碳點-熒光桃紅熒光共振能量轉移體系在銅離子檢測中的應用研究

陶慧林，孫 超，廖秀芬，徐銘澤，王海洋，易忠勝，覃宏偉

(桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004)

碳點-熒光桃紅熒光共振能量轉移體系在銅離子檢測中的應用研究

陶慧林*，孫 超，廖秀芬，徐銘澤，王海洋，易忠勝，覃宏偉

(桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004)

在pH 8.4的溶液中，碳量子點(Carbon quantum dots，CQDs) 和熒光桃紅(Fluorescent pink，F(xiàn)P)之間發(fā)生熒光共振而使后者的熒光增強。體系中加入痕量Cu2+后，F(xiàn)P的熒光被猝滅，且在一定范圍內體系的熒光猝滅程度與Cu2+濃度呈良好的線性關系。據(jù)此建立了熒光猝滅法測定河水、農田水、自來水中痕量Cu2+的新方法。方法的線性范圍為9.42～23.55 μmol/L，檢出限(3σ/k)為3.14 μmol/L。將該方法應用于河水、農田水及自來水中Cu2+的檢測，其相對標準偏差(RSD) 不大于0.91%，加標回收率為98.7%～99.0%，結果令人滿意。

碳量子點；熒光桃紅；熒光共振能量轉移；痕量Cu2+

銅是一種重要的工業(yè)原料，因具有優(yōu)良的機械性能、良好的可塑性等被廣泛用于冶金、地質、環(huán)境、化工、材料科學等領域。銅也是人體必需的微量元素之一，廣泛參與多種酶的代謝活動，且是30多種酶的活性成分，是人體必需的微量元素之一，具有造血、影響鐵代謝、強壯骨骼、軟化血管、增強防御機能等功能。銅在人體內(尤其是心臟中)主要以含銅蛋白酶和血漿細胞素形式存在，影響造血過程，促進鐵的吸收和利用，加速細胞成熟。人體缺銅將引起心臟增大，血管變弱，主動脈彈性組織變性，導致動脈病變，引起膽固醇增高，導致冠心病發(fā)生等。因此，建立高靈敏度測定微量或痕量Cu2+的方法具有重要意義。目前對于Cu2+的測定主要有火焰原子吸收光譜法[1]、催化動力學法[2]、電化學法[3-5]、流動注射分析法[6]、聯(lián)用技術[7-9]、熒光分析法[10-13]等。如王尚芝等[1]使用火焰原子吸收光譜法測定小米中銅的含量，先使用濁點萃取進行一步預處理后檢測，該方法的檢出限為1.1 ng/mL，但需要復雜的預處理。朱慶仁等[2]使用催化動力學法檢測面粉和大米中的痕量銅，該方法的檢出限為8.0×10-12g/mL，然而檢測時間超過1 d，無法進行快速檢測。代仕均等[6]應用流動注射分析法成功地檢測了幾種地表水中的痕量銅，方法的檢出限良好，然而線性范圍窄。

熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET) 技術由于靈敏度高、方法簡單，在分析檢測方面得到了廣泛應用[14]。碳量子點(CQDs)是一種新型的納米材料，具有發(fā)光性質穩(wěn)定、熒光壽命長等特點，且與其他的熒光材料相比具有更好的生物安全性，是一種優(yōu)良的光學材料，在分析檢測中具有良好的應用前景。目前已廣泛應用于無機離子、生物和藥物分析等領域[15-16]。而將具有優(yōu)良光學性質的CQDs應用于FRET體系中鮮有報道。本實驗以CQDs作為能量給體，熒光桃紅(FP)作為能量受體，構建新型的能量轉移體系，Cu2+能夠使體系中FP的熒光發(fā)生猝滅，在最佳實驗條件下，F(xiàn)P的熒光猝滅值與Cu2+的加入量在一定范圍內呈良好的線性關系，從而建立了測定痕量Cu2+的新方法。所建立的方法具有靈敏度高、儀器簡便、操作簡單等特點，能較好地克服現(xiàn)有方法中存在的一些缺陷。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度計(日本島津公司)，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，電子分析天平FA1104(中國江蘇泰興市電子儀器廠)，pHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)；熒光桃紅(國際集團試劑有限公司)：直接用二次水配成1.0×10-4mol/L熒光桃紅儲備液，2 mg/mL Cu2+標準貯備液(南京效率科技有限公司)，pH 8.4的水溶液(用NaOH調節(jié)pH值)，以上所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 碳量子點的合成

水溶性碳量子點的制備：根據(jù)文獻[17]的方法稍作修改，將0.2 g檸檬酸鈉、1.5 g碳酸氫銨和10 mL水加入聚四氟乙烯襯里的高溫反應釜中，密封后置于180 ℃烘箱中水熱處理4 h，自然冷卻至室溫后，轉移到50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，置于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 實驗方法

在一系列10 mL比色管中依次加入一定量的CQDs，F(xiàn)P和Cu2+，用pH 8.4的水溶液定容至刻度，并于30 ℃恒溫反應6 min后，在λex=300 nm處測定相應的熒光強度IF。儀器的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

2 結果與討論

2.1 CQDs的光學性質

用透射電鏡分析了CQDs的分布情況，由圖1A的透射電鏡圖可知，CQDs粒徑分布較均勻，多分布在2.0～3.0 nm 之間。CQDs的紫外吸收光譜和熒光光譜見圖1B，由圖1B可知其最大吸收峰在352 nm，熒光發(fā)射峰為432 nm。CQDs的量子產(chǎn)率可采用參比法計算獲得：Φu=(Φs×Fu×As)/(Fs×Au)。其中Φu，Φs為待測物質和參比物質的熒光量子產(chǎn)率；Fu，F(xiàn)s為待測物質和參比物質的積分熒光強度；Au，As為待測物質和參比物質在該激發(fā)波長的入射光的吸光度(A=εbc)。參照文獻[18]，以0.05 mol/L H2SO4介質中的硫酸奎寧(熒光量子產(chǎn)率0.55)為參比，測得CQDs的量子產(chǎn)率為0.67。以上結果表明本實驗所獲得的CQDs具有粒徑小、分布均勻、量子產(chǎn)率較高、峰形窄(半峰寬為76 nm)且對稱等特點。

2.2 碳量子點-熒光桃紅熒光共振能量轉移體系的構建

給體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有一定程度上的重疊是分子間發(fā)生能量轉移的必要條件之一。CQDs的熒光光譜和FP的吸收光譜見圖2。由圖2可知CQDs的熒光峰在432 nm處(曲線a)，F(xiàn)P的紫外吸收峰在535 nm處(曲線b)，二者間有較好的光譜重疊，這為發(fā)生能量轉移提供了前提條件。其中CQDs為能量給體，F(xiàn)P為能量受體。

圖1 CQDs的透射電鏡(A)及吸收光譜和熒光光譜(B)

圖2 CQDs的熒光光譜(a)及 FP的吸收光譜(b)

圖3 CQDs(a)，F(xiàn)P(b)和CQDs-FP (c)的熒光發(fā)射光譜

圖4 CQDs濃度對CQDs-FP間能量轉移的影響

圖5 FP濃度對CQDs-FP間能量間轉移的影響

為了確保能量轉移的效果，選用CQDs吸收較弱的端部波長300 nm來激發(fā)混合體系，既可以保證FP有較大的吸收，同時CQDs又不會被激發(fā)。如圖3所示，給體和受體混合后，給體CQDs發(fā)生明顯的熒光猝滅，F(xiàn)P的熒光增強，證明CQDs-FP之間發(fā)生了熒光共振能量轉移現(xiàn)象，CQDs-FP體系的熒光能量轉移效率與二者的濃度有著密切聯(lián)系。為找出給、受體間的最佳配比，實驗探究了CQDs與FP的不同體積比對體系的影響。按“1.3”實驗方法固定FP的加入量為1.67×10-6mol/L,改變CQDs的加入量，測定二者不同配比時相應的熒光強度IF。由圖4可知，隨著CQDs濃度的增大，更多的給體將能量轉移給FP，使FP熒光強度逐漸增強。而圖5表明，當固定供體CQDs濃度不變時，隨FP濃度的增大，CQDs的熒光逐漸猝滅，F(xiàn)P的熒光增強，從而進一步說明CQDs-FP之間發(fā)生了有效的能量轉移。由圖5可知，當體系中CQDs 與FP的濃度分別為4.64×10-5mol/L和1.67×10-6mol/L 時，混合體系中給體的熒光峰猝滅最大，而受體的熒光峰升高最多，即此時獲得最佳的能量轉移效率。

2.3 相關參數(shù)的計算

根據(jù)能量轉移F?rster理論，能量轉移效率E、能量轉移臨界距離R0、給體與受體之間的能量轉移距離r滿足如下關系：

(1)

E=1-F/F0

(2)

(3)

(4)

圖6 Cu2+對CQDs-FP間能量轉移的影響

圖7 不同介質對體系熒光猝滅的影響

F(λ)為波長λ處熒光給體的熒光強度，ε(λ)為波長λ處受體的摩爾吸光系數(shù)，F(xiàn)為加入能量受體后給體的熒光強度；F0為未加入受體時給體的熒光強度；k2為偶極空間取向因子，能量給體和受體的空間分布可認為是隨機且均等的，因此取k2=2/3；N為水和有機溶劑的平均折射率(取1.37)；J為給體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜之間的光譜重疊積分。通過以上公式計算得到E=0.76，J=5.12×10-12cm3·L·mol-1，R0=9.02 nm，r=7.44 nm，結果表明R0和r均小于10 nm，說明CQDs和FP之間能夠發(fā)生熒光共振能量轉移。

2.4 Cu2+對體系的熒光猝滅作用

按照實驗方法考察了Cu2+對CQDs-FP能量轉移體系的影響。如圖6所示，隨著Cu2+的加入，體系的熒光強度不斷被猝滅。在一定范圍內，體系的熒光猝滅程度與Cu2+用量呈良好的線性關系?；诖?，建立了測定Cu2+的新方法。

2.5 實驗條件的優(yōu)化

在不同酸度中，CQDs具有不同的形態(tài)，因此酸度對其熒光性質有較大影響。實驗考察了不同酸度對CQDs-FP-Cu2+體系的影響，結果表明在pH 6.8～9.0范圍內，Cu2+對體系的熒光猝滅均有影響，而在pH 8.4時體系的熒光猝滅達到最大，因此實驗選擇pH 8.4作為最佳酸度。并且分別考察了巴比妥鈉-HCl，Tris-HCl，硼酸-硼砂緩沖溶液以及pH 8.4的水溶液(用NaOH調節(jié)pH值)所構建體系的熒光猝滅情況，結果如圖7所示。由圖7可知在pH 8.4的水溶液中，體系的熒光猝滅達到最大，故選擇用pH 8.4的水溶液定容。

此外還對反應時間、溫度等條件的影響進行考察。結果表明，在pH 8.4的水溶液中，體系在30 ℃下反應6 min可達穩(wěn)定，并且可穩(wěn)定1 h左右。

2.6 工作曲線

在最佳條件下，考察了不同濃度Cu2+對體系熒光猝滅強度的影響。結果表明，Cu2+濃度在9.42～23.55 μmol/L范圍內與體系熒光猝滅程度呈良好的線性關系：y=0.108 2x-0.581 8(其中y為lg(F0/F)；x為Cu2+的濃度，mol/L)，相關系數(shù)(r)為0.993 1。根據(jù)IUPAC規(guī)定，檢出限(DL)用3σ/k計算(其中σ為測定11次空白溶液的標準偏差，k為工作曲線的斜率)，測得方法的DL為3.14 μmol/L。

2.7 干擾實驗

當Cu2+濃度為11 μmol/L時，在最優(yōu)實驗條件下考察了部分共存物質對實驗體系的影響，結果如表1所示。當控制相對誤差在±5%以內時，水中常見金屬離子和陰離子對體系基本無影響，說明體系對Cu2+具有較高的選擇性。

表1 共存離子對熒光強度的影響

2.8 實際樣品的測定

為考察本方法測定水體中Cu2+的可行性和實用性，采集桂林市茶江村中茶江河水、村中農田溝渠水，以及實驗中的自來水3種水樣。參考文獻[19]，進行水樣簡單處理：采集樣品在塑料瓶中靜置3 d，取上層清液，用長頸漏斗、慢速濾紙過濾，使用50 mL錐形瓶接液。按實驗方法進行樣品測定，并進行加標回收實驗，結果如表2所示。Cu2+的回收率為98.7%～99.0%,RSD不大于0.91%，說明方法具有良好的精密度和準確度。

表2 樣品分析結果

3 結 論

本文利用CQDs-FP間的能量轉移構建了熒光共振能量體系，探究該體系的影響因素以提高熒光能量轉移的效率，并且基于Cu2+能夠使CQDs-FP體系的熒光發(fā)生猝滅，通過優(yōu)化實驗條件，成功建立了測定痕量Cu2+的新方法。Cu2+的線性范圍為9.42～23.55 μmol/L，檢出限為3.14 μmol/L，回收率為98.7%～99.0%。該方法操作簡單、選擇性好、靈敏度高、線性范圍寬，應用于水體樣品中Cu2+的測定，結果令人滿意。

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Study on Fluorescence Resonance Energy Transfer of Carbon Dots-Fluorescent Pink System and Its Application in Detection of Trace Copper(Ⅱ)

TAO Hui-lin*，SUN Chao，LIAO Xiu-fen，XU Ming-ze，WANG Hai-yang，YI Zhong-sheng，QIN Hong-wei

(College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China)

A new fluorescence method for the determination of trace Cu2+was developed by using fluorescence resonance energy transfer between carbon quantum dots and fluorescent pink，in which carbon dots acted as an energy donor and FP as an acceptor.It was found that under the conditions ofλex=581 nm and pH=8.4 aqueous solution，energy transfered from carbon dots to FP and led to enhance the fluorescence of FP.However,the addition of trace Cu2+made FP fluorescence quenching.The quenching degree was quantitatively in proportion to the trace Cu2+content.Therefore，a novel fluorescence quenching platform for determination of trace Cu2+was constructed.Under the optimum conditions，the calibration curve for Cu2+concentration was linear in the range of 9.42-23.55 μmol/L with a detection limit(3σ/k) of 3.14 μmol/L.The method was applied in the determination of trace Cu2+in river，farmland water and tap water，with spiked recoveries of 98.7%-99.0% and relative standard deviations(RSD) not more than 0.91%.

carbon dots；fluorescent pink；fluorescence resonance energy transfer；trace Cu2+

2014-09-23；

2014-11-20

國家自然科學基金項目(21267008)；廣西自然科學基金項目(2013GXNSFAA019034)

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.009

O657.3；O614.121

A

1004-4957(2015)02-0177-06

*通訊作者：陶慧林，副教授，研究方向：光譜分析，Tel：0773-5898551，E-mail：thl@glut.edu.cn