東洲島絲瓜田根結(jié)線蟲病害的調(diào)查與研究

李玉中，王 麗，陳曉華，滕 濤，周東升，劉 最，王 彤

（1.衡陽師范學(xué)院 生命科學(xué)系 湖南 衡陽 421008；2.蒸湘區(qū)西站路小學(xué) 科學(xué)教研組 湖南 衡陽 421001）

植物寄生線蟲是一類重要的植物病原物，每年給全球農(nóng)業(yè)造成約1570億美元的經(jīng)濟(jì)損失［1］。常見根結(jié)線蟲有四個種類即南方根結(jié)線蟲（M.incognita）、北方根結(jié)線蟲（M.hapla）、爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）和花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，根結(jié)線蟲的寄主植物多達(dá)3000多種，包括經(jīng)濟(jì)、糧食、果樹、蔬菜、花卉等作物，其中危害最為嚴(yán)重的是茄科、葫蘆科和十字花科等植物［2－3］。發(fā)病田的寄主常年減產(chǎn)15%～20%，嚴(yán)重時達(dá)到70%以上［4］。2011—2013年，在衡陽地區(qū)果蔬病害的調(diào)查過程中，發(fā)現(xiàn)東洲島絲瓜上根結(jié)線蟲病害發(fā)生嚴(yán)重，縮短了絲瓜的掛果期，降低了絲瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。本文對引起該病的病原進(jìn)行了鑒定，對發(fā)病土壤和病根的優(yōu)勢真菌進(jìn)行了分離鑒定，并測定了其對致病線蟲卵孵化的影響。分析了發(fā)病嚴(yán)重的原因，為今后東洲島根結(jié)線蟲病的防治提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣

感染根結(jié)線蟲病害的東洲島絲瓜根及其根際土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基及配制

玉米粉瓊脂培養(yǎng)基：稱取20g玉米粉，加入1000mL蒸餾水，微火煮沸30min后，經(jīng)過4層紗布過濾，加瓊脂粉17g后融化補(bǔ)足水量至1000mL。

馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基：稱取葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸氫鉀1g、氯化鎂0.5g依次加入700mL的蒸餾水中加熱待融化后加入16g瓊脂粉補(bǔ)足水至1000mL。

馬丁氏液體培養(yǎng)基：稱取葡萄糖5g加入400mL自來水中，之后依次加入蛋白胨0.25g，磷酸二氫鉀0.5g，氯化鎂0.25g定容至500mL。

以上培養(yǎng)基配制好后分裝三角瓶，121℃滅菌20min，取出待用。

雙抗玉米粉瓊脂培養(yǎng)基：在倒平板前，每100mL培養(yǎng)基中加0.02g青霉素和0.02g硫酸鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1 田間病害調(diào)查及樣品采集

每年絲瓜收獲末期，在東洲島大面積種植絲瓜的地塊進(jìn)行5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)取10株，共調(diào)查50株。將調(diào)查株連根拔起，根據(jù)馮志新的根結(jié)9級記載標(biāo)準(zhǔn)［5－6］，記錄根結(jié)發(fā)生情況。利用下面公式計(jì)算根結(jié)指數(shù)和發(fā)病率，并拍攝田間發(fā)病癥狀。

采集發(fā)病嚴(yán)重的絲瓜根及其根際土樣，分裝于自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室放于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 病原線蟲的分離和鑒定

將病根用自來水沖洗表面附著的土壤或雜質(zhì)，置于培養(yǎng)皿中，加少許清水，在體式顯微鏡下，用挑針挑取病原線蟲雌蟲放于滴有1小滴1%肥皂的載玻片上，在體式顯微鏡下，用解剖刀去掉雌蟲頭部，適當(dāng)擠壓去掉雌蟲體內(nèi)的組織，切除尾部多余的部分，使得留下略大于會陰花紋大小的一層角質(zhì)膜，使切口向下，蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下用40倍鏡進(jìn)行觀察。根據(jù)會陰花紋的形態(tài)特征鑒定根結(jié)線蟲的種類。

1.2.3 發(fā)病田優(yōu)勢真菌的分離和鑒定

將田間采集的病根，自來水沖洗，在體式顯微鏡下挑取顏色較深的卵塊和成蟲。將挑取到的卵塊用1%NaClO消毒3min，并用力振蕩使卵粒分散，再經(jīng)滅菌水沖洗3次，獲得表面消毒卵粒。將表面消毒的卵粒、直接挑到的成蟲和顏色較深的卵囊分別接入雙抗玉米粉瓊脂培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)3—5d，待在其周圍長出菌絲，從菌落邊緣挑取少量菌絲至馬丁氏培養(yǎng)基純化保存。

土壤中真菌的分離參考李玉中等人［7］的方法，將從線蟲體和土壤分離到的真菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，根據(jù)菌落特征、菌絲形態(tài)、分生孢子形態(tài)及其大小等進(jìn)行鑒定。

1.2.4 優(yōu)勢真菌對根結(jié)線蟲卵的寄生性測定

卵的獲取方法：取田間病根在顯微鏡下挑取卵囊完好的卵塊，消毒方法同1.2.3，經(jīng)表面消毒卵粒用無菌水洗3次，再滴加無菌水配制成2000個／m L卵懸浮液。

卵致病性測定參考劉國坤等［9］人的方法，并做適當(dāng)修改。具體做法：優(yōu)勢真菌分離物在馬丁氏培養(yǎng)基平板上25℃ 暗培養(yǎng)7d后 ，無菌水漂洗菌落表面，配制孢子懸浮液 （106個／m L）。在直徑9 cm培養(yǎng)皿中加人 WA 10mL制平板，其上分散滴加3滴（每滴10μL）鐮刀菌孢子懸浮液，封口保濕，25℃暗培養(yǎng)；待產(chǎn)生小菌落后，在菌落邊緣滴加10 μL卵懸浮液（每皿加3次），重新封口保濕，25℃暗培養(yǎng)7d后，在倒置顯微鏡下觀察卵的寄生情況，并計(jì)算寄生率。

1.2.5 優(yōu)勢真菌發(fā)酵液對根結(jié)線蟲卵孵化的影響

取2mL優(yōu)勢菌株106個／mL的孢子懸液分別加入馬丁氏液體培養(yǎng)液中，25℃120r／min培養(yǎng)7d，濾除菌絲，取慮液向直徑6cm的培養(yǎng)皿中加入5 ml，再添加30～40個表面消毒的卵粒，封口膜封口，置于25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)72h，觀察蟲卵孵化狀況，并計(jì)算蟲卵孵化率。處理設(shè)3個重復(fù)，以無菌水為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病情況

東洲島絲瓜田中發(fā)病嚴(yán)重的絲瓜根，其上根結(jié)幾乎遍布整個根系（圖1A）。根結(jié)線蟲侵染致死的絲瓜根腐爛，且其上長出大量的白色菌絲（圖1B）。用帶根結(jié)的絲瓜根際土壤種植芹菜，可以引起芹菜的嚴(yán)重發(fā)病（圖1C）。

圖1 根結(jié)線蟲危害癥狀

連續(xù)3年的田間調(diào)查表明：東洲島絲瓜根結(jié)線蟲病的發(fā)病率連年上升，2013年根結(jié)發(fā)病率達(dá)46%，且病情嚴(yán)重，根結(jié)指數(shù)達(dá)45，感病植株的生長周期明顯縮短，嚴(yán)重影響了絲瓜的產(chǎn)量。

表1 2011—2013年東洲島絲瓜田根結(jié)發(fā)病情況

2.2 雌蟲會陰花紋特征

從絲瓜根結(jié)中分離的雌成蟲透明或呈乳白色，淡黃色，梨形。經(jīng)會陰花紋觀察發(fā)現(xiàn)，該蟲會陰花紋背弓高聳，似方形，非常明顯，背弓由平緩形到波浪形的線紋組成，有些線紋無明顯的測線，在線紋的側(cè)面分叉。其特征與王曉瑋［10］描述的南方根結(jié)線蟲會陰花紋特征相似，鑒定此病原為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne.Incognita）。

2.3 優(yōu)勢菌株的分離鑒定

從直接挑取到的成蟲和顏色較深的卵囊分離出的真菌和土壤分離出的優(yōu)勢真菌從形態(tài)判斷為同一種。該菌在馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)3d，菌落呈白色，菌絲呈密集絲狀體，菌絲為無色且有隔。其分生孢子梗直立，圓形，表面光滑或有凸起，孢子大多著生于頂端。分生孢子呈卵形、橢圓形或鐮刀形，根據(jù)形態(tài)初步判斷該菌為鐮刀菌（Fusarium sp.）（見圖2）。

圖2 鐮刀菌的分生孢子形態(tài)

2.4 優(yōu)勢真菌對根結(jié)線蟲卵的寄生能力

接種南方根結(jié)線蟲卵7d后，鐮刀菌對卵沒有明顯的寄生現(xiàn)象。有的卵菌絲蔓延于卵殼表面但沒有菌絲穿透卵殼，不影響二齡幼蟲的孵化。

2.5 優(yōu)勢真菌發(fā)酵液對根結(jié)線蟲卵孵化的影響

鐮刀菌的發(fā)酵濾液中根結(jié)線蟲卵的平均孵化率為23.9%，而對照實(shí)驗(yàn)組無菌水中卵的平均孵率為10.09%。鐮刀菌的發(fā)酵濾液對根結(jié)線蟲卵的孵化有一定的促進(jìn)作用。（見表2）

3 結(jié)論與討論

（1）本文根據(jù)雌蟲會陰花紋的形態(tài)特征，將衡陽市東洲島絲瓜根結(jié)病原鑒定為南方根結(jié)線蟲。成飛雪等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在湖南省侵染蔬菜的根結(jié)線蟲種類中，南方根結(jié)線蟲最具普遍性，為優(yōu)勢病原種群，占87%。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，說明南方根結(jié)線蟲在湖南省發(fā)生普遍。

（2）劉國坤等人［9］的研究表明：不同的鐮刀菌對卵的寄生能力不同，有的菌株對胚胎期卵的寄生率高達(dá)90%，有的分離物對卵無寄生能力。段玉璽等人［12］的研究也證實(shí)不同的鐮刀菌菌株對南方根結(jié)線蟲卵的孵化抑制效果不同。本實(shí)驗(yàn)從雌蟲體、卵塊和土壤中分離到的優(yōu)勢真菌為同一鐮刀菌，該菌對根結(jié)線蟲卵無寄生能力，其發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲線蟲卵的孵化有一定的促進(jìn)作用；在根結(jié)侵染腐爛的絲瓜根中生長繁茂，對絲瓜根組織腐爛具有一定促進(jìn)作用，進(jìn)而促使線蟲進(jìn)入土壤，造成根結(jié)線蟲的再次侵染，增加了病害的嚴(yán)重度。這可能是導(dǎo)致東洲島絲瓜田根結(jié)線蟲病發(fā)生嚴(yán)重的原因之一。

（3）莫明和和牟貴平［13］、張克勤［14］等人從全國不同地區(qū)采集的土壤及植物根結(jié)，分離到多種的根結(jié)線蟲的天敵真菌，這些真菌對根結(jié)線蟲的生長和繁殖有重要的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)在土壤、蟲體及卵塊和卵上沒有分離到根結(jié)線蟲的天敵菌，這可能與東洲島特殊的地理環(huán)境所致。這可能是導(dǎo)致東洲島絲瓜田根結(jié)線蟲病發(fā)生嚴(yán)重的另原因之一。

（4）從連續(xù)三年的調(diào)查顯示，該田塊根結(jié)病害發(fā)生逐年呈上升趨勢，又鑒于南方根結(jié)線蟲侵染寄主廣泛，且土壤中缺乏自然天敵。建議防治策略：一、實(shí)行輪作，改種根結(jié)線蟲危害小的蔬菜或作物，如空心菜，小白菜等；二，使用藥劑處理土壤如阿維菌素，即可降低蟲口密度又可減少鐮刀菌的數(shù)量。

［1］Pierre Abad，Je′ro？me Gouzy，Jean－Marc Aury，et al.Genome sequence of the metazoan plant－parasitic nematode Meloidogyne incognita［J］.Nature Biotechnology，2008，26（8）：909－915.

［2］劉維志.病原植物線蟲學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［3］Trudgill D L，Blok V C.Apomictic，polyphagous rootknot nematodes：exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens［J］.Annual Review Phytopathology，2001，39，53－77.

［4］趙鴻，彭德良，朱建蘭.根結(jié)線蟲的研究現(xiàn)狀［J］.植物保護(hù)，2003，29（6）：6－9.

［5］馮志新.植物線蟲學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001，205.

［6］李玉中，向紅瓊.平菇菌絲對根結(jié)線蟲及番茄生長的影響［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，17（5）：127－129.

［7］李玉中，李本祥，王彬，等.寄生線蟲真菌黑葡萄穗霉的分離與鑒定［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（16）：59－61.

［8］Nitao J K，Meyers L F，Chitwood D J.In vitro assays of Meloidogyne incognita and Heterodera glyciness for detection of nematode－antagonistic fungal compounds［J］.Journal of Nematology，1999，31（2）：172－183.

［9］劉國坤，削頃，洪彩鳳，等.鐮刀菌對南方根結(jié)線蟲卵的寄生特性［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2006，35（5）：459－462.

［10］王曉瑋.設(shè)施栽培中蔬菜根結(jié)線蟲鑒定及蔬菜種質(zhì)資源抗病性［D］.杭州：浙江大學(xué)，2013，11（3）：45－69.

［11］成飛雪，張德詠，何明遠(yuǎn)，等.湖南省蔬菜根結(jié)線蟲發(fā)生及種類鑒定［J］.植物保護(hù)，2010，36（5）：128－132.

［12］段玉璽，曲澤嵐，王媛媛，等.南方根結(jié)線蟲生防鐮刀菌菌株篩選［J］.農(nóng)藥，2010（8）：607－609，620.

［13］莫明和，牟貴平.利用食線蟲真菌防治植物寄生線蟲的研究進(jìn)展［J］.大理學(xué)院學(xué)報，2009，8（12）：71－74.

［14］張克勤.捕食線蟲真菌研究［D］.貴陽：貴州農(nóng)學(xué)院，1989，13：11－13.