdTe/CPE對(duì)葡萄糖的CV響應(yīng) 應(yīng)用GOD/CdTe/CPE中GOD與電極之間的直接電子傳遞，通過(guò)檢測(cè)葡萄糖在GOD/CdTe/CPE上還原電流的變化可達(dá)到檢測(cè)葡萄糖的目的。圖5是GOD/CdTe/CPE在0.20 mol/L空氣飽和的PBS(pH 7.0)中，對(duì)不同濃度葡萄糖的CV響應(yīng)圖。圖5(曲線c～h)結(jié)果顯示，隨著葡萄糖的濃度增大，還原峰電流依次減小，氧化峰電流幾乎不變。響應(yīng)機(jī)理如下[18-19]：

GOD(FAD)+2e+2H+? GOD(FADH2)

GOD(FADH2)+O2→ GOD(FAD)+H2O2

Glucose+GOD(FAD) → Gluconolactone+GOD(FADH2)

圖5中曲線a，b分別為GOD/CdTe/CPE在空氣飽和與通N220 min除氧狀態(tài)下PBS中的CV曲線。對(duì)比兩曲線可見(jiàn)，除氧后還原峰電流明顯減小。

2.4.2 GOD/CdTe/CPE對(duì)葡萄糖的安培響應(yīng) 圖6為0.20 mol/L PBS(pH 7.0)中葡萄糖在GOD/CdTe/CPE上的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線。圖中曲線a為未添加葡萄糖時(shí)的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線，隨著葡萄糖濃度的增加，還原電流逐漸減小(圖6 b～d)。催化電流與葡萄糖濃度在0.050～0.32 mmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.995 0(見(jiàn)插圖)，按3倍信噪比計(jì)算得其檢出限為0.020 mmol/L。圖中還可明顯觀察到，3 s時(shí)計(jì)時(shí)電流的響應(yīng)曲線已基本趨于平行，3 s后還原電流幾乎不變，表明此GOD修飾的CdTe量子點(diǎn)碳糊電極生物傳感器響應(yīng)速度快。

圖5 不同葡萄糖濃度時(shí)GOD/CdTe/CPE在0.20 mol/L pH 7.0 PBS中的CV圖

圖6 不同葡萄糖濃度時(shí)GOD/CdTe/CPE在0.20 mol/L pH 7.0 PBS中的安培曲線

2.5 GOD/CdTe/CPE的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

在含0.16 mmol/L葡萄糖的測(cè)試溶液中，用同一支GOD/CdTe/CPE連續(xù)測(cè)量10次后發(fā)現(xiàn)，10次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%，表明電極對(duì)葡萄糖具有很好的響應(yīng)重復(fù)性。在該測(cè)試溶液中，用同一批次制備的5支不同GOD/CdTe/CPE進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5支修飾電極對(duì)同一濃度葡萄糖的電流響應(yīng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%，說(shuō)明這種采用碳糊復(fù)合物修飾的電極具有很好的重現(xiàn)性。

進(jìn)一步將GOD/CdTe/CPE在4 ℃條件下放置1周后，檢測(cè)其對(duì)葡萄糖的響應(yīng)電流。結(jié)果表明，葡萄糖濃度為0.32 mmol/L時(shí)，1周后GOD/CdTe/CPE的響應(yīng)電流仍保持在90%以上，表明GOD/CdTe/CPE有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

CdTe量子點(diǎn)具備良好的電催化活性，為研究蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)提供了一類(lèi)新的材料，它能有效地加速GOD與電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移，電子傳遞效率比無(wú)CdTe量子點(diǎn)存在時(shí)提高約8倍。電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)(K)為0.14 s-1，傳遞系數(shù)(α)為0.60，GOD在GOD/CdTe/CPE表面的平均覆蓋量(Γ)為7.9×10-8mol/cm2。以GOD在CdTe量子點(diǎn)上的直接電化學(xué)過(guò)程為基礎(chǔ)，制作了一種GOD/CdTe納米復(fù)合物碳糊修飾電極，并成功用于葡萄糖濃度的檢測(cè)，其線性范圍為0.050～0.32 mmol/L，檢出限為0.020 mmol/L。GOD/CdTe/CPE的制備方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性強(qiáng)，具備優(yōu)良的選擇性和重現(xiàn)性，且響應(yīng)速度快。這種修飾電極的制備也為第三代電化學(xué)生物傳感器的研制提供了一種新方法。

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Direct Electrochemistry of Glucose Oxidase at Water-soluble CdTe Quantum Dots

YU Yi,YU Jiu-hong*

(Chemical and Environmental Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

In this paper,a glucose oxidase CdTe quantum dots modified carbon paste electrode(GOD/CdTe/CPE)was prepared by the synthesis of CdTe quantum dots(QDs) to fabricate modified material and fixed the glucose oxidase(GOD) at the surface of the water-soluble CdTe quantum dots,and achieved the direct electrochemistry of GOD at the electrode surface.QDs CdTe can effectively accelerate the direct electron transfer of GOD with the electrode surface,and the electron transfer efficiency was about 8 times more than that in the absence of QDs CdTe.The electron transfer rate constantKwas 0.14 s-1and transfer coefficient was 0.60.The average amount of coverage(Γ) of GOD on the surface of GOD/CdTe/CPE was 7.9×10-8mol/cm2.As a third generation glucose biosensor,GOD/CdTe/CPE was successfully applied in the detection of glucose concentration.The calibration curve was linear in the range of 0.050-0.32 mmol/L and the detection limit was 0.020 mmol/L.GOD/CdTe/CPE had the advantages of simple preparation,strong stability,excellent selectivity and reproducibility,and fast response.

CdTe quantum dots(QDs); glucose oxidase; electrochemical biosensor； cyclic voltammetry(CV)；direct electrochemistry

2014-09-02；

2014-09-25

生命分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(KLACLS1005)

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.012

O657.72；F767.4

A

1004-4957(2015)02-0194-06

*通訊作者：喻玖宏，博士，副教授，研究方向：電分析化學(xué)，Tel：13098877692，E-mail：yjh@whpu.edu.cn